刺五加黑木耳酸性多糖化學(xué)組成及免疫活性研究

張 穎,曾 艷,邱廣君,郁 彭,孫媛霞,張 穎,*

(1.天津科技大學(xué),天津 300457;2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,天津 300308;3.黑龍江國譽(yù)生物科技發(fā)展股份有限公司,黑龍江牡丹江 158200)

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刺五加黑木耳酸性多糖化學(xué)組成及免疫活性研究

張 穎1,2,曾 艷2,邱廣君3,郁 彭1,孫媛霞2,張 穎2,*

(1.天津科技大學(xué),天津 300457;2.中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所,天津 300308;3.黑龍江國譽(yù)生物科技發(fā)展股份有限公司,黑龍江牡丹江 158200)

利用離子交換色譜與凝膠色譜純化獲得刺五加黑木耳酸性多糖(EAP),使用高效液相色譜(HPLC)、傅里葉紅外光譜(FT-IR)等方法分析其組成結(jié)構(gòu);通過噻唑藍(lán)(MTT)實(shí)驗(yàn)、Griess法及酶聯(lián)免疫吸附法測定一氧化氮(NO)釋放量和 IL-6、IL-10、TNF-α等細(xì)胞因子含量,評價(jià)EAP對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明:EAP是一種分子量為925.9 kDa的β型酸性雜多糖,主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖、葡萄糖及半乳糖以摩爾比例64.8∶14.7∶14.2∶3.2∶2.0組成。EAP在50～250 μg/mL濃度下對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7未產(chǎn)生明顯毒性,且可極顯著提高巨噬細(xì)胞的活性(p<0.01);在EAP處理濃度為50 μg/mL時(shí),巨噬細(xì)胞的NO釋放量和細(xì)胞因子IL-10分泌量極顯著提高(p<0.01),分別為17.2 μmol/L和171.5 pg/mL;當(dāng)濃度200 μg/mL時(shí),EAP可極顯著提高TNF-α和IL-6的分泌量(p<0.01)。結(jié)論:刺五加黑木耳酸性多糖具有增強(qiáng)免疫活性的潛力。

酸性多糖,刺五加黑木耳,組成,結(jié)構(gòu),免疫活性

作為一種藥食同源的大型真菌,黑木耳(Auriculariaauricula)含有豐富的膠質(zhì),營養(yǎng)豐富,味道鮮美[1]。黑木耳多糖是其含量最高、最主要的功能性成分,具有抗炎和抑制急性肺損傷[2]、抗凝血[3]、抗氧化[4]、抗輻射[5]、抗癌[6]、降血脂[7]等作用,在醫(yī)藥、食品和保健品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[8-10]。刺五加(Eleutherococcussenticosus)是一種傳統(tǒng)中藥材,具有調(diào)節(jié)機(jī)體紊亂、益氣健脾、補(bǔ)血安神、抗疲勞、改善體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)等功能[11]。利用刺五加莖干作為基料栽培生產(chǎn)的刺五加黑木耳與普通黑木耳相比,單糖組成中半乳糖含量增加,葡萄糖含量下降,抗氧化性增強(qiáng)[12]。然而目前,關(guān)于黑木耳多糖免疫活性的研究報(bào)道甚少。也未見有關(guān)刺五加黑木耳多糖分離純化、結(jié)構(gòu)表征及其免疫活性調(diào)節(jié)作用的研究報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用離子交換色譜和凝膠色譜對刺五加黑木耳酸性多糖(EAP)進(jìn)行分離純化,并通過高效液相色譜、紅外光譜等手段表征多糖結(jié)構(gòu),在此基礎(chǔ)上,通過檢測EAP對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞活力、NO釋放量和細(xì)胞因子分泌量的影響,探討刺五加黑木耳多糖對巨噬細(xì)胞的體外免疫調(diào)節(jié)作用,以期為刺五加黑木耳多糖的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

刺五加黑木耳 黑龍江國譽(yù)生物科技發(fā)展股份有限公司;小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7 天津科技大學(xué)制藥工程實(shí)驗(yàn)室;纖維素酶 Meicelase(6000 U/g) 日本明治制果藥業(yè)株式會社;離子色譜DEAE 650填料 日本Tosoh;凝膠色譜Sepharose 6B填料 瑞士GE公司;TNF-α,IL-6和IL-10酶聯(lián)免疫試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他化學(xué)試劑 美國Sigma公司。

UV-1800紫外分光光度計(jì) 日本島津公司;Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司;Sorvall Evolution RC高速落地離心機(jī) 美國Thermo Scientific公司;IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA集團(tuán);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 河南予華儀器有限公司;FD-1-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Agilent 1200 Series高效液相色譜儀 美國安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 刺五加黑木耳酸性多糖的提取 取干燥粉碎后的黑木耳以1∶40(m/V)的料液比加入蒸餾水,使用HCl調(diào)節(jié)pH為4.0,加入樣品質(zhì)量1%的纖維素酶,在45 ℃酶解2 h,95 ℃滅酶15 min,8000 r/min離心5 min,去除上清液,剩余固體用濃度為1 mol/L NaOH水溶液,在60 ℃下加熱提取2 h,提取結(jié)束后,6000 r/min下離心15 min,取上清液,加入鹽酸中和,透析,減壓濃縮,再加入4倍體積的無水乙醇沉淀,凍干后得到刺五加黑木耳酸性多糖粗品。

1.2.2 刺五加黑木耳酸性多糖分離純化 取醇沉所得粗多糖700 mg溶于蒸餾水,充分溶解后離心,利用離子交換色譜DEAE-650分離純化,經(jīng)0.5 mol/L NaCl洗脫后收集的糖分透析凍干;再經(jīng)凝膠色譜Sepharose 6B進(jìn)一步純化,在0.1 mol/L NaCl洗脫下獲得純化刺五加黑木耳酸性多糖EAP[14]。

1.2.3 刺五加黑木耳酸性多糖分子量測定 采用凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography,GPC)測定分子量。色譜條件:色譜柱:Agilent PL aquagel-OH MIXED-H(300 mm×7.5 mm,8 μm);流動相:0.1 mol/L NaNO3;柱溫:35 ℃;流速:0.6 mL/min;進(jìn)樣體積:20 μL;信號檢測:示差折光檢測器;采集時(shí)間:25 min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:配制2.0 mg/mL的普魯蘭多糖系列標(biāo)準(zhǔn)品(分子量分別為708、642、337、194、107、47.1、21.1、9.6和6.1 kDa)水溶液,使用上述凝膠色譜分析條件采集各標(biāo)準(zhǔn)品譜圖,以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量對數(shù)lgM(y)與保留時(shí)間(x)作圖,并對曲線進(jìn)行回歸擬合,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=-1.53x+20.43(R2=0.9983),用于確定被測樣品中多糖分子質(zhì)量分布。

1.2.4 刺五加黑木耳酸性多糖化學(xué)組成分析

1.2.4.1 總糖含量測定 采用硫酸苯酚法[15]制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,并測定樣品中的總糖含量。以葡萄糖在490 nm吸光度為縱坐標(biāo)(y),葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=9.8326x-0.0182(R2=0.9976)。

1.2.4.2 蛋白質(zhì)含量測定 采用Bradford法[16]制作牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,并測定樣品中的蛋白質(zhì)含量,以牛血清蛋白在595 nm吸光度為縱坐標(biāo)(y),牛血清蛋白濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=0.0082x+0.0223(R2=0.9628)。

1.2.4.3 單糖組成測定 采用柱前PMP(1-苯基-3甲基-5吡唑啉酮)衍生高效液相色譜法分離檢測單糖組成[17],以葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、巖藻糖、阿拉伯糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品;色譜條件:色譜柱:ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:0.1 mol/L磷酸鹽(pH6.8)緩沖液-乙腈(體積比為83∶17)混合超聲;柱溫:30 ℃,紫外檢測波長:248 nm;流速:1 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)品制備:分別稱取0.04 mol的葡萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、巖藻糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸混合溶于10 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中。取50 μL混合標(biāo)準(zhǔn)品,加入50 μL 0.3 mol/L NaOH水溶液,再加入50 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液,70 ℃密閉反應(yīng)60 min,反應(yīng)結(jié)束后,加50 μL的0.3 mol/L HCl中和,加1 mL 0.1 mol/L PBS與1 mL氯仿萃取,收集上層水相,上機(jī)分析。

樣品處理:取2 mg待測樣品,加入1 mL 0.2 mol/L三氟乙酸,在120 ℃金屬浴中,密閉水解120 min,冷卻,N2吹干,加入50 μL 0.3 mol/L NaOH水溶液,再加入50 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液,70 ℃密閉反應(yīng)60 min,反應(yīng)結(jié)束后,加50 μL 0.3 mol/L HCl中和,加1 mL 0.1 mol/L PBS與1 mL氯仿萃取,重復(fù)萃取3～4次,收集上層水相,上機(jī)分析。

表1 EAP的化學(xué)組成Table 1 Chemical composition of EAP

注:-表示未檢出。1.2.5 刺五加黑木耳酸性多糖紅外光譜分析 稱取充分干燥的精制多糖樣品2 mg與150 mg KBr混合研磨后壓片,上機(jī)掃描分析,掃描范圍400～4000 cm-1。

1.2.6 刺五加黑木耳酸性多糖免疫活性測試

1.2.6.1 RAW264.7細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 采用MTT比色法測定刺五加黑木耳酸性多糖對小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞活力的影響。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞吹打均勻后計(jì)數(shù),將細(xì)胞濃度稀釋到5×104個(gè)/mL時(shí),取100 μL加入到96孔板,在37 ℃下,于含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)24 h,移除上清培養(yǎng)基,加入濃度為50、100、150、200、250 μg/mL的EAP樣品,置于含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,加入10 μL MTT(終濃度5 mg/mL),37 ℃孵育4 h,棄去上清,加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO),溶解活細(xì)胞與噻唑鹽(MTT)生成的甲臜,振蕩20 min,以空白培養(yǎng)基為對照,490 nm下測定吸光度A。

細(xì)胞存活率(%)=A樣品/A空白×100

1.2.6.2 NO釋放量測定 采用Griess法測定刺五加黑木耳酸性多糖激活RAW264.7細(xì)胞釋放NO的量。取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞吹打均勻后計(jì)數(shù),將細(xì)胞濃度稀釋到2×106個(gè)/mL時(shí),取100 μL加入到96孔板,在37 ℃條件下,含5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)24 h,移除上清培養(yǎng)基,加入濃度為50～200 μg/mL的待測樣品,以1 μg/mL 脂多糖(LPS)和空白培養(yǎng)基為對照,置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后,吸取50 μL的細(xì)胞上清液與50 μL的Griess試劑(1%的磺胺與0.1%的N-1-萘乙胺鹽酸鹽溶于5%的磷酸)置于室溫反應(yīng)5 min,測定樣品在540 nm的吸光度值,使用NaNO2(10～100 μmol/L)替代樣品與Griess試劑反應(yīng),以體系在540 nm吸光度值為縱坐標(biāo)(y),NaNO2濃度(μmol/L)為橫坐標(biāo)(x)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=0.0041 x+0.0027(R2=0.9995),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞的NO釋放量。

1.2.6.3 細(xì)胞因子分泌量測定 細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-10釋放量測試采用ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒,參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 EAP的提取、分離純化及分子量分布分析

黑木耳細(xì)胞壁較厚[18],因此使用纖維素酶破壁后,再以1 mol/L NaOH水溶液提取酸性多糖,提取率為29.5%。進(jìn)一步使用離子交換色譜和凝膠色譜對多糖進(jìn)行分離純化,得到精制酸性多糖組分EAP,得率為18.2%。由圖1可知,EAP峰形對稱,分子量分布均一,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其分子量大小為925.9 kDa,這與黑木耳多糖分子量在500～2000 kDa的先前報(bào)道相一致[19]。

圖1 EAP的分子量分布Fig.1 Molecular weight distribution of EAP

2.2 EAP多糖組成分析

由表1可知,EAP的糖含量為99.2%(w/w %),不含蛋白質(zhì)。EAP主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖、葡萄糖及半乳糖組成(圖2),各單糖組分的摩爾比為64.8∶14.7∶14.2∶3.2∶2.0(表1)。文獻(xiàn)報(bào)道,糖醛酸含量較高的酸性多糖具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫活性等作用[20-22]。而刺五加黑木耳多糖EAP中葡萄糖醛酸含量為14.7(mol %),甘露糖含量為64.8(mol %),分別高于文獻(xiàn)報(bào)道的中華蘆薈多糖中糖醛酸含量[20]和大黃多糖中甘露糖含量[22]。

圖2 EAP單糖組成分析HPLC譜圖Fig.2 Monsaccharide composition of EAP analysed by HPLC注:1：甘露糖;2：核糖;3：鼠李糖;4：葡萄糖醛酸;5：半乳糖醛酸;6：葡萄糖;7：半乳糖;8：木糖;9：阿拉伯糖;10：巖藻糖。

2.3 EAP紅外光譜分析

如圖3所示,在3475 cm-1的峰是-OH的伸縮振動吸收峰,2937 cm-1是C-H的伸縮振動峰,1136、1103、1060 cm-1的吸收峰表示糖殘基為吡喃糖環(huán)構(gòu)型(呋喃型糖環(huán)在此區(qū)間只有兩個(gè)強(qiáng)吸收峰),在891 cm-1處為β構(gòu)型特征吸收峰,此外,1726 cm-1附近是糖醛酸的吸收峰。進(jìn)一步說明EAP是含有糖醛酸的β型吡喃糖。文獻(xiàn)表明,多糖的生物活性不僅與其分子量大小、單糖組成有關(guān),還與其構(gòu)型密切相關(guān)。一般來說,β構(gòu)型多糖具有較強(qiáng)的生物活性,如β-D-葡聚糖、β(1→4)-D-甘露聚糖等具有抗炎和調(diào)節(jié)免疫活性的能力[23-24]。

圖3 EAP的紅外光譜Fig.3 IR Spectra of EAP

2.4 EAP免疫活性測試

2.4.1 EAP對RAW264.7細(xì)胞活力的影響 巨噬細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)不僅能反映多糖對細(xì)胞是否具有毒性,同時(shí)還能考察多糖對巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的能力[13]。如圖4所示,EAP在50～250 μg/mL濃度下不僅對RAW264.7細(xì)胞無毒性,還能顯著提高細(xì)胞存活率(p<0.01)。因此,根據(jù)這一結(jié)果,確定后續(xù)免疫活性實(shí)驗(yàn)中EAP的處理濃度分別為50、100和200 μg/mL。

圖4 EAP對RAW264.7細(xì)胞活力影響Fig.4 The effect of EAP on the viability of RAW264.7 cells注:與空白相比,*p<0.05,** p<0.01;圖5～圖6同。

2.4.2 EAP對RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響 巨噬細(xì)胞是產(chǎn)生NO的重要免疫細(xì)胞之一,在免疫系統(tǒng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中,NO作為一個(gè)關(guān)鍵介質(zhì),其合成可作為巨噬細(xì)胞被激活的一個(gè)重要標(biāo)志[25]。EAP對RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響見圖5。由圖5可知,在50～200 μg/mL濃度范圍內(nèi),EAP可顯著促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的NO分泌,其中50 μg/mL的多糖時(shí)，NO濃度達(dá)到17.2 μmol/L,NO釋放量與EAP濃度呈劑量依賴性,說明EAP具有免疫調(diào)節(jié)活性。與陽性對照LPS相比,EAP對NO分泌的促進(jìn)作用較小。與此類似,崔石陽等發(fā)現(xiàn)一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的北五味子多糖可提高細(xì)胞的NO分泌水平,但與LPS刺激相比都相去甚遠(yuǎn),有差異顯著性(p<0.05)[26]。

圖5 EAP對RAW264.7細(xì)胞中NO合成的影響Fig.5 Effects of EAP on the NO synthesis of RAW264.7 cells

圖6 EAP對RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響Fig.6 Effects of EAP on cytokine secretion of RAW264.7 cells 注:A為IL-10,B為IL-6,C為TNF-α。

2.4.3 EAP對RAW264.7細(xì)胞IL-6、IL-10和TNF-α分泌量的影響 巨噬細(xì)胞激活被認(rèn)為是治療某些疾病的有效途徑,活化后的巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子,其中TNF-α、IL-6和IL-10是起到免疫和抗炎調(diào)節(jié)的主要細(xì)胞因子。而多糖則通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的免疫活性,從而發(fā)揮其很多有益的藥理活性[18]。如圖6所示,隨著濃度增加,EAP激活小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌TNT-α、IL-6、IL-10細(xì)胞因子的能力增強(qiáng),兩者呈劑量依賴關(guān)系。在50 μg/mL時(shí),EAP顯著促進(jìn)IL-10細(xì)胞因子的分泌量(p<0.01),分泌量為171.5 pg/mL,比空白提高了60%;當(dāng)多糖EAP濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí),對TNT-α和IL-6分泌促進(jìn)作用達(dá)到顯著促進(jìn)水平,且與LPS陽性對照組無明顯差異(p<0.01),這一結(jié)果與付海田等對水溶性蟲草發(fā)酵多糖促進(jìn)細(xì)胞因子分泌報(bào)道結(jié)果相似[27]。

3 結(jié)論

通過提取純化,從刺五加黑木耳得到一種分子量為925.9 kDa、無細(xì)胞毒性的β構(gòu)型酸性雜多糖。其可促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的NO釋放和細(xì)胞因子IL-10、IL-6與TNT-α的分泌(p<0.01),具有良好的免疫提高潛力。相關(guān)結(jié)果是對黑木耳多糖構(gòu)效關(guān)系研究的補(bǔ)充與深入,同時(shí)也為刺五加在黑木耳栽培中的應(yīng)用推廣提供了理論指導(dǎo),為刺五加黑木耳多糖增強(qiáng)免疫類保健食品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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Structural properties and immunostimulatory activity of an acidic polysaccharide fromAuriculariaauricular-judaecultivated onEleutherococcussenticosus

ZHANG Ying1,2,ZENG Yan2,QIU Guang-jun3,YU Peng1,SUN Yuan-xia2,ZHANG Ying2,*

(1.Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China;2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin 300308,China;3.Heilongjiang Guo Yu Biological Science and Technology Development Co.,Ltd.,Mudanjiang 158200,China)

An acidic polysaccharide named EAP fromAuriculariaauricular-judaecultivated onEleutherococcussenticosuswas purified by iron chromatography and gel chromatography. The chemical composition and structure of EAP were analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC)and fourier transform infrared spectoscopy(FT-IR). The immunomodulatory effects of EAP on RAW264.7 macrophage were investigated by determining the production of NO and secretion of cytokines(IL-6,IL-10,and TNF-α). The result showed that EAP was an acidic polysaccharide with a molecular weight of 925.9 kDa and aβconfiguration. It was composed of mannose,glucose,glucuronic acid,xylose and galactose in the mole ratio of 64.8∶14.7∶14.2∶3.2∶2.0. At 50～250 μg/mL,EAP not only was cytotoxic to RAW264.7 cells,but also could significantly promoted the cell viability(p<0.01). The secretion of NO and IL-10 induced by EAP at 50 μg/mL was significantly improved(p<0.01),reached 17.2 μmol/L and 171.5 pg/mL,respectively. Moreover,EPA at 200 μg/mL significantly promoted the secretion of TNF-αand IL-6(p<0.01). It was concluded that the acidic polysaccharide fromAuriculariaauricular-judaecultivated onEleutherococcussenticosushad good potential of immune enhancement.

acid polysaccharide;Auriculariaauricular-judaecultivated onEleutherococcussenticosus;composition;structure;immunostimulatory activity

2016-11-23

張穎(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：食用菌多糖發(fā)酵與功能，E-mail：zhang_y1@tib.cas.cn。

*通訊作者:張穎(1980-)，女，博士，研究方向：食用菌代謝產(chǎn)物，E-mail：yingzhang80@126.com。

863計(jì)劃-天驕(2013AA102102)；天津?qū)ｍ?xiàng)(11ZCZDSY08900)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)10-0119-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.015