超聲-微波協(xié)同提取蟬花蟲草腺苷條件優(yōu)化及不同產(chǎn)地腺苷測(cè)定

張紅芳,吳次虎,楊東瑤,左 瑞,黃文華,陳 曄

(九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西九江 332000)

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超聲-微波協(xié)同提取蟬花蟲草腺苷條件優(yōu)化及不同產(chǎn)地腺苷測(cè)定

張紅芳,吳次虎,楊東瑤,左 瑞,黃文華,陳 曄*

(九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,江西九江 332000)

以野生蟬花蟲草子實(shí)體為材料,采用超聲-微波協(xié)同法提取蟬花蟲草腺苷并對(duì)其提取條件進(jìn)行優(yōu)化,經(jīng)單因素及正交實(shí)驗(yàn),確定優(yōu)化的提取條件:微波功率150 W、超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間120 s、料液比為1∶30、甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%,蟬花蟲草腺苷提取率為(0.53±0.02) mg/g;并利用高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地蟬花蟲草菌絲體腺苷含量,結(jié)果表明:測(cè)得4個(gè)產(chǎn)地的蟬花蟲草菌絲體腺苷含量為0.14～0.40 mg/g,其中井岡山分離獲得JJS0017菌株的菌絲體腺苷含量最高(0.40 mg/g),其次為九江市蓮花鎮(zhèn)蓮花林場分離獲得JJS0007菌株,江西省鄱陽縣饒埠鎮(zhèn)分離獲得JJS0032菌株的菌絲體腺苷最低(0.14 mg/g)。本文可為蟬花蟲草的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

蟬花蟲草,超聲-微波協(xié)同提取,高效液相色譜法,腺苷

蟬花蟲草(Isariacicadae)是蟬擬青霉寄生山蟬(Cicadaflammatus)、竹蟬(Platylomiapieli)若蟲后的復(fù)合體[1-3],是我國傳統(tǒng)中藥材之一[4-5]。經(jīng)研究分析,蟬花的化學(xué)成分復(fù)雜,蟬花含有腺苷、多種必需氨基酸、甘露醇、多種生物堿及麥角甾醇等成分[6-12];藥理作用較廣泛,能增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、改善腎功能、抑菌、抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗疲勞、抗應(yīng)激、抗氧化、抗驚厥等功效[13-17]。可見蟬花具有冬蟲夏草相似的組分和功效,尤其蟬花所含蟲草酸及腺苷的量均高于冬蟲夏草[8],近年來,有的學(xué)者在臨床上用蟬花作為冬蟲夏草的代用品并取得較好的效果。

腺苷是評(píng)價(jià)蟲草內(nèi)在質(zhì)量的主要指標(biāo)。腺苷具有舒張血管,降低血壓,改善心腦血液循環(huán),抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和調(diào)節(jié)腺苷酸活化酶活性等多種功能活性[18]。目前,關(guān)于蟬花蟲草腺苷的提取主要采用熱水浸提、超聲波提取、室溫?cái)嚢杼崛〉确椒?研究表明這些提取方法對(duì)蟲草腺苷類物質(zhì)的提取效果差異極顯著,尤其超聲波提取蟲草腺苷類物質(zhì)的提取效果最好,超聲波提取技術(shù)和微波萃取技術(shù)均可大大簡化操作、縮短提取時(shí)間、增加得率,在食品、天然產(chǎn)物和環(huán)境等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[19-22]。近年來,超聲-微波協(xié)同提取技術(shù)以其高效性、強(qiáng)選擇性以及操作簡便、副產(chǎn)物少、產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn),被應(yīng)用于天然活性成分的提取,而有關(guān)超聲-微波協(xié)同提取蟬花蟲草腺苷鮮見報(bào)道。本研究以天然蟬花為材料,甲醇為溶劑,以蟬花蟲草腺苷提取率為考核指標(biāo),采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察超聲-微波提取時(shí)間、微波功率、料液比等因素對(duì)蟬花蟲草腺苷提取率的影響,旨在篩選出蟬花蟲草腺苷的超聲-微波協(xié)同提取最佳工藝;同時(shí),采用高效液相色譜法測(cè)定不同產(chǎn)地蟬花蟲草菌絲體中腺苷的含量,旨在篩選出產(chǎn)蟬花蟲草腺苷含量高的菌株,為蟬花蟲草的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生蟬花蟲草干燥子實(shí)體 采自九江市濂溪區(qū)蓮花鎮(zhèn)蓮花林場,經(jīng)九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院真菌研究室陳曄教授鑒定為蟬花蟲草(Isariacicadae);蟬花蟲草菌株編號(hào)JJS0017 江西省井岡山市大井分離獲得;蟬花蟲草菌株JJS0032 江西省鄱陽縣饒埠鎮(zhèn)分離獲得;蟬花蟲草菌株JJS0007 九江市濂溪區(qū)蓮花鎮(zhèn)蓮花林場分離獲得;蟬花蟲草菌株JJS0010 江西省武寧縣羅溪鄉(xiāng)朱山林場分離獲得;甲醇、乙腈 為色譜純,MERCK公司;腺苷 上海東風(fēng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn),純度≥98%;其它試劑 均為分析純;培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基;實(shí)驗(yàn)用水 超純水。

UItiMate 3000RSLC超高效液相色譜儀 Thermo Fisher公司;CW-2000 超聲波微波協(xié)同提取儀 上海新拓分析儀器科技有限公司;Sartorius BS124S萬分電子分析天平 德國賽多利斯公司。

1.2 蟬花蟲草腺苷的測(cè)定

1.2.1 蟬花蟲草腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取腺苷標(biāo)品0.0125 g,用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中,配成1.25 mg/mL儲(chǔ)備液。再取1 mL置于100 mL容量瓶中,加入甲醇稀釋至刻度,搖勻,制得標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,備用[18-19]。

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,加入甲醇稀釋至刻度,每個(gè)濃度進(jìn)樣兩次,各進(jìn)5 μL,取平均峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制校準(zhǔn)曲線,得線性回歸方程為y=0.0386X+0.0527(R2=0.9967)。

1.2.2 蟬花蟲草腺苷的測(cè)定 將提取物置于20 ℃,5000 r/min的離心機(jī)中離心10 min,得提取液,用20%的甲醇定容。用0.45 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾后供分析。每種樣品重復(fù)3次。

色譜柱為Kromasil C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈∶水=5∶95,流速為1.0 mL/min,檢測(cè)波長為260 nm,柱溫為室溫,進(jìn)樣量為5 μL[18-21]。按照以上條件進(jìn)行蟬花蟲草腺苷測(cè)定,并計(jì)算腺苷提取率,腺苷提取率(mg/g)=提取得到腺苷質(zhì)量/蟬花蟲草子實(shí)體(或菌絲體)質(zhì)量。

1.3 超聲波-微波協(xié)同提取蟬花蟲草腺苷工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將野生蟬花蟲草子實(shí)體置于40 ℃烘干箱中烘干至質(zhì)量恒定,經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過100目篩,精確稱取干粉1.0 g,在開啟超聲波(50 W/40 kHz)的條件下,固定超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間150 s,料液比1∶30,甲醇體積分?jǐn)?shù)20%,考察微波功率50、100、150、200、250、300 W對(duì)蟬花蟲草腺苷提取率的影響。

固定微波功率120 W,料液比1∶30,甲醇體積分?jǐn)?shù)20%,考察不同超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間90、120、150、180、210、240 s對(duì)蟬花蟲草腺苷提取率的影響。

固定微波功率120 W,甲醇體積分?jǐn)?shù)20%,超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間為150 s,考察不同料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g∶mL)對(duì)蟬花蟲草腺苷提取率的影響。

固定微波功率120 W,料液比1∶30,超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間150 s,考察不同甲醇體積分?jǐn)?shù)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%對(duì)蟬花蟲草腺苷提取率的影響。

1.3.2 正交實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察甲醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間和料液比之間的相互影響,并確定超聲波-微波協(xié)同提取蟬花蟲草中腺苷的最佳工藝參數(shù)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取對(duì)照品溶液5 μL,按液相色譜條件進(jìn)樣5次,記錄峰面積并計(jì)算RSD值。

1.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱量JJS0007樣品5份,各1 g。按供試品溶液處理方法處理,按“1.2.2”液相色譜條件,將樣品溶液分別進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算RSD值。

1.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確吸取供試液5 μL,按“1.2.2”色譜條件,在室溫條件下,每隔2～4 h進(jìn)行一次腺苷含量的測(cè)定,記錄數(shù)據(jù)。記錄24 h內(nèi)峰面積的變化并計(jì)算RSD值。

1.4.4 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 精確稱量JJS0007處理后的樣品,分別加入不同量的對(duì)照品(平行做5份),按樣品處理方法,并按“1.2.2”色譜條件,測(cè)定含量,并計(jì)算加標(biāo)回收率。

1.5 不同產(chǎn)地蟬花蟲草菌絲體腺苷測(cè)定

1.5.1 蟬花蟲草菌株樣品制備 菌株活化培養(yǎng):將蟬花蟲草菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基,于25 ℃培養(yǎng)6 d。液體發(fā)酵培養(yǎng):在250 mL三角瓶中裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,接種蟬花菌種后,置于25 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)5～6 d,得種子液。擴(kuò)大培養(yǎng):在500 mL三角瓶中裝入200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,并將培養(yǎng)好的種子液按5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)5～7 d。

將振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)好的蟬花蟲草菌株取出,進(jìn)行真空抽濾,棄濾液,將菌絲體轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿里(全過程在無菌條件進(jìn)行),進(jìn)行冷凍干燥,干燥后研磨成粉,過100目篩,做好標(biāo)記,備用[8]。

1.5.2 蟬花蟲草菌絲體腺苷提取及測(cè)定 按照1.2節(jié)方法進(jìn)行蟬花蟲草菌絲體腺苷的提取和測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 微波功率對(duì)蟬花蟲草菌絲體腺苷提取率的影響 由圖1可知,隨著微波功率的增加,物質(zhì)的加熱程度隨之增加,蟬花蟲草腺苷也能夠較容易地被提取出來,腺苷的提取率增加;在微波功率達(dá)到150 W之后,隨微波功率升高,所測(cè)腺苷的提取率呈下降趨勢(shì),這可能是由于高微波功率形成較高的熱效應(yīng),使腺苷分子內(nèi)或分子間的羥基易形成氫鍵,從而導(dǎo)致腺苷分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[23],選擇微波功率為150 W。

圖1 微波功率對(duì)蟬花蟲草腺苷提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the yield of adenosine from Isaria cicadae

2.1.2 超聲波-微波協(xié)同提取時(shí)間對(duì)蟬花蟲草腺苷提取率的影響 由圖2可知,在超聲波-微波協(xié)同提取時(shí)間為150 s之前,蟬花蟲草菌絲體腺苷不能充分的轉(zhuǎn)移到溶液中,隨著提取時(shí)間的增加,腺苷提取率增加；在150 s時(shí)達(dá)到峰值之后,繼續(xù)增加時(shí)間,蟬花蟲草腺苷提取率明顯下降,腺苷的熱穩(wěn)定性差,溫度過高會(huì)分解。這可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加,溫度急劇升高,導(dǎo)致腺苷結(jié)構(gòu)發(fā)生改變所致[23],選擇提取時(shí)間為150 s。

圖2 提取時(shí)間對(duì)蟬花蟲草腺苷提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of adenosine from Isaria cicadae

2.1.3 料液比對(duì)蟬花蟲草菌絲體腺苷影響 由圖3可知,提取劑的增加,有利于蟬花蟲草菌絲體中腺苷的溶出,這是因?yàn)槿軇┖驮祥g的濃度差越大,其提取效率就越高,然而在液料比增加到1∶30之后,蟬花蟲草中腺苷提取效率變化不大,表明提取基本完全,為節(jié)省后續(xù)處理時(shí)間,選擇液料比為1∶30。

圖3 料液比對(duì)蟬花蟲草腺苷提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of adenosine from Isaria cicadae

2.1.4 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蟬花蟲草菌絲體腺苷影響 由圖4可知,甲醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí),所測(cè)蟬花蟲草腺苷的提取率較大。當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí),測(cè)得蟬花蟲草腺苷提取率最大,隨著提取液中甲醇體積分?jǐn)?shù)的增大,蟬花蟲草中的腺苷提取效率明顯降低,可能與腺苷具有較強(qiáng)的水溶性有關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明:低甲醇體積分?jǐn)?shù)更利于蟬花蟲草腺苷的提取,高甲醇體積分?jǐn)?shù)不利于蟬花腺苷的提取,選擇甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%。

圖4 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)蟬花蟲草菌絲體腺苷影響Fig.4 Effect of methanol volume fraction on the yield of adenosine from Isaria cicadae

2.2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2中R值可知,影響腺苷提取率的主次因素為D>A>B>C,即甲醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)腺苷提取率的影響最大,微波功率、提取時(shí)間次之,料液比影響最小。考察A、B、C、D因素在3個(gè)水平上的變化,綜合各因素k值和直觀比較,得出理論上最佳提取產(chǎn)率的工藝條件為A2B1C1D2,即微波功率150 W、協(xié)同提取時(shí)間120 s、料液比為1∶30、甲醇體積分?jǐn)?shù)為20%。

為了考察最優(yōu)條件的再現(xiàn)性,則需進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),所測(cè)蟬花蟲草腺苷提取率為053、0.50、0.54 mg/g,平均值為(0.53± 0.02) mg/g,結(jié)果表明,在上述工藝條件下蟬花蟲草腺苷的提取率相對(duì)比較穩(wěn)定,達(dá)到了優(yōu)化目的。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Results of L9(34)orthogonal tests

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn) 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:按液相色譜條件,進(jìn)樣5次,記錄峰面積,腺苷峰面積的RSD為0.54%(n=5),表明方法精密度良好。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 3 Recovery rates of adenosine and cordycepin in spiked samples(n=5)

2.3.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱量JJS0007樣品5份,各1 g,按供試品溶液處理方法處理,按“1.2.2”液相色譜條件,將樣品溶液分別進(jìn)行測(cè)定,峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.27%(n=5),表明采用本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)蟬花蟲草腺苷定量分析時(shí)重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 采用優(yōu)化后的提取方法對(duì)JJS0007樣品進(jìn)行前處理,分別在室溫條件下放置不同時(shí)間(0、4、8、12、16、20、24 h)測(cè)定。結(jié)果表明:在24 h內(nèi),采用本實(shí)驗(yàn)提取條件提取的溶液,其腺苷保持相對(duì)穩(wěn)定,腺苷5次實(shí)驗(yàn)的平均RSD值為2.11%(n=5)。

2.3.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取JJS0007樣品適量,分別加入不同量的對(duì)照品(平行做5份),按樣品處理方法,按“1.2.2”液相色譜條件測(cè)定含量,計(jì)算加標(biāo)回收率,結(jié)果見表3。由表3可知,腺苷回收率為97.61%～98.36%,平均回收率為97.86%,RSD為0.23%。

2.4 不同產(chǎn)地蟬花蟲草菌絲體腺苷測(cè)定

以色譜峰保留時(shí)間為參數(shù),對(duì)4個(gè)不同產(chǎn)地蟬花蟲草菌絲體進(jìn)行色譜測(cè)定,將各產(chǎn)地蟬花蟲草菌絲體腺苷色譜圖與腺苷對(duì)照品色譜圖進(jìn)行比較,見圖5、圖6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:4個(gè)產(chǎn)地蟬花蟲草的腺苷含量為0.14～0.40 mg/g,其中井岡山大井分離獲得JJS0017菌株的菌絲體腺苷含量最高,為0.40 mg/g,其次為九江市濂溪區(qū)蓮花鎮(zhèn)蓮花林場分離獲得JJS0007菌株,江西省鄱陽縣饒埠鎮(zhèn)分離獲得JJS0032菌株的菌絲體腺苷含量最低,為0.14 mg/g。

圖6 不同產(chǎn)地蟬花蟲草菌絲體腺苷提取率(mg/g)HPLC色譜圖Fig.6 The yield of adenosine from Isaria cicadae in different area

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲-微波協(xié)同法對(duì)蟬花蟲草菌絲體腺苷及提取條件進(jìn)行優(yōu)化,最優(yōu)化的提取條件為微波功率150 W、超聲-微波協(xié)同提取時(shí)間120 s、料液比為1∶30、甲醇體積分?jǐn)?shù)為 20%,蟬花蟲草腺苷提取率為(0.52± 0.02) mg/g。利用高效液相色譜法測(cè)定4個(gè)產(chǎn)地蟬花蟲草菌絲體腺苷含量為0.14～0.40 mg/g,其中井岡山分離獲得JJS0017菌株的菌絲體腺苷含量最高,其次為九江市蓮花鎮(zhèn)蓮花林場分離獲得JJS0007菌株,江西省鄱陽縣饒埠鎮(zhèn)分離獲得JJS0032菌株的菌絲體腺苷最低,可見產(chǎn)地不同,蟬花蟲草菌絲體的腺苷含量不同,本文為深層開發(fā)蟬花菌絲體提供重要依據(jù)。

圖5 蟬花蟲草菌絲體樣品和腺苷對(duì)照品的HPLC圖(260 nm)Fig.5 The HPLC chromatogram Isaria cicadae sample and adenosine at 260 nm注:A:JJS0017菌株;B:JJS0007菌株;C:JJS0010菌株;D:JJS0032菌株;E:腺苷對(duì)照品。

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Determination and optimal extracted conditions of adenosine inIsariacicadaemycelium from different areas by ultrasonic-microwave synergistic extraction method

ZHANG Hong-fang,WU Ci-hu,YANG Dong-yao,ZUO Rui,HUANG Wen-hua,CHEN Ye*

(School of Pharmacology and Life Sciences,Jiujiang University,Jiujiang 332000,China)

Taking the fruiting bodies ofIsariacicadaeas materials,ultrasonic-microwave synergistic extraction method was used to extract adenosine inI.cicadaemycelium and the extraction conditions were optimized. According to the single factor and orthogonal experiments,the optimal extraction conditions were 150 W of microwave power,120 s of ultrasonic microwave synergistic extraction time,1∶30 of solid-liquid ratio and 20% of methanol volume fraction. The content of adenosine in mycelium ofI.cicadaedetermined was(0.53± 0.02) mg/g. The adenosine contents in different areas were determined by high performance liquid chromatography. The results showed that the adenosine contents ofI.cicadaeprovided from four areas were ranged from 0.14 to 0.40 mg/g. The content of mycelium adenosine in the strain JJS0017 isolated from Jinggangshan was highest,which was followed by the strain JJS0007 obtained from Lianhua town,Jiujiang city. The lowest content was 0.14 mg/g,which was from the strain JJS0032 from Rao town,Poyang county,Jiangxi province. This article could provide a theoretical basis for the development and utilization ofI.cicadae.

Isariacicadae;ultrasonic microwave synergistic extraction;high performance lquid chromatography;adenosine

2016-11-01

張紅芳(1971-)，女，碩士，講師，研究方向：蟲草資源及成分分析，E-mail:939044612@qq.com。

*通訊作者:陳曄(1966-)，男，碩士，教授，研究方向：真菌多樣性，E-mail:chenyejjtc@126.com。

江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20122BBF60128)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)10-0291-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.047