大蒜果聚糖∶果聚糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)特性

喻嘉鑫,段翰英,文 明,黃雪松

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系,廣東廣州 510632)

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大蒜果聚糖∶果聚糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶學(xué)特性

喻嘉鑫,段翰英,文 明,黃雪松*

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系,廣東廣州 510632)

大蒜中主要干物質(zhì)為多糖,其中主要糖類為果聚糖,具有多種保健作用。本文研究了大蒜中果聚糖∶果聚糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Fructan∶fructan 1-fructosyltransferase,1-FFT)的酶學(xué)特性,為闡明大蒜在采后貯藏、保鮮及深加工過(guò)程中果聚糖含量的變化提供依據(jù)。結(jié)果表明:當(dāng)以1-蔗果三糖為底物時(shí),1-FFT僅催化生成蔗果四糖,且無(wú)其它結(jié)構(gòu)的四糖生成;大蒜1-FFT主要存在于40%～50%硫酸銨部分;其最適pH為6.0,在pH 5.5～6.5條件下1 h內(nèi)保持穩(wěn)定;最適溫度為25 ℃,在15～25 ℃條件下1 h內(nèi)可保持穩(wěn)定;低濃度Mn2+、Mg2+、Fe3+促進(jìn)1-FFT活力,Cu2+、Zn2+、Ag+抑制1-FFT活力;1-FFT活力隨底物濃度升高而增大,其米氏常數(shù)Km=0.6977 mol/L,最大反應(yīng)速率Vmax=116.23 μg/h。大蒜1-FFT活力受 pH、溫度、不同金屬離子及底物濃度影響,調(diào)節(jié)以上因素有助于調(diào)控大蒜果聚糖代謝、保持大蒜品質(zhì)及延長(zhǎng)大蒜貯藏期。

大蒜,果聚糖,1-蔗果三糖,果聚糖∶果聚糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶,酶學(xué)特性

大蒜(AlliumsativumL.)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生物活性成分,既可作為日常生活中的蔬菜和調(diào)味品,又可作為具有祛濕抗毒、健脾強(qiáng)身等作用的日常保健食品[1]。大蒜干物質(zhì)質(zhì)量的75%以上為多糖,其中主要糖類是果聚糖(fructan)[2-4]。大量研究表明果聚糖具有降血脂[5]、預(yù)防骨質(zhì)疏松[6]、抗病毒[7]等多種保健作用。另外,果聚糖既是植物的能量貯藏物質(zhì),又是提高植物抗逆性(如抗旱、抗寒、抗鹽等)的重要成分[8]。因此,大蒜果聚糖是評(píng)價(jià)大蒜品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,而其含量高低則受大蒜果聚糖代謝酶調(diào)控與影響。在Shiomi[9]等人提出的高等植物果聚糖代謝模型中,果聚糖:果聚糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Fructan:fructan 1-fructosyltransferase,1-FFT)是一種以1-蔗果三糖(1-Kestose)為起始底物合成高聚合度果聚糖的果糖基轉(zhuǎn)移酶。1-FFT將1-蔗果三糖分子的果糖基轉(zhuǎn)移至另一1-蔗果三糖分子上,以β(2→1)糖苷鍵連接形成蔗果四糖(1,1-Kestotetraose)。所以,研究大蒜果聚糖代謝酶的酶學(xué)特性,對(duì)揭示大蒜中果聚糖的代謝規(guī)律,進(jìn)一步闡明大蒜在采后貯藏、保鮮及深加工過(guò)程中果聚糖含量的變化提供理論依據(jù)。

目前已有部分植物如菊苣(Cichorium

intybus)[10]、洋蔥(Alliumcepa)[11-12]、菊芋(HelianthustuberosusColombia)[13]、蘆筍(AsparagusL.)[14]、黑麥草(Loliumrigidum)[15]等中存在1-FFT的相關(guān)報(bào)道,但尚未見對(duì)大蒜1-FFT的相關(guān)報(bào)道。為此,本文擬先通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)1-FFT進(jìn)行初步分離,利用緩沖溶液將所得沉淀進(jìn)行透析處理,并確定其所在部分,經(jīng)透析后酶液與其底物1-蔗果三糖反應(yīng),采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)檢測(cè)1-FFT催化生成的產(chǎn)物蔗果四糖,進(jìn)而探究不同pH、溫度、金屬離子及底物濃度因素對(duì)1-FFT活力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山東蒼山縣大蒜(已破除休眠) 購(gòu)自廣州市石牌蔬菜市場(chǎng);亞硫酸氫鈉、疊氮化鈉(NaN3)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、硫酸銨、乙酸鈉、冰乙酸、氯化錳、氯化鎂、三氯化鐵、硫酸銅、硫酸鋅、硝酸銀等 均購(gòu)自天津富宇精細(xì)化工有限公司;色譜級(jí)乙腈 美國(guó)迪馬公司;1-蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.0%) 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。

CR 22GⅢ高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;FD-1A-50型冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;PHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;78-1磁力加熱攪拌器 浙江金壇市宏華儀器廠;Prevail Carbohydrate ES柱、Alltech 2000 ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(ELSD) 美國(guó)奧泰公司;LC-20AD型高效液相色譜儀(HPLC) 日本島津公司;。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗酶提取 參考文明[16]等人的方法,稍作修改:取500 g大蒜,切碎,加入適量0.05 mol/L pH 6.0的醋酸鹽緩沖溶液(含0.01 mol/L NaHSO3,0.1% PVPP,0.02% NaN3)勻漿3 min,經(jīng)4層紗布過(guò)濾后取濾汁,4 ℃、5000 r/min 離心10 min,取上清液備用。

1.2.2 1-FFT活力的測(cè)定及酶活力定義 取100 μL透析后酶液(透析液為0.05 mol/L pH 6.0醋酸鹽緩沖液)與100 μL 0.1 mol/L 1-蔗果三糖溶液在25 ℃下反應(yīng)13.5 h后,加入1 mL無(wú)水乙醇終止反應(yīng);反應(yīng)液經(jīng)離心、過(guò)濾膜后,用HPLC-ELSD檢測(cè)蔗果四糖的生成量并計(jì)算出1-FFT活力。各樣品進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。酶活力單位的定義:在25 ℃條件下,每1 h大蒜果聚糖合成酶1-FFT生成1 μg蔗果四糖所需的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。蔗果四糖生成量(μg)通過(guò)蔗果四糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。酶活力計(jì)算公式如下:

酶活力(U/mL)=蔗果四糖生成量(μg)/反應(yīng)時(shí)間(h)/酶液體積(mL)

1.2.3 HPLC-ELSD法測(cè)定低聚果糖的色譜條件 參考文明[16]等人的方法:色譜柱:Prevail Carbohydrate ES柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫箱溫度40 ℃;ELSD撞擊器關(guān)閉狀態(tài),漂移管溫度90 ℃,載氣(空氣)流速2.5 L/min;流動(dòng)相為乙腈和水,流速為1.0 mL/min,流動(dòng)相最大限壓20 MPa;采用梯度洗脫方式,其洗脫條件見表1;進(jìn)樣量10 μL。

表1 HPLC-ELSD的梯度洗脫條件Table 1 Conditions of HPLC-ELSD gradient elution

1.2.4 蔗果四糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取0.5 g 蔗果四糖標(biāo)準(zhǔn)品,用去離子水定容至10 mL,得到濃度為50 mg/mL 的單標(biāo)儲(chǔ)備液。分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液,用去離子水定容至5 mL,得到濃度梯度為5、10、15、20、25 mg/mL 的蔗果四糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。按1.2.3中所述方法進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣5次,以蔗果四糖的平均峰面積(y)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中蔗果四糖的質(zhì)量(x)做校準(zhǔn)曲線,得到回歸方程y=32325 x - 75614,相關(guān)系數(shù)R2=0.998。

1.2.5 硫酸銨分級(jí)沉淀 在所得上清液中緩慢加入硫酸銨粉末至飽和度為30%,于冰中靜置30 min,4 ℃、12000 r/min離心20 min,收集沉淀并將其冷凍干燥成粉末,并于-80 ℃保存。依次向所得上清液加入硫酸銨至40%、50%、80%飽和度,并重復(fù)上述步驟,得到0%～30%、30%～40%、40%～50%、50%～80%硫酸銨部分的干粉。

1.2.6 1-FFT所在硫酸銨部分的確定 各取0.5 g 0%～30%、30%～40%、40%～50%、50%～80%硫酸銨部分干粉,溶于5 mL 0.05 mol/L pH 6.0的醋酸鹽緩沖溶液(含0.02% NaN3)中,將其轉(zhuǎn)移至截留分子量為14 kDa的透析袋中,4 ℃條件下,用0.05 mol/L pH 6.0的醋酸鹽緩沖溶液進(jìn)行透析,每隔2 h更換一次透析液,直至透析液用氯化鋇檢測(cè)無(wú)沉淀為止。收集透析袋內(nèi)酶液,4 ℃、3500 r/min離心5 min,取上清液用于酶活力測(cè)定。各取100 μL透析后酶液,向其加入100 μL 0.1 mol/L 1-蔗果三糖溶液,25 ℃條件下反應(yīng)13.5 h后,測(cè)定1-FFT活力。

1.2.7 pH對(duì)1-FFT活力及穩(wěn)定性的影響 配制pH為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液,按1.2.6所述方法,將40%～50%硫酸銨部分干粉溶解并透析后制成不同pH的酶液。各取100 μL上述酶液,向其加入100 μL 0.1 mol/L 1-蔗果三糖溶液,25 ℃條件下反應(yīng)13.5 h后,測(cè)定1-FFT活力。另取pH 4.5、5.0、5.5、6.5的酶液孵育不同時(shí)間,孵育結(jié)束后將各酶液pH調(diào)回6.0,與底物在25 ℃下反應(yīng),測(cè)定1-FFT活力,并以pH 6.0 酶液在25 ℃下與0.1 mol/L底物反應(yīng)所測(cè)得1-FFT活性為100%,計(jì)算相對(duì)活性。

1.2.8 溫度對(duì)1-FFT活力的影響及熱穩(wěn)定性 取100 μL透析后pH 6.0的40%～50%硫酸銨部分酶液,向其中加入100 μL 0.1 mol/L 1-蔗果三糖溶液,分別在15、25、35、45、55、65 ℃條件下反應(yīng)13.5 h后,測(cè)定1-FFT活力。另取酶液在15、25、30、35 ℃下孵育不同時(shí)間,將孵育后酶液與底物在25 ℃下反應(yīng),測(cè)定1-FFT活力,并以pH 6.0 酶液在25 ℃下與0.1 mol/L底物反應(yīng)所測(cè)得1-FFT活性為100%,計(jì)算相對(duì)活性。

1.2.9 不同金屬離子對(duì)1-FFT活力的影響 分別配制含10、50、100、250、500、1000 μmol/L Mn2+、Mg2+、Fe3+、Cu2+、Ag+、Zn2+的0.1 mol/L 1-蔗果三糖溶液,與透析后酶液在25 ℃下反應(yīng),測(cè)定1-FFT活力,并以pH 6.0 酶液在25 ℃下與0.1 mol/L底物反應(yīng)所測(cè)得1-FFT活性為100%,計(jì)算相對(duì)活性。

1.2.10 底物濃度對(duì)1-FFT活力的影響 取10、20、30、40、60、70、80、90 μL 0.2 mol/L 1-蔗果三糖溶液,補(bǔ)加蒸餾水至100 μL,得濃度分別0.02、0.04、0.06、0.08、0.12、0.14、0.16、0.18 mol/L的1-蔗果三糖溶液。各取100 μL上述1-蔗果三糖溶液,向其加入100 μL透析后pH 6.0的40%～50%硫酸銨部分酶液,25 ℃條件下反應(yīng)13.5 h后,測(cè)定1-FFT活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜1-FFT活力及所在硫酸銨部分的鑒定

圖1 1-FFT活力的鑒定Fig.1 Determination of 1-FFT enzymatic activity注:a:各糖標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間;b:反應(yīng)后體系中各糖含量;c:酶液中各糖含量。

由圖1(b)可知,將透析后酶液與0.1 mol/L的1-蔗果三糖溶液反應(yīng),利用HPLC-ELSD檢測(cè)反應(yīng)后體系中不同糖類的含量,并與果糖、葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間(圖1a)進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)在17.1 min處色譜峰的保留時(shí)間與蔗果四糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致。由圖1(c)可知,透析后酶液中未檢測(cè)到蔗果四糖,排除酶液中本身含有蔗果四糖的影響,由此推斷1-FFT利用底物1-蔗果三糖催化合成蔗果四糖。

由圖2可知,40%～50%硫酸銨部分1-FFT活力最高,故選取該部分用于研究大蒜1-FFT的酶學(xué)特征。而0%～30%、30%～40%硫酸銨部分也存在一定1-FFT活力,50%～80%硫酸銨部分1-FFT活力更低,只有40%～50%硫酸銨部分的25%。各硫酸銨部分都存在1-FFT活力的原因可能是大蒜中存在其同工酶。而植物種屬的差異也會(huì)造成1-FFT所在硫酸銨部分的差異。John[17]等人在研究黑麥草1-FFT時(shí),選用30%～80%硫酸銨沉淀部分,而Lüscher[18]等人在研究菊芋1-FFT時(shí),選用0%～65%硫酸銨沉淀部分。此外,從上述報(bào)道中可發(fā)現(xiàn)各植物中1-FFT所用硫酸銨飽和度的范圍都較寬,推測(cè)各植物種屬中存在1-FFT同工酶。

圖2 1-FFT的硫酸銨分級(jí)沉淀Fig.2 Fractional precipitation of 1-FFT with ammonium sulfate

2.2 pH對(duì)1-FFT活力及穩(wěn)定性的影響

由圖3(a)可知,當(dāng)pH為4.5～6.0時(shí),酶活力隨著pH的增大而升高,當(dāng)pH大于6.0時(shí),酶活力隨pH的增大而降低,說(shuō)明大蒜1-FFT的最適pH為6.0。對(duì)比于其他高等植物中1-FFT的相關(guān)報(bào)道,發(fā)現(xiàn)不同植物種屬中1-FFT的最適pH有所差異。Kusch[19]等人在提取菊苣1-FFT時(shí)所用緩沖液的pH為5.0;Shiomi[20]等人在測(cè)定洋蔥中1-FFT活力時(shí),所用緩沖液的pH為5.5。不同植物的1-FFT具有不同的最適pH,推測(cè)各植物中1-FFT在其分子結(jié)構(gòu)上存在差異,還有進(jìn)一步待研究。

由圖3(b)可知,在pH 5.5、6.5條件下孵育1 h后,1-FFT剩余85%以上的活力;在pH 4.5、5.0條件下孵育1 h后,1-FFT活力損失達(dá)30%～40%;說(shuō)明1-FFT在pH 5.5～6.5條件下1 h內(nèi)可保持較好的穩(wěn)定性。

圖3 pH對(duì)1-FFT活力及穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of pH on 1-FFT enzymatic activity and pH-dependent stability注:a:pH對(duì)1-FFT活力的影響;b:pH對(duì)1-FFT穩(wěn)定性的影響。

圖4 溫度對(duì)1-FFT活力的影響及熱穩(wěn)定性Fig.4 Effect of temperature on 1-FFT enzymatic activity and thermal stability注:a:溫度對(duì)1-FFT活力的影響;b:1-FFT的熱穩(wěn)定性。

2.3 溫度對(duì)1-FFT活力的影響及熱穩(wěn)定性

由圖4(a)可知,25 ℃條件下1-FFT活力最高。當(dāng)溫度超過(guò)25 ℃時(shí),1-FFT活力迅速下降,因此25 ℃為大蒜1-FFT的最適溫度。當(dāng)溫度超過(guò)45 ℃時(shí),1-FFT活力保持在較低水平且不再變化。因此在對(duì)大蒜1-FFT進(jìn)行研究時(shí),仍應(yīng)避免在高溫環(huán)境下操作,以防其活力降低。對(duì)比發(fā)現(xiàn)大蒜1-FFT的最適溫度(25 ℃)低于其他植物中1-FFT的最適溫度。Koops[21]等人發(fā)現(xiàn)菊芋中1-FFT的最適溫度在25～35 ℃之間。根據(jù)文明[16]等人的報(bào)道,另一種大蒜果聚糖合成酶蔗糖:蔗糖1-果糖基轉(zhuǎn)移酶(1-SST)的最適溫度為35 ℃,而本研究中1-FFT最適溫度為25 ℃,即同一溫度下各大蒜果聚糖合成酶的酶活力強(qiáng)度不一致,不利于高聚合度果聚糖的合成,推測(cè)大蒜在各生長(zhǎng)階段中,主導(dǎo)果聚糖合成的酶類不同,由此可見大蒜果聚糖代謝機(jī)制十分復(fù)雜。

由圖4(b)可知,在25 ℃下孵育1 h后,1-FFT活力幾乎沒(méi)有損失;在15 ℃下孵育1 h后,1-FFT活力損失10%;而在30、35 ℃下孵育1 h后,1-FFT活力損失25%～35%。說(shuō)明1-FFT在15～25 ℃條件下1 h內(nèi)可保持良好的穩(wěn)定性。當(dāng)溫度偏離最適溫度時(shí),1-FFT穩(wěn)定性開始下降,溫度越高,穩(wěn)定性越差。

2.4 不同金屬離子對(duì)1-FFT活力的影響

從圖5可知,在10 μmol/L Mn2+、Mg2+、Fe3+條件下1-FFT相對(duì)活力均高于100%,說(shuō)明低濃度Mn2+、Mg2+、Fe3+對(duì)1-FFT活力起促進(jìn)作用,隨著各金屬離子濃度的上升,1-FFT活力下降5%～20%,并逐漸保持穩(wěn)定,說(shuō)明Mn2+、Mg2+、Fe3+對(duì)1-FFT活力影響較小;隨著Cu2+、Zn2+濃度的升高(10～1000 μmol/L),1-FFT活力損失超過(guò)50%,說(shuō)明Cu2+、Zn2+對(duì)1-FFT活力起抑制作用;Ag+對(duì)1-FFT活力起強(qiáng)烈抑制作用,當(dāng)Ag+濃度從10 μmol/L升至50 μmol/L時(shí),1-FFT活力損失超過(guò)50%,當(dāng)Ag+濃度超過(guò)100 μmol/L時(shí),1-FFT已完全喪失活力。

圖5 不同金屬離子對(duì)1-FFT活力的影響Fig.5 Effect of various metal ions on 1-FFT enzymatic activity

2.5 底物濃度對(duì)1-FFT活力的影響及米氏常數(shù)

由圖6可知,隨著1-蔗果三糖濃度的增加,1-FFT活力也在升高,當(dāng)?shù)孜餄舛仍?.02～0.06 mol/L時(shí),酶活力增長(zhǎng)緩慢;當(dāng)三糖濃度高于0.12 mol/L時(shí),酶活力增長(zhǎng)迅速。反應(yīng)速率與底物濃度之間的關(guān)系可用米氏方程來(lái)描述:v=Vmax·[S]/(Km+[S])。根據(jù)雙倒數(shù)法所得直線在橫軸和縱軸的截距(圖7),可分別求得Km=0.6977 mol/L,Vmax=116.23 μg/h。米氏常數(shù)反映了酶與底物結(jié)合及解離的能力,Km越小說(shuō)明底物與酶的親和力越強(qiáng)。

圖6 底物濃度對(duì)大蒜1-FFT活力的影響Fig.6 Effect of substrate concentration on the activity of 1-FFT

圖7 大蒜1-FFT米氏常數(shù)的測(cè)定Fig.7 Determination of Michaelis constant of 1-FFT in garlic

3 結(jié)論

通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)1-FFT進(jìn)行分離,經(jīng)透析后酶液與其底物1-蔗果三糖反應(yīng),采用HPLC-ELSD法測(cè)定其在不同條件下合成產(chǎn)物蔗果四糖的濃度以研究其酶學(xué)特性。1-FFT主要存在于40%～50%硫酸銨部分;其最適pH為6.0,在pH 5.5～6.5條件下1 h內(nèi)保持穩(wěn)定;最適溫度為25 ℃,在15～25 ℃條件下1 h內(nèi)可保持穩(wěn)定;低濃度Mn2+、Mg2+、Fe3+促進(jìn)1-FFT活力,Cu2+、Zn2+、Ag+抑制1-FFT活力;1-FFT活力隨底物濃度升高而增大,其米氏常數(shù)Km=0.6977 mol/L,最大反應(yīng)速率Vmax=116.23 μg/h。本文結(jié)果為揭示大蒜中果聚糖的代謝規(guī)律,為進(jìn)一步闡明大蒜在采后貯藏、保鮮及深加工過(guò)程中果聚糖含量的變化提供理論依據(jù),為探索調(diào)控大蒜果聚糖代謝、保持大蒜品質(zhì)及延長(zhǎng)大蒜貯藏期奠定基礎(chǔ)。

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Characteristics of fructan∶fructan 1-fructosyltransferase in garlic

YU Jia-xin,DUAN Han-ying,WEN Ming,HUANG Xue-song*

(Department of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,China)

Fructans account for the majority of dry weight of garlic bulbs,which possess various health benefits. Characteristics of fructan:fructan 1-fructosyltransferase(1-FFT)in garlic was investigated to illustrate the changes of fructans in garlic during storage and processing. The results showed that only 1,1-Kestotetraose was produced by 1-FFT when 1-Kestose was used as the substrate. 1-FFT mainly existed in the 40%～50% ammonium sulfate fraction. The optimum pH of 1-FFT was 6.0,1-FFT was stable in a range of pH 5.5～6.5 for 1 h. The optimum temperature was 25 ℃,1-FFT was stable at 15～25 ℃ for 1 h. 1-FFT was activated by low concentration of Mn2+,Mg2+and Fe3+,inhibited by Cu2+,Zn2+and Ag+. Enzymatic activity was increased with the ascending concentration of substrate,andKmwas 0.6977 mol/L,Vmaxwas 116.23 μg/h. Enzymatic activity of 1-FFT was affected by temperature,pH,various metal ions and substrate concentration,regulating those influence factors could regulate the metabolism of garlic fructan and prolong the storage of fresh garlic.

garlic;fructan;1-kestose;fructan:fructan 1-fructosyltransferase;enzymologic characteristics

2016-11-28

喻嘉鑫(1993-)，男，碩士研究生，研究方向：功能食品，E-mail:yujx39@163.com。

*通訊作者:黃雪松(1957-)，男，博士，教授，研究方向：功能食品，E-mail:thxs@jnu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471595)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)10-0158-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.022