人母乳源乳酸菌的篩選、鑒定及益生活性的初步研究

高 盛,喬 宇,張宇微,彭 晴,張志勝,*,石 波,李靜梅,吳 穎

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,北京 100081;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京 100081;4.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,北京 100081)

?

人母乳源乳酸菌的篩選、鑒定及益生活性的初步研究

高 盛1,喬 宇2,*,張宇微2,彭 晴2,張志勝1,*,石 波2,李靜梅3,吳 穎4

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所,北京 100081;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所,北京 100081;4.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,北京 100081)

本研究從人母乳中分離乳酸菌。采用透明圈法從產(chǎn)后10～30 d的人母乳樣品中篩選到一株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的乳酸菌。對(duì)篩選菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)及16S rDNA序列鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性,短桿狀,無(wú)芽孢;生理生化特性符合鼠李糖乳桿菌的基本特征;16S rDNA序列及進(jìn)化樹(shù)分析進(jìn)一步確認(rèn)該菌株為鼠李糖乳桿菌,命名為鼠李糖乳桿菌Z5。在pH3.0的條件下模擬人工胃腸液共消化6 h后該菌存活率仍達(dá)90%以上,在0.15 g/L膽鹽質(zhì)量濃度培養(yǎng)6 h,菌株存活率為76.14%;抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),菌株培養(yǎng)液對(duì)沙門(mén)氏菌及大腸桿菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,抑菌圈直徑達(dá)20 mm以上。細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該菌株可有效黏附到Caco-2細(xì)胞表面,對(duì)Caco-2細(xì)胞的平均黏附數(shù)為7.54×105cfu/mL。從人母乳中獲得了這株具有潛在益生性質(zhì)的鼠李糖乳桿菌,為明確母乳中益生菌的功效及開(kāi)發(fā)新型益生菌產(chǎn)品研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)材料。

人母乳,鼠李糖乳桿菌,分離鑒定,益生性質(zhì)

母乳是嬰兒最適宜的天然食物,含有免疫細(xì)胞、低聚糖、免疫球蛋白、抗微生物的羧酸類物質(zhì)、多胺類物質(zhì)、溶菌酶和糖蛋白等,有嬰兒配方奶無(wú)法復(fù)制的特殊結(jié)構(gòu)化合物[1]。早期人們認(rèn)為母乳是無(wú)菌的,母乳中的微生物由于孕婦感染乳腺炎或是皮膚、陰道、腸道及嬰兒口腔微生物污染所致[2]。隨著菌株分離技術(shù)的不斷革新,自2003年Martín R 與其研究團(tuán)隊(duì)采用分離培養(yǎng)的手法研究母乳中的微生物開(kāi)始,迄今在母乳中已分離到200多株細(xì)菌,分屬于放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)[3]。利用選擇性培養(yǎng)基,一些具有益生活性的乳酸菌如嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)和乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等在母乳中被陸續(xù)分離出[4-7]。

嬰兒每天攝取的800 mL母乳中約有5～7 lg cfu的共生菌存在[8],這些細(xì)菌作為先頭兵在胃腸道定植下來(lái),構(gòu)成腸道微生物區(qū)系的組成部分。相比其它來(lái)源的益生菌,源于母乳中的益生菌具有更好的抗逆、抑菌、抗感染和促進(jìn)腸道健康的活性。本研究采用篩選培養(yǎng)基從人母乳中分離乳酸菌,通過(guò)體外模擬胃腸液環(huán)境進(jìn)行耐受性及對(duì)致病菌的抑制實(shí)驗(yàn)和菌株與腸上皮細(xì)胞黏附效果實(shí)驗(yàn),初步評(píng)價(jià)菌株的益生活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

母乳樣品 由北京地區(qū)健康產(chǎn)婦提供;致病性大腸埃希菌(EscherichiacoliCVCC3367)、雞白痢沙門(mén)氏菌(SalmonellapullorumCVCC520) 購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心;Caco-2細(xì)胞 購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心;MRS肉湯培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司;碳酸鈣 分析純,西隴化工股份有限公司;胃蛋白酶(pepsin)、胰蛋白酶(Trypsin) 美國(guó)Sigma公司;牛膽鹽 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;MEM培養(yǎng)基 美國(guó)康寧公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技有限公司。

光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司;醫(yī)用型潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;厭氧培養(yǎng)箱 美國(guó)謝爾頓公司;PCR儀 美國(guó)伯樂(lè)(Bio-Rad)公司;凝膠成像儀 上海復(fù)日科技儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的采集 取樣方法參考Martín[8]的方法并稍做改進(jìn),6份母乳樣品由北京地區(qū)孕足月順產(chǎn)產(chǎn)婦提供,產(chǎn)婦身體狀況良好,無(wú)乳腺炎等疾病,采樣前用無(wú)菌水清洗乳頭及乳暈部分,并棄去前500 μL母乳,無(wú)菌離心管中收集5～10 mL成熟母乳后,滅菌棉簽取乳頭及乳暈部分皮膚樣本做對(duì)照,樣本放入?yún)捬醣辛⒓此椭翆?shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離(3 h內(nèi)),本研究經(jīng)家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2.2 菌株的分離篩選及保存 初篩:取新鮮母乳及皮膚樣本梯度稀釋后采用混菌法[9],傾注于含0.3%碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基上,厭氧培養(yǎng)24～48 h后,挑選光滑、凸圓、白色或乳白色、有較大透明圈特征單菌落,并觀察記錄形狀、大小、色澤、透明度等,劃線接種于MRS固體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h,待分離出單菌落后進(jìn)行革蘭氏染色并于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

復(fù)篩:將體積分?jǐn)?shù)為3%過(guò)氧化氫溶液10 μL滴于上述初篩獲得的固體單菌落上,若無(wú)氣泡,則為過(guò)氧化氫酶陰性[10]。將鑒定為過(guò)氧化氫酶陰性的菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃厭氧連續(xù)培養(yǎng)24～48 h,傳代2～3次,-80 ℃甘油保存?zhèn)溆肹11]。

1.2.3 生理生化實(shí)驗(yàn) 將篩選到的菌株分別進(jìn)行接觸酶反應(yīng)、明膠液化、淀粉水解及各種糖的利用實(shí)驗(yàn),對(duì)菌株進(jìn)行生理生化鑒定[12]。

1.2.4 16S rDNA序列擴(kuò)增與分析 參照文獻(xiàn)[13]方法,將分離得到的菌株在MRS液體培養(yǎng)基37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后,取培養(yǎng)液離心收集菌體(7500×g,10 min,4 ℃),提取基因組DNA,方法參照天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明操作。PCR擴(kuò)增反應(yīng),以提取的菌株Z5的基因組DNA為模板,引物27F:5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′;引物1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應(yīng)體系(25 μL):上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L),基因組DNA 0.5 μL,10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL,dNTP each 2.5 mmol/L 1 μL,DNA聚合酶0.2 μL,加雙蒸水至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min;循環(huán)30次(94 ℃,45 s變性;55 ℃,45 s退火;72 ℃,1 min延伸);72 ℃延伸10 min,PCR產(chǎn)物于4 ℃終止反應(yīng)保存。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),PCR擴(kuò)增片段約為1500 bp,將PCR產(chǎn)物送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。序列通過(guò)BLAST程序與GenBank中的已知細(xì)菌的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析,并建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 菌株體外益生活性的評(píng)價(jià)

1.3.1 菌株酸耐受能力的測(cè)定 調(diào)整菌液濃度為108cfu/mL,分別接種于pH2.5、3.0、6.5的MRS液體培養(yǎng)基中,在37 ℃的條件下恒溫厭氧培養(yǎng)0、3、6 h,每組三個(gè)平行,采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù),計(jì)算存活率。存活率計(jì)算公式:

式中:N0-0 h的活菌數(shù)(lg cfu/mL);N1-酸耐受3、6 h后的活菌數(shù)(lg cfu/mL)。

1.3.2 菌株膽鹽耐受能力的測(cè)定 調(diào)整菌液濃度為108cfu/mL,分別接種于含牛膽鹽0.05%、0.1%、0.15%、0.20%的MRS液體培養(yǎng)基中,在37 ℃厭氧的條件下恒溫培養(yǎng)0、3和6 h,每組三個(gè)平行,采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù),計(jì)算存活率。存活率計(jì)算公式:

式中:N0-0 h的活菌數(shù)(lg cfu/mL);N1-膽鹽耐受3、6 h后的活菌數(shù)(lg cfu/mL)。

1.3.3 菌株耐人工胃、腸液能力的測(cè)定 人工胃腸液配制方法參照Carteris[14]的模擬胃腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體系,在PBS緩沖液中添加3 g/L胃蛋白酶,調(diào)節(jié)pH為3.0,過(guò)濾除菌,制成人工胃液;人工腸液組成:在PBS緩沖體系中分別添加至終濃度為1 g/L胰蛋白酶和0.1%牛膽鹽,調(diào)節(jié)pH為8.0。將菌株調(diào)整菌液濃度后,接種于上述配制的人工胃液0、3 h后采用平板計(jì)數(shù)法,計(jì)算其人工胃液耐受存活率,每組三個(gè)平行。將在pH3.0人工胃液中消化3 h后的1.0 mL供試菌液,轉(zhuǎn)接入9.0 mL人工腸液中[15],繼續(xù)消化0、3 h后采用平板計(jì)數(shù)法,計(jì)算其人工腸液耐受存活率,每組三個(gè)平行。存活率計(jì)算公式:

式中:N0-0 h的活菌數(shù)(lg cfu/mL);N1-模擬人工胃液或腸液3 h后的活菌數(shù)(lg cfu/mL)。

1.3.4 對(duì)致病菌的抑制實(shí)驗(yàn) 將含有指示菌致病性大腸埃希菌、雞白痢沙門(mén)氏菌種子液(109cfu/mL)混入50 ℃左右的LB培養(yǎng)基中,搖勻,傾注于冷卻的瓊脂平皿上,其上垂直放入已滅菌的牛津杯(內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm),在孔中加入200 μL 108cfu/mL鼠李糖乳桿菌發(fā)酵上清液(鼠李糖乳桿菌在37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)18 h后,培養(yǎng)液5000 r/min離心10 min,棄菌體后即為發(fā)酵上清液)及200 μL無(wú)菌MRS液體培養(yǎng)基作對(duì)照,室溫下靜置擴(kuò)展4 h后,37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)24～48 h,觀察測(cè)量抑菌圈直徑,每組三個(gè)平行。

1.3.5 菌株與Caco-2細(xì)胞的黏附作用 從液氮罐中取出Caco-2細(xì)胞,并迅速解凍,培養(yǎng)在7 mL MEM完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清,1%非必需氨基酸,1%青霉素-鏈霉素)中復(fù)蘇,細(xì)胞生長(zhǎng)在37 ℃,CO2培養(yǎng)箱中,隔天換液,當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿底部貼壁量達(dá)80%以上,消化傳代至24孔板中進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿整個(gè)24孔板底部時(shí),調(diào)整鼠李糖乳桿菌Z5菌液濃度,用PBS(pH7.4)清洗每孔細(xì)胞后,每孔添加1 mL鼠李糖乳桿菌Z5菌液,37 ℃孵育90 min進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)。黏附完成后,PBS每孔清洗3次未被黏附的細(xì)菌,再加入1 mL無(wú)菌蒸餾水37 ℃孵育60 min進(jìn)行細(xì)胞裂解,將每孔中的細(xì)胞與菌懸液全部吸出,梯度稀釋后涂布于MRS固體培養(yǎng)基上,每組3個(gè)平行,進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),計(jì)算鼠李糖乳桿菌Z5與Caco-2的黏附情況[15]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,顯著性差異水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 個(gè)體形態(tài)及菌落特征

對(duì)母乳樣品進(jìn)行系列稀釋后在MRS-碳酸鈣培養(yǎng)基平板上進(jìn)行菌種分離,初步分離出產(chǎn)透明圈菌株16株,經(jīng)革蘭氏染色在100倍油鏡下觀察菌體特征,復(fù)篩獲得3株,呈短鏈狀排列G+短桿的乳酸菌。挑取產(chǎn)酸能力最強(qiáng)的1株菌在MRS-碳酸鈣平板上再次分離純化后,觀察菌落形態(tài)。該菌菌落呈圓形,表面光滑,乳白色,邊緣整齊中間突起較白。篩選菌株在MRS-碳酸鈣培養(yǎng)基上產(chǎn)生的鈣溶圈見(jiàn)圖1,篩選菌株經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡下形態(tài)見(jiàn)圖2。

圖1 篩選菌株KM350174.1在MRS-Ca培養(yǎng)基上產(chǎn)生的鈣溶圈Fig.1 Typical calcium dissolving zones created by KM350174.1 strain isolates on the MRS-Ca medium

圖2 篩選菌株的菌體形態(tài)(1000×)Fig.2 Morphology of isolation strain(1000×)

2.2 菌株生理生化特性

由表1生理生化特性可以看出,該菌株不水解淀粉,明膠不液化,接觸酶陰性,可以利用山梨醇、纖維二糖、麥芽糖、蔗糖,不利用棉籽糖,以上特征與鼠李糖乳桿菌屬極為相似[9]。

注:“+”表示菌株陽(yáng)性;“-”表示菌株陰性。

2.3 菌株16S rDNA序列擴(kuò)增

以篩選菌株的總DNA為模板,采用通用的16S rDNA引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到約1500 bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物,如圖3所示。

表2 不同pH條件下Z5菌株的存活率Table 2 Effects of different pH on the survival rate of strain Z5

注:同行數(shù)據(jù)中的不同字母表示差異顯著(p<0.05);表3同。

表3 不同濃度膽鹽條件下Z5菌株的存活率Table 3 Effects of different concentrations of bile salt on the survival rate of strain Z5

圖3 篩選菌株的16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 The electrophoresis of 16S rDNA after PCR amplification of isolation strain注:1.DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);2.篩選菌株16S rDNA的PCR結(jié)果。

2.4 基于16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將獲得的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析,結(jié)果表明篩選菌株的16S rDNA序列與鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)(登錄號(hào):KM350174.1)相似度達(dá)99%。下載同源性較高的細(xì)菌序列,用MEGA軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),如圖4所示,篩選菌株與所選的鼠李糖乳桿菌JN703790.1處于一個(gè)分支,相似度達(dá)到100%,這與形態(tài)學(xué)、生理生化特性結(jié)果一致。上述鑒定結(jié)果證明該菌為鼠李糖乳桿菌,命名為L(zhǎng)actobacillusrhamnosusZ5。

圖4 篩選菌株16S rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 The phylogenetic tree of 16S rDNA of isolation strain

2.5 菌株耐酸性實(shí)驗(yàn)

乳酸菌作為益生菌能否在人體內(nèi)發(fā)揮作用,取決于在胃液酸性和腸道膽鹽環(huán)境中的存活能力。正常人胃液pH在1.5～4.5之間,受飲食結(jié)構(gòu)不同而上下波動(dòng)[16]。將Z5菌株接種于不同pH的MRS培養(yǎng)基中,平板菌落計(jì)數(shù)法觀察該菌株耐酸情況,由表2可知,菌株在pH2.5條件下接種6 h后菌株存活率仍達(dá)到87.58%,菌株在pH3.0的條件下培養(yǎng)6 h,不受酸性環(huán)境抑制,存活率為97.98%。由酸性至中性條件,隨著環(huán)境pH的升高,培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),菌株生長(zhǎng)不受抑制,菌濃度有所增加。李利[17]利用延遲法測(cè)定鼠李糖乳桿菌SN1和SN6(從自然發(fā)酵酸奶中分離)菌株耐酸性時(shí)發(fā)現(xiàn),該菌在pH2.5的培養(yǎng)基中基本不生長(zhǎng);在pH4.0的培養(yǎng)基中菌體濃度略高于對(duì)照組。

2.6 菌株耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

人體小腸中膽鹽質(zhì)量濃度在0.03%～0.3%之間波動(dòng),若菌株能在該條件下正常生長(zhǎng)和代謝,才可能在腸道消化過(guò)程中存活并定植[18]。由表3可知,菌株在膽鹽濃度為0.05%條件下培養(yǎng)6 h,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),存活不受膽鹽影響,菌株呈生長(zhǎng)趨勢(shì);隨著膽鹽濃度的升高,各菌株的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制,在0.15%膽鹽下培養(yǎng)6 h后,其存活率達(dá)到76.14%,說(shuō)明菌株具有較好的耐膽鹽能力。當(dāng)膽鹽濃度為0.2%較高時(shí),菌株受到嚴(yán)重的抑制,表現(xiàn)為不生長(zhǎng)。趙芳[19]等將鼠李糖乳桿菌(ATCC 53103)作為對(duì)照菌株與其他乳酸菌進(jìn)行膽鹽模擬實(shí)驗(yàn)時(shí),當(dāng)膽鹽濃度為0.15%時(shí),鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)完全受到了抑制。

2.7 菌株耐模擬胃、腸液能力

乳酸菌耐受人工消化液實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在pH為3.0的人工胃液中連續(xù)消化3 h后其活菌數(shù)基本不受影響,隨即接入pH為8.0的人工腸液后消化至6 h菌株仍然保持高達(dá)96.42%的存活率(表4)。實(shí)驗(yàn)菌株在模擬環(huán)境下受到酸及蛋白酶的共同消化作用后活菌數(shù)仍在106cfu/mL以上,這一結(jié)果說(shuō)明Z5菌株具有較強(qiáng)抗人工胃液消化生存能力。王玉華等[20]對(duì)從嬰兒糞便中分離篩選的鼠李糖乳桿菌進(jìn)行模擬胃、腸液耐受力研究表明,在pH為2.0的胃液環(huán)境中,4 h后存活率約為57%;在pH6.8的腸液環(huán)境中消化4 h存活率約為110%。

表4 人工胃、腸液條件下Z5菌株的存活率Table 4 Effects of survival rate of strain Z5 after simulation of exposure to stomach and intestinal fluids

表5 Z5菌株發(fā)酵上清液對(duì)致病菌的抑菌活性Table 5 Antimicrobial activity of strain Z5 against pathogens

2.8 抑菌實(shí)驗(yàn)

發(fā)酵上清液及對(duì)照MRS培養(yǎng)液抑制致病性大腸埃希菌、雞白痢沙門(mén)氏菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。對(duì)照200 μL MRS培養(yǎng)液對(duì)兩株致病菌無(wú)抑制效果,Z5菌株上清液對(duì)兩株致病菌抑菌圈直徑均大于20 mm,效果優(yōu)于彭璐媛的研究結(jié)果[21]。說(shuō)明上清液對(duì)兩株致病菌均有明顯的抑制作用。劉冬梅[22]等對(duì)鼠李糖乳桿菌的抗菌物質(zhì)做了分析,起抑菌作用的主要為乳酸及其分泌的小肽類物質(zhì)。

2.9 菌株與Caco-2的黏附

當(dāng)細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿整個(gè)24孔板底部時(shí)每孔細(xì)胞約為5×105,調(diào)整Z5菌株的濃度為1×107cfu/mL時(shí),對(duì)Caco-2細(xì)胞的平均黏附數(shù)為7.54×105cfu/mL,由此可以看出,此株菌可以有效的黏附在Caco-2細(xì)胞上,同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞染色也發(fā)現(xiàn),鼠李糖乳桿菌Z5菌體黏附時(shí)形態(tài)完整,并且能夠黏附在Caco-2單層細(xì)胞的刷狀邊緣上,見(jiàn)圖5所示。鼠李糖乳桿菌Z5有效地黏附于Caco-2細(xì)胞上,證明鼠李糖乳桿菌能黏附在腸道上皮細(xì)胞中。這種黏附作用有利于鼠李糖乳桿菌Z5定植在動(dòng)物腸道,從而在空間位阻上起到競(jìng)爭(zhēng)性地抑制其他病原菌的黏附[23],調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[24],修復(fù)損傷的腸道粘膜[25]。

圖5 Z5菌株在Caco-2細(xì)胞上的黏附Fig.5 Z5 strain adhesion in Caco-2 cells

3 討論

在母乳采集過(guò)程中,實(shí)驗(yàn)室人員操作嚴(yán)格,篩選到的鼠李糖乳桿菌Z5只在母乳樣品中分離到,未在皮膚樣本中出現(xiàn)。通過(guò)Illumina Miseq PE300高通量測(cè)序?qū)Ρ緦?shí)驗(yàn)的母乳樣品微生物進(jìn)行多樣性分析,發(fā)現(xiàn)母乳中存在一定數(shù)量的乳桿菌(結(jié)果另文發(fā)表),上述結(jié)果證實(shí)了該菌來(lái)源于母乳。對(duì)提供母乳樣品志愿者進(jìn)行回訪時(shí)發(fā)現(xiàn),產(chǎn)婦在妊娠期長(zhǎng)期服用乳果糖,可能是乳汁中含有乳酸菌的原因,Leila Roozbeh Nasiraii[26]在研究飲食與母乳中的乳酸桿菌時(shí)也發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期堅(jiān)持吃益生餐的10名志愿者中有4人母乳中分離到了鼠李糖乳桿菌。

乳酸菌作為益生菌在體內(nèi)受到胃液酸性和腸道膽鹽的雙重脅迫作用并發(fā)揮益生作用。在模擬人工胃腸液實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)6 h消化后,菌株存活率仍達(dá)到90%以上;實(shí)驗(yàn)菌株在0.15%膽鹽質(zhì)量濃度下培養(yǎng)6 h后,存活率高達(dá)76.14%。相比于其它來(lái)源的鼠李糖乳桿菌,本實(shí)驗(yàn)篩選的人母乳來(lái)源的鼠李糖乳桿菌Z5具有更好的胃腸道環(huán)境耐受能力。鼠李糖乳桿菌Z5上清液對(duì)致病性大腸埃希菌(E.coli)和雞白痢沙門(mén)氏菌(S.pullorum)產(chǎn)生不同程度的抑菌效果,說(shuō)明此株菌的代謝產(chǎn)物也具有較好的益生活性。

鼠李糖乳桿菌多分離于人的糞便[27-28]、人群腸道[29]以及乳酪[30]中。鼠李糖乳桿菌最早由美國(guó)人Sherwood Gorbach和Barry Goldin從健康人體的腸道菌群中分離,常簡(jiǎn)稱為L(zhǎng)GG。P E Jsaris等[4]在一位芬蘭人的母乳樣本中分離篩選到鼠李糖乳桿菌。臨床實(shí)驗(yàn)表明,鼠李糖乳桿菌腸道黏著率高,定植能力強(qiáng),可起到調(diào)節(jié)腸道菌群、預(yù)防和治療腹瀉、提高機(jī)體免疫力及抗癌等重要生理保健功能[31-32],目前已被國(guó)家認(rèn)可為第3代益生菌。近年來(lái),我國(guó)逐漸開(kāi)始了對(duì)母乳中的益生菌這一領(lǐng)域的研究,試圖揭示母乳中微生物定植對(duì)于早期嬰兒腸道健康的影響及其關(guān)系。不同來(lái)源的鼠李糖乳桿菌對(duì)疾病的預(yù)防和治療等安全性研究工作已得到廣泛認(rèn)同,并已經(jīng)用于食品和臨床藥品的生產(chǎn)。目前,在全球30多個(gè)國(guó)家已有LGG產(chǎn)品生產(chǎn)和銷售,然而我國(guó)以人源母乳源這種新來(lái)源的LGG篩選和含LGG產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)起步較晚,還鮮有產(chǎn)品問(wèn)世。

4 結(jié)論

從北京地區(qū)健康產(chǎn)婦提供的6份母乳樣品中篩選得到1株乳酸菌,經(jīng)生理生化及16S rDNA鑒定為鼠李糖乳桿菌,命名為L(zhǎng)actobacillusrhamnosusZ5。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明:該菌株具有耐酸、膽鹽及耐受模擬動(dòng)物胃腸道環(huán)境特性、能抑制腸道內(nèi)有害菌大腸桿菌和沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)、很好地黏附到人和動(dòng)物腸道上皮細(xì)胞的特性。在該鼠李糖乳桿菌Z5的益生性質(zhì)進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)上,可望將該菌開(kāi)發(fā)為新的益生菌產(chǎn)品。

[1]Walker A. Breast Milk as the Gold Standard for Protective Nutrients[J]. Journal of Pediatrics,2010,156(2 Suppl):3-7.

[2]Kvist L J. Toward a clarification of the concept of mastitis as used in empirical studies of breast inflammation during lactation[J]. Journal of Human Lactation,2010,26(1):53-59.

[3]Jost T,Lacroix C,Braegger C,et al. Impact of human milk bacteria and oligosaccharides on neonatal gut microbiota establishment and gut health[J]. Nutrition Reviews,2015,73(7):426.

[4]Heikkil? M P,Saris P E J. Inhibition of Staphylococcus aureus by the commensal bacteria of human milk[J]. Journal of Applied Microbiology,2003,95(3):471-478.

[6]Abrahamsson T R,Sinkiewicz G,Jakobsson T,et al. Probiotic lactobacilli in breast milk and infant stool in relation to oral intake during the first year of life[J]. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition,2009,49(3):349-354.

[7]Sakwinska O,Moine D,Delley M,et al. Microbiota in Breast Milk of Chinese Lactating Mothers[J]. Plos One,2016,11(8).

[8]Martín R,Langa S,Reviriego C,et al. Human milk is a source of lactic acid bacteria for the infant gut[J]. Journal of Pediatrics,2003,143(6):754-758.

[9]凌代文. 乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M]. 北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1999.

[10]周德慶. 微生物學(xué)教程[M]. 北京:高等教育出版社,199378-79.

[11]穆明道,呂銘洋,鄭曉楠,等. 中國(guó)傳統(tǒng)乳制品中優(yōu)良乳酸菌的篩選及復(fù)合菌株發(fā)酵的初步研究[J]. 中國(guó)奶牛,2011(2):52-57.

[12]GB4789.35-2010 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)[Z]. 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部,2000.

[13]Kuwahara T,Norimatsu I,Nakayama H,et al. Genetic Variation in 16S-23S rDNA Internal Transcribed Spacer Regions and the Possible Use of This Genetic Variation for Molecular Diagnosis of Bacteroides Species[J]. Microbiology & Immunology,2001,45(3):191-199.

[14]Charteris,Kelly,Morelli,et al. Development and application of aninvitromethodology to determine the transit tolerance of potentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upper human gastrointestinal tract[J]. Journal of Applied Microbiology,1998,84(5):759-768.

[15]Jiang M,Zhang F,Wan C,et al. Evaluation of probiotic properties ofLactobacillusplantarumWLPL04 isolated from human breast milk[J]. Journal of Dairy Science,2016,99(3):5-6.

[16]賴文,劉書(shū)亮,張倩穎,等. 降膽固醇乳酸菌鑒定及其在體外模擬胃腸環(huán)境中抗性研究[J]. 中國(guó)釀造,2011(3):90-93.

[17]李利,孔麗,張寧,等. 耐酸耐膽鹽乳酸菌的鑒定及篩選[J]. 食品科學(xué),2015,36(21):123-128.

[18]趙瑞香,孫俊良. 嗜酸乳桿菌在模擬胃腸環(huán)境中抗性的研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2002,29(2):35-38.

[19]趙芳,李艷琴,李彬春. 模擬人體胃腸道環(huán)境篩選益生乳桿菌[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2016,43(6):1396-1403.

[20]王玉華,高晶,馮印,等. 鼠李糖乳桿菌耐酸及膽鹽能力研究[J]. 食品科學(xué),2008,29(12):449-451.

[21]彭璐媛,孟德志,侯玉鳳,等. 鼠李糖乳桿菌對(duì)三種細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī),2016(13).

[22]劉冬梅,李理,梁世中,等. 鼠李糖乳桿菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的抑菌作用和特性研究[J]. 中國(guó)乳品工業(yè),2006,34(1):13-16.

[23]Lin W H,Yu B,Lin C K,et al. Immune effect of heat-killed multistrain of Lactobacillus acidophilus against Salmonella typhimurium invasion to mice[J]. Journal of Applied Microbiology,2007,102(1):22-31.

[24]Schiffrin E J,Brassart D,Servin A L,et al. Immune modulation of blood leukocytes in humans by lactic acid bacteria:criteria for strain selection[J]. American Journal of Clinical Nutrition,1997,66(2):515S-520S.

[25]Elliott S N,Buret A,Mcknight W,et al. Bacteria rapidly colonize and modulate healing of gastric ulcers in rats[J]. American Journal of Physiology,1998,275(3 Pt 1):425-432.

[26]Majidzadeh R. Investigation of lactobacilli from mother’s breast milk who were placed on probiotic diet[J]. African Journal of Microbiology Research,2011,3(13):1581-1585.

[28]Gu R X,Yang Z Q,Li Z H,et al. Probiotic properties of lactic acid bacteria isolated from stool samples of longevous people in regions of Hotan,Xinjiang and Bama,Guangxi,China[J]. Anaerobe,2008,14(6):313-317.

[29]陳大衛(wèi),郭飛翔,顧瑞霞,等. 人源降血脂乳酸菌的篩選及其功能性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(4):23-29.

[30]Morales F,Morales J I,Hernández C H,et al. Isolation and Partial Characterization of Halotolerant Lactic Acid Bacteria from Two Mexican Cheeses[J]. Applied Biochemistry & Biotechnology,2011,164(6):889-905.

[31]Osterlund P,Ruotsalainen T R,Saxelin M,et al. Lactobacillus supplementation for diarrhoea related to chemotherapy of colorectal cancer:a randomised study[J]. British Journal of Cancer,2007,97(8):1028-1034.

Isolation,identification and probiotic characterization of lactic acid bacteria in human breast milk

GAO Sheng1,QIAO Yu2,*,ZHANG Yu-wei2,PENG Qing2,ZHANG Zhi-sheng1,*,SHI Bo2,LI Jing-mei3,WU Ying4

(1.College of Food Science and Technology,Agricultural University of Hebei,Baoding 071000,China;
2.Feed Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China;3.Institute of Crop Science Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China;4.Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute,Beijing 100081,China)

The strains producing acid were isolated in this study. The transparent ring method on MRS-CaCO3medium plates were used to isolate a bacterial strain producing more acid from the 10～30 d breast milk after giving birth. The optimal strain was identified by morphological observation,physiological and biochemical tests and 16S rDNA sequences,and it presented Gram positive,producing more lactic acid,rod-shaped and non-spore forming. The results of physiological and biochemical tests were consistent withLactobacillusrhamnosus,named Z5. When the strain was incubated in artificial gastric juice and intestinal juice with pH3.0 for 6 h,the survival rates were more than 90%. After 6 h incubation in 0.15 g/L bile salt,the survival rate for the strain was 76.14%. The growth ofSalmonellapullorumandEscherichiacoliwere inhibited by the cultures of the strain Z5 and the antibacterial circle diameter was greater than 20 mm. The strain Z5 could effectively adhered to the Caco-2 cells and the average number of adhesion was 7.54×105cfu/mL. These results suggested thatLactobacillusrhamnosusZ5 isolating from human breast milk showed the high survival rate in gastrointestinal environments and could be a good candidate for probiotic application.

breast milk;Lactobacillusrhamnosus;isolation and identification;probiotic

2016-10-18

高盛(1990-),女,碩士研究生,研究方向:母乳微生物的資源的發(fā)掘與利用,E-mail:794451925@qq.com。

*通訊作者:喬宇(1979-),女,博士,副研究員,研究方向:功能性寡糖與微生物互作的機(jī)理研究,E-mail:qiaoyu@caas.cn。 張志勝(1970-),男,博士,教授,主要從事畜產(chǎn)品加工原理及技術(shù)方面的研究,E-mail:13833035679@139.com。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(FRI-06)。

TS252.1

A

1002-0306(2017)10-0205-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.031