魚糜中活潑羰基化合物在膠凝過程中的變化

付湘晉,劉 穎,李忠海,林親錄,Tyre C. Lanier

(1.長沙環(huán)境保護職業(yè)技術學院環(huán)境科學系,湖南長沙 410004;2.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院,湖南長沙 410004;3.北卡州立大學食品生物工程與營養(yǎng)科學系,美國北卡羅來納州,羅利 27695)

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魚糜中活潑羰基化合物在膠凝過程中的變化

付湘晉2,3,劉 穎1,*,李忠海2,林親錄2,Tyre C. Lanier3

(1.長沙環(huán)境保護職業(yè)技術學院環(huán)境科學系,湖南長沙 410004;2.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院,湖南長沙 410004;3.北卡州立大學食品生物工程與營養(yǎng)科學系,美國北卡羅來納州,羅利 27695)

本文采用五氟苯肼原位衍生化-固相微萃取-氣相/質(zhì)譜法檢測了鰱魚魚糜、冷凍魚糜及魚糜凝膠中的三種活潑羰基化合物(RCCs):丙二醛(MDA)、4-羥基-己烯醛(HHE)、4-羥基-壬烯醛(HNE);并采用添加五氟苯肼清除RCCs,阻斷RCCs-蛋白質(zhì)反應,分析魚糜中RCCs對魚糜蛋白膠凝特性的影響。結果表明:新鮮鰱魚糜中MDA(0.42±0.02) mg/kg、HHE(0.21±0.03) mg/kg含量高于HNE(0.07±0.00) mg/kg;冷凍魚糜RCCs含量高于新鮮魚糜,MDA、HHE、HNE含量分別為(1.14±0.03)、(0.86±0.03)、(0.18±0.02) mg/kg。新鮮魚糜加熱膠凝后,各RCC含量均顯著上升(p<0.05),冷凍魚糜加熱膠凝后,各RCC含量均顯著(p<0.05)下降;添加RCCs清除劑阻斷RCCs-蛋白質(zhì)反應后,冷凍魚糜凝膠(40 ℃1 h-90 ℃30 min)強度從(243.52±25.04) g×cm下降到(190.53±20.33) g×cm(p<0.05);所以,RCCs加強了冷凍魚糜凝膠的強度。RCCs對魚糜凝膠的保水性無明顯影響。

魚糜,凝膠,活潑羰基化合物,丙二醛,4-羥基-己烯醛,4-羥基-壬烯醛

活潑羰基化合物(Active carbonyl compounds,RCCs)主要指α,β-不飽和醛、酮醛、二元醛,如丙烯醛(ACR)、4-羥基-己烯醛(HHE)、4-羥基-壬烯醛(HNE)、4-氧代-2-壬烯醛(ONE)、丙二醛(MDA)等,其反應活性非常強,雙鍵能與親核基團(如半胱氨酸的巰基,組氨酸的咪唑基,賴氨酸、精氨酸的氨基等)發(fā)生邁克爾加成反應[1-2],羰基可與游離氨基反應形成希夫堿。在體內(nèi),RCCs引起蛋白質(zhì)結構變化,造起“羰基應激”,與衰老、腫瘤、阿爾茨海默病等均密切相關[3]。在食品中,RCCs引起蛋白質(zhì)氧化,對食品顏色、風味、質(zhì)構、保水性等均有顯著影響,還參與或促進丙烯酰胺、生物胺、雜環(huán)胺等有毒物質(zhì)的產(chǎn)生[4-6]。

肉類食品中RCCs主要源于多不飽和脂肪酸(PUFA)氧化。魚肉富含PUFA,極易氧化產(chǎn)生RCCs。黃條鯡冷藏13 d,HHE從500 μg/kg增加到約2100 μg/kg[7];新鮮的秋刀魚肉中HHE是(1698.8±793.6) μg/kg,在-20 ℃下貯藏3個月增加到6200 μg/kg,12個月增加到12000 μg/kg左右[8]。魚糜中脂肪含量低于魚肉,但冷凍魚糜如果凍藏時間較長,也會發(fā)生明顯的脂肪氧化[9];目前還未見魚糜及冷凍魚糜中RCCs的研究報道。

膠凝是魚糜最主要的功能特性,RCCs影響魚糜凝膠特性。李學鵬等報道,ACR可修飾肌原纖維蛋白致肌原纖維蛋白氧化,當ACR濃度大于0.1 mmol/L時,肌原纖維蛋白的凝膠性質(zhì)劣化,凝膠強度、保水性降低;活性巰基對ACR較為敏感,ACR濃度為0.01 mmol/L時其含量減少了40.8%;電泳表明ACR能使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)[10]。Zhou等報道,MDA誘導肌球蛋白交聯(lián),顯著提高肌球蛋白凝膠強度,MDA含量為10 mmol/L時,凝膠強度升高3～4倍[11]。

上述研究均為模擬體系研究,并未有研究實際體系中RCCs對凝膠特性的影響的報道。本論文在魚糜中添加RCCs清除劑五氟苯肼,阻斷RCCs-蛋白質(zhì)反應,以期能間接反映魚糜中RCCs對魚糜膠凝特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鰱魚肉 約3 kg/尾,2016年1月捕撈自當?shù)爻靥?捕撈后1 h內(nèi)人工宰殺、去頭、去皮、去內(nèi)臟,清洗干凈,冰藏,12 h內(nèi)冰藏運送至實驗室采肉,進行魚糜加工;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、五氟苯肼、1,1,3,3-四甲氧基丙烷 美國Sigma-Aldrich，分析純;4-羥基-己烯醛(HHE)、4-羥基-壬烯醛(HNE) 美國Cayman Chemicals，分析純;其他試劑 均為分析純。

TA.XT Plus質(zhì)構儀 英國SMSTA;Agilent 7890A GC氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫,配5975C質(zhì)譜檢測器,HP-5MS毛細管柱30 m× 250 μm(i.d.)× 0.25 μm;固相微萃取頭(涂層為聚二甲基硅氧烷,PDMS) Gerstel(Linthicum,MD,USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚糜的制備 新鮮鰱魚魚肉加入3倍冷水(4 ℃),攪拌后靜置5 min,將上層水倒出,然后用紗布擠壓脫水;漂洗3次,最后一次采用0.5%的冷食鹽水漂洗。添加6%蔗糖、0.3%多聚磷酸鈉,混勻,即得魚糜[12]。

采用-18 ℃凍藏3個月的冷凍魚糜為樣品,研究凍藏對魚糜中RCCs的影響。

1.2.2 魚糜膠凝的制備 將魚糜在1500 r/min下擂潰,空擂2 min后加冰調(diào)整最終水分含量至78%,加入3%食鹽鹽擂4 min;整個過程保持物料溫度在10 ℃以下[13]。

擂潰時在魚糜中添加2 mg/kg五氟苯肼阻斷RCCs-蛋白質(zhì)反應,與未加五氟苯肼的魚糜凝膠比較凝膠強度、凝膠保水性,分析RCCs對凝膠特性的影響。

擂潰好的魚糜灌裝到不銹鋼管(20 mm×150 mm)中,采用水浴加熱,3個加熱程序:40 ℃ 1 h-90 ℃ 30 min;60 ℃ 30 min-90 ℃ 30 min;90 ℃ 30 min;分別記為G40、G60、G90。加熱后,立即自來水冷卻,冷卻至室溫后,于4 ℃靜置12 h;再室溫靜置2 h,測定凝膠強度、保水性[12]。

1.2.3 RCCs的測定 主要檢測的RCCs包括MDA、HHE、HNE。參考Ruan等的方法[14],以五氟苯肼為衍生化試劑,采用固相微萃取-氣相/質(zhì)譜法(SPME-GC/MS)檢測,外標法定量。

1.2.3.1 樣品的前處理 將魚糜及魚糜凝膠絞碎,取絞碎樣品(1±0.05) g,置于10 mL樣品瓶,加5 mL蒸餾水,3.5 mL KH2PO4緩沖液(0.5 mol/L,pH4),BHT(1 mmol/L,200 μL),再加200 μL五氟苯肼(5 mg/mL)溶液,漩渦混勻10 min,用固相微萃取纖維插入式吸附60 min(室溫)。

1.2.3.2 GC-MS參數(shù) 柱溫程序50 ℃保溫0.5 min,25 ℃/min升溫至 150 ℃,再30 ℃/min至280 ℃;載氣,氦氣(99.999%),1.2 mL/min;電離方式EI,電離電壓70 eV,燈絲發(fā)射電流為200 μA,離子源溫度為200 ℃,接口溫度300 ℃,掃描質(zhì)量范圍為33～450 amu。

1.2.4 凝膠強度測定 把凝膠切成25 mm 厚,用質(zhì)構儀測定凝膠破斷強度(g)和凝膠形變距離(cm),金屬球形探頭S 0.5(直徑為5 mm),探頭下降速度為6 cm/min[15]。凝膠強度按公式(1)計算:

凝膠強度(g×cm)=凝膠破斷強度(g)×凝膠破斷形變(cm)

式(1)

1.2.5 凝膠保水性(WHC)測定 取加熱制備好的魚糜凝膠2～3 g,稱重W1,室溫下5000×g離心10 min,棄去水分,稱重W2[16],按公式(2)計算保水性(WHC):

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗重復3次。用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)的顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 新鮮魚糜膠凝過程中RCCs的變化

新鮮魚糜及凝膠中幾種主要RCCs的含量見表1。新鮮鰱魚糜中MDA含量為(0.42±0.02) mg/kg、HHE為(0.21±0.03) mg/kg,含量均高于HNE(0.07±0.00) mg/kg,這是因為鰱魚糜中ω-3 PUFA含量較高,HHE源自ω-3 PUFA氧化,而HNE源自ω-6 PUFA氧化[7-8]。加熱膠凝后,各RCCs含量均有所上升,其中G40上升顯著(p<0.05),MDA、HHE、HNE均上升了約50%,可能是因為G40受熱時間最長,脂肪氧化最嚴重[17]。

表1 新鮮魚糜及其凝膠中RCCs的含量Table 1 The content of RCCs in fresh surimi and its gel

注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標準偏差,n=3,a～b同列中數(shù)據(jù)的上標字母不同代表有顯著差異(p<0.05)。表2～表4同。

2.2 冷凍魚糜膠凝過程中RCCs的變化

冷凍魚糜及凝膠中幾種主要RCCs的含量見表2。與新鮮魚糜類似,冷凍魚糜中MDA(1.14±0.03) mg/kg、HHE(0.86±0.03) mg/kg含量高于HNE(0.18±0.02) mg/kg。與新鮮魚糜(表1)相比,冷凍魚糜RCCs含量顯著增加(p<0.05),MDA、HHE、HNE分別增加了170%、410%、257%;這是因為冷凍魚糜雖然在-20 ℃凍藏,但PUFA仍在緩慢氧化[9]。

表3 RCCs對魚糜凝膠強度(g×cm)的影響Table 3 The effect of RCCs on the gel strength(g×cm)

注:A～B同行中數(shù)據(jù)的上標字母不同代表有顯著差異(p<0.05)。表4同。

表4 RCCs對魚糜凝膠保水性的影響Table 4 The effect of RCCs on the WHC of gel

加熱膠凝后,各RCCs含量均顯著(p<0.05)下降,其中90 ℃加熱膠凝的凝膠(G90)RCCs的含量下降最明顯,MDA、HHE、HNE均下降約50%;這一點與新鮮魚糜膠凝中RCCs變化完全不同,新鮮魚糜膠凝后,各RCCs含量增加。

表2 冷凍魚糜(-18 ℃、3個月)及其凝膠中RCCs的含量Table 2 The content of RCCs in frozen surimi(-18 ℃,3 month)and its gel

冷凍魚糜膠凝后,其RCCs含量降低是本論文的新發(fā)現(xiàn)。魚糜凝膠中檢測到的RCCs含量取決于PUFA氧化生成RCCs的量及與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)反應消耗的RCCs的量[18]。本文測定結果表明,新鮮魚糜膠凝過程中,RCCs生成量高于消減量,所以凝膠中檢測到的RCCs含量高于魚糜中RCCs含量。冷凍魚糜則相反,凍藏后,RCCs已經(jīng)累積較多;加熱膠凝時,RCCs與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)反應消耗的量高于這個過程中PUFA氧化產(chǎn)生的RCCs,所以凝膠中RCCs檢測量低于冷凍魚糜。所以,冷凍魚糜膠凝過程中,有大量RCCs與氨基酸、肽、蛋白質(zhì)發(fā)生了反應。

2.3 RCCs對魚糜凝膠強度的影響

魚糜凝膠強度測定結果見表3。G40加熱凝膠的強度最高,因為內(nèi)源轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶促進蛋白交聯(lián);G60加熱凝膠的強度最低,因為內(nèi)源熱穩(wěn)定組織蛋白酶造成肌原纖維蛋白降解;這與已有的報道一致[19-20]。冷凍魚糜凝膠與新鮮魚糜凝膠相比,凝膠強度顯著下降(p<0.05),這與蛋白質(zhì)冷凍變性有關[21]。五氟苯肼對新鮮魚糜凝膠沒有顯著影響,但冷凍魚糜凝膠G40、G90的強度顯著降低(p<0.05),G40、G90分別下降約20%、16%。

RCCs-蛋白質(zhì)反應對凝膠強度的影響可歸納為兩個方面:與蛋白質(zhì)-SH反應則減少凝膠中S-S鍵交聯(lián),造成凝膠強度下降[22-23];RCCs有兩個活性基團,如果分別與不同的蛋白質(zhì)分子加合,則造成蛋白質(zhì)交聯(lián),增強凝膠強度[11,24]。添加RCCs清除劑對新鮮魚糜凝膠強度影響不大,但顯著降低冷凍魚糜凝膠的強度(表3),這是本論文的新發(fā)現(xiàn)。添加五氟苯肼后,RCCs被清除,RCCs參與的蛋白質(zhì)交聯(lián)反應被阻斷,凝膠中蛋白質(zhì)交聯(lián)減少,凝膠強度下降;結合魚糜及凝膠中RCCs含量變化(表1、表2),冷凍魚糜中發(fā)生的RCCs-蛋白質(zhì)反應多于新鮮魚糜,所以添加RCCs清除劑對冷凍魚糜的影響更大。

2.4 RCCs對魚糜凝膠保水性的影響

魚糜凝膠保水性測定結果見表4。G60加熱凝膠的保水性最差,顯著低于其他兩種加熱模式(p<0.05);G40和G90加熱凝膠的保水性之間無顯著差異;冷凍魚糜凝膠的保水性顯著低于新鮮魚糜凝膠(p<0.05);這些與文獻報道一致[12-13]。添加五氟苯肼對魚糜凝膠保水性無顯著影響。魚糜凝膠的保水性主要由兩方面決定:凝膠超微結構,超微結構越致密、均勻,凝膠保水性越好,同時,凝膠強度也越高;蛋白質(zhì)親水-疏水特性,蛋白質(zhì)親水性與凝膠保水性正相關[13,25]。本文測定結果表明,魚糜凝膠保水性與凝膠強度(表3)變化趨勢基本一致。模擬體系研究結果表明,少量RCCs對凝膠保水性無明顯影響,而高含量RCCs顯著降低凝膠保水性[10-11]。所以,五氟苯肼對魚糜凝膠保水性無顯著影響可能是因為冷凍魚糜中RCCs的含量較低。

3 結論

白鰱魚魚糜及冷凍魚糜中MDA、HHE含量高于HNE含量,與新鮮魚糜相比冷凍魚糜三種RCCs含量均顯著增加(p<0.05)。冷凍魚糜膠凝后,G90中RCCs含量減少最多,約為50%;添加五氟苯肼,清除RCCs,阻斷RCCs-蛋白質(zhì)反應,冷凍魚糜凝膠G40的強度下降約20%;這表明RCCs參與了魚糜膠凝反應,促進了冷凍魚糜蛋白質(zhì)交聯(lián)。而添加五氟苯肼對魚糜凝膠保水性無顯著影響。

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Effect of gelling on the active carbonyl compounds in surimi

FU Xiang-jin2,3,LIU Ying1,*,LI Zhong-hai2,LIN Qin-lu2,TYRE C. Lanier3

(1.Department of Environmental Science,Changsha Environmental Protectionl College,Changsha 410004,China；2.College of food Science and Engineering,Central South University of Forestry and Technology,Changsha 410004,China；3.Department of Food Bio Processing,and Nutrition Sciences,NC State University,Raleigh 27695,USA)

Three kinds of active carbonyl compounds(RCCs),malondialdehyde(MDA),4-hydroxy-2-hexenal(HHE),and 4-hydroxy-2-nonenal(HNE)in silver carp surimi and gel were determined using situ derivatization-SPME-GC-MS and the pentafluorophenyl hydrazine was the derivative agent. Furthermore,by adding pentafluorophenyl hydrazine to block RCCs-protein reaction,the effect of RCCs on surimi gel was analyzed. The content of MDA(0.42± 0.02) mg/kg,HHE(0.21±0.03) mg/kg were higher than HNE(0.07±0.00) mg/kg in fresh silver carp surimi. The content of MDA,HHE,HNE in frozen surimi were(1.14±0.03),(0.86±0.03),and(0.18±0.02) mg/kg,respectively,which were higher than that in fresh surimi. For gel from fresh surimi,because of heating,RCC content significantly increased(p<0.05),however,for gel from frozen surimi,RCC content significantly(p<0.05)decreased. RCCs had no effect on gel strength of fresh surimi,however,after adding RCCs blockers,gel strength of frozen surimi(40 ℃,1 h-90 ℃,30 min)decreased from(243.52±25.04) g×cm to(190.53±20.33) g×cm(p<0.05),so RCCs helped to enhance the gel strength of frozen surimi. RCCs had no significant effect on water holding capability of surimi gel.

surimi;gel;active carbonyl compounds;malondialdehyde;4-hydroxy-2-hexenal;4-hydroxy-2-nonenal

2016-09-19

付湘晉(1980-)，男，博士，副教授，主要從事水產(chǎn)品深加工及食品安全方面的研究，E-mail:drxjfu@163.com。

*通訊作者:劉穎(1980-)，女，碩士，講師，主要從事食品深加工方面的研究，E-mail：314721423@qq.com。

國家留學基金(201408430270)；湖南省2011協(xié)同創(chuàng)新中心(湘教通[2013]448號)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)10-0072-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.006