不同酶法輔助提取紫山藥皮薯蕷皂苷及其抗氧化活性研究

王彥平,楊慶瑩,孫瑞琳,古 洋,陳月英

(河南農業(yè)職業(yè)學院食品工程學院,河南鄭州 451450)

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不同酶法輔助提取紫山藥皮薯蕷皂苷及其抗氧化活性研究

王彥平,楊慶瑩,孫瑞琳,古 洋,陳月英*

(河南農業(yè)職業(yè)學院食品工程學院,河南鄭州 451450)

以紫山藥皮為實驗材料,對比分析了纖維素酶和果膠酶對紫山藥皮薯蕷皂苷的提取效果,并在單因素實驗結果基礎上采用正交實驗對纖維素酶提取紫山藥皮薯蕷皂苷的工藝進行優(yōu)化。結果表明,最佳提取工藝為加酶量2.0%、料液比1∶10 g/mL、提取時間60 min、酶解溫度40 ℃,此條件下紫山藥皮薯蕷皂苷的平均得率為(8.77±0.89) mg/100 g。體外抗氧化實驗中,紫山藥皮薯蕷皂苷表現(xiàn)出明顯的抗氧化能力,對DPPH自由基(DPPH·)和羥基自由基(·OH)的半數抑制率濃度IC50分別為0.276 mg/mL和0.430 mg/mL,清除能力略弱于維生素C。

紫山藥皮,薯蕷皂苷,酶法輔提,抗氧化

紫山藥(DioscoreaalataL.)是薯蕷科(Dioscoreae)山藥屬(DioscoreaL.)一年生或多年生蔓生植物,又名紫蒔藥、參薯等,可食用也可作為藥材入藥,產于廣西、江西、云南、福建、河南等地[1]。紫山藥味甜質脆,富含淀粉、膳食纖維、氨基酸、黏性多糖、花青素、薯蕷皂苷元和尿囊素等多種營養(yǎng)功能成分[2]。其中薯蕷皂苷元具有脫敏、抗炎、降脂、抗氧化、抗腫瘤、保肝、抗病毒等作用,具有很高的保健價值[3-6]。薯蕷皂苷元(diosgenin)作為一種重要的天然甾體皂苷元,來源廣泛,是合成黃體酮、可的松、強的松、雙烯醇酮醋酸酯、性激素、催產素等甾體激素的重要原料[7]。研究表明,紫山藥中薯蕷皂苷元含量較高,且紫山藥皮中的薯蕷皂苷元含量比肉中含量要高[8],可作為提取薯蕷皂苷元的優(yōu)質原材料。

薯蕷皂苷(diosgen)由薯蕷皂苷元和糖基組成,與纖維素結合存在于細胞壁中,由于植物細胞壁較堅韌,因而傳統(tǒng)的提取法僅能提取部分的皂苷。酶輔助提取方法是近年來用于植物功能性成分提取的一項生物工程技術,而國內外將酶工程技術用于紫山藥皮薯蕷皂苷提取的研究未見報道。衰老是人體內自由基不斷產生與積累的結果,自由基能使人體細胞中細胞膜氧化、蛋白質變性,導致體內抗氧化酶活性降低,抗氧化能力下降,從而誘發(fā)衰老、動脈硬化甚至腫瘤[9]。研究表明,山藥薯蕷皂苷元具有良好的抗氧化性[10]。薯蕷皂苷元通過其抗氧化功能起到心肌保護、抗高血脂、治療口腔癌的作用[11-14]。紫山藥皮是紫山藥開發(fā)利用的副產物,本研究比較研究纖維素酶和果膠酶對紫山藥皮薯蕷皂苷的提取效果,并采用正交實驗對復合酶法提取紫山藥皮薯蕷皂苷的提取工藝進行優(yōu)化,為紫山藥的綜合開發(fā)利用和提高附加值提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫山藥 為河南溫縣產紫山藥,將紫山藥皮洗凈后剪成約1 cm×1 cm的碎片,置于60 ℃恒溫箱烘24 h,稱恒重、粉碎,過50目篩后,在二氧化硅干燥器內常溫保存?zhèn)溆?纖維素酶(10000 U/g)、果膠酶(10000 U/g) 索萊寶公司;薯蕷皂苷標準品 中國藥品生物制品檢定所;香草醛、冰醋酸、高氯酸、無水乙醇、醋酸鈉等 均為分析純,國藥集團。

BS224S分析天平 德國賽多利斯公司;UV power紫外可見光分光光度計 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋、202-3AB電熱恒溫鼓風干燥箱 上海喬躍電子科技有限公司;PHS-3C 精密pH計 上海雷磁儀器廠;RE2000旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;D5-R2離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 薯蕷皂苷標準曲線的繪制 準確稱取干燥至恒重的薯蕷皂苷標準品5.0 mg,用無水甲醇溶解,定容至50 mL,搖勻得0.1 mg/mL的薯蕷皂苷標準溶液。分別移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的0.1 mg/mL薯蕷皂苷標準溶液置于具塞試管中,并置于70 ℃水浴使其溶劑揮干。再分別加入0.2 mL 5%香草醛冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸,混勻封塞,置于60 ℃水浴中顯色15 min,取出后立即置冰水中冷卻5 min,再各加5 mL冰醋酸,混勻,靜置10 min。用紫外分光光度計在544 nm處測定其吸光度。以薯蕷皂苷質量濃度(mg/mL)為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.2 紫山藥皮粉預處理 準確稱取紫山藥皮粉20 g置索氏抽提器中,用乙醚90 ℃回流脫脂,待紫山藥粉中乙醚揮發(fā)完后,加入85%乙醇90 ℃回流提取,以去除可溶性糖;將揮發(fā)完乙醇后紫山藥粉60 ℃恒溫箱干燥、恒重,得紫山藥皮預處理粉。

1.2.3 薯蕷皂苷的提取工藝流程 將紫山藥預處理粉與水混合后加醋酸鈉-醋酸緩沖液調節(jié)pH至一定值,然后加入一定量的酶在一定溫度下酶解一定時間,90 ℃酶滅活10 min后4000 r/min離心15 min,棄上清液取濾渣,將濾渣用80%的乙醇回流提取6 h后4800 r/min離心15 min,取上清液,用旋轉蒸發(fā)儀低溫減壓回收溶劑后得粗薯蕷皂苷粉末。對照組直接將紫山藥預處理粉用80%的乙醇回流提取6 h后4800 r/min離心15 min,取上清液,用旋轉蒸發(fā)儀低溫減壓回收溶劑后得粗薯蕷皂苷粉末。

1.2.4 薯蕷皂苷含量測定 將1.2.3步驟所得粗薯蕷皂苷粉末在60 ℃下干燥至恒重,精確稱取粗薯蕷皂苷粉末50 mg,用無水甲醇定容至100 mL做薯蕷皂苷儲備液。取儲備液1 mL于具塞試管中,置70 ℃水浴使其溶劑揮干。然后按照1.2.1方法處理,測定其吸光度。

薯蕷皂苷得率(mg/100 g)=薯蕷皂苷質量(mg)/紫山藥粉質量(g)×100

1.2.5 紫山藥皮薯蕷皂苷提取的單因素實驗

1.2.5.1 不同酶及加酶量對薯蕷皂苷得率的影響 纖維素酶和果膠酶兩種酶的加酶量(以紫山藥皮粉干重計酶量)分別為0.5%、1%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%,在料液比1∶20、pH5.0、溫度40 ℃條件下酶解40 min,按1.2.4的方法處理并測定544 nm處吸光度,并計算薯蕷皂苷得率，選擇其最佳酶及加酶量。

1.2.5.2 酶解時間對薯蕷皂苷得率的影響 酶解時間分別為15、30、45、60、75、90 min,在纖維素酶的加酶量均為1.5%、料液比1∶20、pH5.0、溫度40 ℃的條件下酶解,按1.2.4的方法處理并測定544 nm處吸光度,并計算薯蕷皂苷得率，選擇其最佳酶解時間。

1.2.5.3 酶解溫度對薯蕷皂苷得率的影響 酶解溫度分別為25、30、35、40、45、50、55 ℃,在纖維素酶的加酶量均為1.5%、料液比1∶20、pH5.0的條件下酶解40 min,按1.2.4的方法處理并測定544 nm處吸光度,并計算薯蕷皂苷得率，選擇其最佳酶解溫度。

1.2.5.4 料液比對薯蕷皂苷得率的影響 料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25,在pH5.0、纖維素酶的加酶量1.5%、溫度40 ℃條件下酶解40 min,按1.2.4的方法處理并測定544 nm處吸光度,并計算薯蕷皂苷得率，選擇其最佳料液比。

1.2.5.5 pH對薯蕷皂苷得率的影響 pH分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0,在纖維素酶的加酶量1.5%、料液比1∶20、溫度40 ℃條件下提取40 min,按1.2.4的方法處理并測定544 nm處吸光度,并計算薯蕷皂苷得率，選擇其最佳pH。

1.2.6 纖維素酶對紫山藥皮薯蕷皂苷提取的正交實驗 在單因素實驗基礎上,設計出4因素3水平L9(34)的正交實驗,見表1。按照1.2.3的方法提取紫山藥皮薯蕷皂苷,并計算薯蕷皂苷得率,以確定纖維素酶法提取紫山藥皮薯蕷皂苷的最佳工藝條件。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.7 紫山藥皮薯蕷皂苷體外抗氧化活性的測定 按照正交實驗獲得的最佳工藝條件得紫山藥皮薯蕷皂苷提取液后,按照1.2.3的方法制備粗薯蕷皂苷粉末,按照1.2.4的方法測定洗脫液吸光度,并計算紫山藥皮薯蕷皂苷質量濃度,按照不同要求,配制不同濃度的薯蕷皂苷甲醇溶液,分別進行DPPH·清除率的測定、·OH清除率的測定,體外抗氧化實驗參照文獻[15]的方法。

1.3 數據處理

采用Excel 2007軟件對數據進行處理,所有實驗數據均為3次重復實驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 薯蕷皂苷標準曲線

如圖1所示,其線性回歸方程為:y=2.236x+0.0063,R2=0.9991。

圖1 薯蕷皂苷標準曲線Fig.1 The standard curve of dioscin

2.2 紫山藥皮薯蕷皂苷提取單因素實驗

2.2.1 酶及加酶量的選擇 由圖2可知,在一定的加酶量范圍內,紫山藥皮薯蕷皂苷得率隨著加酶量的增加而升高,這主要是由于加酶量較少時,酶解進行不完全,隨著加酶量的增加,酶解程度逐漸增高,薯蕷皂苷得率隨之增高。當加酶量到一定量后,薯蕷皂苷得率趨于穩(wěn)定,表明紫山藥細胞壁酶解完全。得率最高時纖維素酶加酶量比果膠酶少,且纖維素酶的得率比果膠酶高。故選擇纖維素酶輔助提取紫山藥皮薯蕷皂苷,并選擇纖維素酶添加量為1.5%～2.5%進行優(yōu)化實驗。

圖2 不同酶和加酶量對薯蕷皂苷得率的影響Fig.2 Effect of different enzyme and enzyme amount on dioscin yield

2.2.2 酶解時間對薯蕷皂苷得率的影響 由圖3可知,酶解時間低于60 min時,紫山藥皮薯蕷皂苷得率隨著時間延長呈現(xiàn)升高趨勢,60～90 min范圍時趨向平穩(wěn),說明酶解60 min時紫山藥細胞壁基本酶解完全。故選擇纖維素酶酶解時間為45～75 min進行優(yōu)化實驗。

圖3 酶解時間對薯蕷皂苷得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on dioscin yield

2.2.3 酶解溫度對紫山藥皮薯蕷皂苷得率的影響 由圖4可知,在一定的酶解溫度范圍內,薯蕷皂苷得率隨著溫度的升高而增大,這主要是因為酶的活性受到溫度的影響,纖維素酶的活性分別在40 ℃達到最高值,溫度繼續(xù)升高,酶的活性降低,薯蕷皂苷得率也隨之降低。故選擇酶解溫度為35～45 ℃進行優(yōu)化實驗。

圖4 酶解溫度對薯蕷皂苷得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on dioscin yield

2.2.4 料液比對薯蕷皂苷元得率的影響 由圖5可知,相同條件下,紫山藥皮薯蕷皂苷得率隨著料液比的減小而升高。當料液比由1∶5 g/mL增加到1∶15 g/mL時,薯蕷皂苷得率不斷升高,當料液比大于1∶15 g/mL時,薯蕷皂苷得率呈下降趨勢。一定范圍內,提取劑劑量越大,薯蕷皂苷浸出率越高;但當提取劑過多時可能由于酶濃度下降,薯蕷皂苷得率反而下降[16]。故選擇料液比為(1∶10～1∶20) g/mL進行優(yōu)化實驗。

圖5 料液比對薯蕷皂苷得率的影響Fig.5 Effect of water-material ratio on dioscin yield

2.2.5 pH對薯蕷皂苷得率的影響 由圖6可知,纖維素酶對紫山藥皮薯蕷皂苷得率在pH為4.5時達到最大值,因此纖維素酶最適宜pH確定為4.5。

圖6 pH對薯蕷皂苷得率的影響Fig.6 Effect of pH on dioscin yield

2.2 紫山藥皮薯蕷皂苷提取的正交實驗

紫山藥皮薯蕷皂苷提取的正交實驗結果(表2)分析表明,根據極差結果得出各因素對紫山藥皮薯蕷皂苷提取效果重要性的順序為RD>RA>RC>RB,即酶解溫度>加酶量>酶解時間>料液比。最佳提取工藝為A2B1C2D2,即加酶量2.0%、料液比1∶10 g/mL、提取時間60 min、酶解溫度40 ℃。對最佳提取工藝條件做驗證實驗,重復3次,此條件下紫山藥皮薯蕷皂苷平均得率為(8.77±0.89) mg/100 g,高于正交實驗中所有實驗結果。

表2 紫山藥皮薯蕷皂苷提取的正交實驗結果Table 2 The results of orthogonal test of extraction of purple yam skin dioscin

2.3 紫山藥皮薯蕷皂苷體外抗氧化活性

2.3.1 紫山藥皮薯蕷皂苷對DPPH·的清除作用 由圖7可知,在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內,對DPPH·的清除能力隨著紫山藥皮薯蕷皂苷質量濃度的提高而增強,通過線性回歸方程計算得到紫山藥皮薯蕷皂苷的IC50=0.276 mg/mL,而維生素C的IC50=0.227 mg/mL,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),這說明在相同濃度下,紫山藥皮薯蕷皂苷對DPPH·的清除能力略弱于維生素C。

圖7 紫山藥皮薯蕷皂苷對DPPH·的清除作用Fig.7 The DPPH· removal effect of purple yam dioscin注:*與同濃度下維生素C比,差異顯著(p<0.05);圖8同。

2.3.2 紫山藥皮薯蕷皂苷對·OH的清除作用 由圖8可知,在·OH清除實驗中,在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內,薯蕷皂苷濃度與·OH清除率之間存在良好的量效關系,通過線性回歸方程計算得到紫山藥皮薯蕷皂苷的IC50=0.430 mg/mL,而維生素C的IC50=0.364 mg/mL,差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05),這說明在相同濃度下,紫山藥皮薯蕷皂苷對·OH的清除能力略弱于維生素C。

圖8 紫山藥皮薯蕷皂苷對·OH的清除作用Fig.8 The ·OH removal effect of purple yam dioscin

3 結論與討論

徐皓等[17]、史會齊等[18]和周新勇等[19]均采用甲醇回流浸提工藝對紫山藥薯蕷皂苷的提取,提取時間長且不具備綠色環(huán)保的特點。本研究采用酶法輔助提取薯蕷皂苷,主要包括酶促反應和溶劑回流兩個過程。酶促反應階段利用酶對紫山藥皮細胞壁的分解和破壞,極大提高細胞壁的通透性,有利于細胞內薯蕷皂苷成分溶出;第二階段通過溶劑回流,將紫山藥皮細胞中薯蕷皂苷成分充分溶于溶劑中[20]。本實驗對比分析了纖維素酶和果膠酶對紫山藥皮薯蕷皂苷得率的影響,單因素實驗結果顯示,纖維素酶的提取效果明顯優(yōu)于果膠酶。因此纖維素酶對紫山藥皮薯蕷皂苷的提取工藝進行優(yōu)化,正交實驗根據極差結果得出各因素對紫山藥粗薯蕷皂苷提取效果重要性的順序為酶解溫度、加酶量、酶解時間、料液比。最佳提取工藝為加酶量2.0%、料液比1∶10 g/mL、提取時間60 min、酶解溫度40 ℃。對最佳提取工藝條件做驗證實驗,重復3次,此條件下紫山藥皮薯蕷皂苷的平均得率為(8.77±0.89) mg/100 g,高于正交實驗中所有實驗結果也高于對照組紫山藥皮薯蕷皂苷平均得率為(6.92±0.16) mg/100 g,差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。說明此優(yōu)化工藝參數可靠,能為紫山藥的綜合利用提供參考。

該研究分別對DPPH·和·OH清除率2個方面對紫山藥皮薯蕷皂苷進行了體外抗氧化能力測定。通過體外抗氧化性實驗,發(fā)現(xiàn)紫山藥皮薯蕷皂苷對DPPH·和·OH的清除能力略弱于維生素C。紫山藥皮薯蕷皂苷在實驗濃度下,濃度對DPPH·和·OH的清除能力呈現(xiàn)良好的量效關系,即濃度越高抗氧化能力越強。綜上所述,紫山藥皮薯蕷皂苷具有較好的抗氧化活性,說明紫山藥薯蕷皂苷具有良好的應用前景,為其在功能性食品和藥品方面的開發(fā)利用提供一定的科學依據。

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Study on optimization of enzymatic extraction of dioscin from purple yam skin and its antioxidant activity

WANG Yan-ping,YANG Qing-ying,SUN Rui-lin,GU Yang,CHEN Yue-ying*

(Department of Food Engineering,Henan Vocational College of Agriculture,Zhengzhou 451450,China)

Taking purple yam skin as the experimental material,cellulase and pectinase were selected to comparatively analyze extraction effect of purple yam skin,and the optmium technology conditions of the cellulase extraction of purple yam skin dioscin were optimized by using the orthogonal experiment based on the results of single factor test. Results showed the optimum condition were as follows:cellulose amount 2.0%,material-solvent ratio 1∶10(g/mL),enzymolysis time 60 min,enzymolysis temperature 40 ℃. Under such conditions,the yield of dioscin was(8.77±0.89) mg/100 g. Dioscin from purple yam skin showed significant antioxidant capacity,and half inhibition concentrations(IC50)of DPPH· and that of ·OH were 0.276 mg/mL and 0.430 mg/mL respectively,the scavenging abilities were slightly weaker than vitamin C.

purple yam skin;dioscin;enzymatic extraction;antioxidant

2016-11-08

王彥平(1983-)，女，碩士，講師，研究方向：食品功能與營養(yǎng)因子，E-mail：14389487@qq.com。

*通訊作者:陳月英(1964-)，女，碩士，教授，研究方向：功能性食品，E-mail：cyy932@qq.com。

鄭州市普通科技攻關項目(153PKJGG424)；2015年度河南省高等學校優(yōu)秀教學團隊建設；2014年度河南省高等學?！皩I(yè)綜合改革試點”項目。

TS209

A

1002-0306(2017)10-0200-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.030