牛奶中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑
——舒巴坦直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的分析研究

沙芳芳,劉衛(wèi)華,王 敬,于文龍,王向紅

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071001)

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牛奶中β-內(nèi)酰胺酶抑制劑
——舒巴坦直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的分析研究

沙芳芳,劉衛(wèi)華,王 敬,于文龍,王向紅*

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071001)

建立代表性的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑-舒巴坦直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析法(dcELISA)。通過(guò)對(duì)封閉液濃度、離子濃度、pH、包被條件等分析條件優(yōu)化后建立dcELISA,并進(jìn)行應(yīng)用。結(jié)果表明方法的IC50為5.25 ng/mL,IC15為1.07×10-3ng/mL,板內(nèi)和板間平均變異系數(shù)分別為6.69%、9.02%,對(duì)他唑巴坦和克拉維酸的交叉反應(yīng)率分別是7.12%、0.93%。牛奶樣品的添加回收率在85.66%～89.23%之間。該方法靈敏度較高,穩(wěn)定性較好,特異性較強(qiáng),可以應(yīng)用于乳制品中舒巴坦殘留的快速檢測(cè)。

舒巴坦,直接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法,檢測(cè)方法

舒巴坦(sulbactam,SBT),又稱青霉烷砜酸,是一種競(jìng)爭(zhēng)性不可逆的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑,對(duì)革蘭氏陽(yáng)性和陰性菌產(chǎn)生的大多數(shù)β-內(nèi)酰胺酶有較強(qiáng)的抑制作用[1]。已有研究證明,舒巴坦可引起乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶和轉(zhuǎn)氨酶的升高,還可能引起過(guò)敏反應(yīng),并能透過(guò)胎盤到達(dá)胎兒體內(nèi),危害健康[2-3]。

我國(guó)非常重視食品安全,農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告[4]對(duì)乳品中抗生素殘留作出了嚴(yán)格規(guī)定。一些不法分子為了逃避抗生素檢測(cè),在乳品中加入β-內(nèi)酰胺酶分解殘留的抗生素。因此,國(guó)家在“打擊非法添加非食用物質(zhì)和濫用食品添加劑”專項(xiàng)整治行動(dòng)中,將β-內(nèi)酰胺酶列為非食用物質(zhì)且禁止在食品中添加。某些商家又為了逃避β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè),將舒巴坦添加到乳品中,使β-內(nèi)酰胺酶失去活性,不能被檢出[5-6],給乳品埋下安全隱患,嚴(yán)重威脅消費(fèi)者的身體健康。

國(guó)內(nèi)外常用的舒巴坦檢測(cè)方法主要有分光光度法[7-8]、高效液相色譜(HPLC)[9-12]、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)[13-15]。姜紅[16]等人采用分光光度法測(cè)定注射用頭孢哌酮鈉和舒巴坦鈉的含量。該方法靈敏度較低,且多用于藥物中舒巴坦的測(cè)定。林欽[17]利用高效液相色譜同時(shí)測(cè)定乳制品中的克拉維酸、他唑巴坦和舒巴坦。張立[18]等人利用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中的β-內(nèi)酰胺類抗生素(頭孢噻肟、頭孢哌酮)和其酶抑制劑(舒巴坦、他唑巴坦)。這些儀器分析方法樣品前處理復(fù)雜,所需儀器昂貴,對(duì)操作人員要求較高,不適用于現(xiàn)場(chǎng)大批量樣品的快速檢測(cè)[19]?，F(xiàn)階段,關(guān)于牛奶中舒巴坦檢測(cè)的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)還未見(jiàn)報(bào)道。基于抗原抗體特異性反應(yīng)建立的酶聯(lián)免疫分析法,靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備[20],適用于現(xiàn)場(chǎng)大通量樣品的檢測(cè),在我國(guó)有非常廣泛的應(yīng)用前景。而與間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA相比,直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟,縮短了檢測(cè)時(shí)間,在實(shí)際應(yīng)用中具有顯著優(yōu)勢(shì)。

本研究旨在建立一種直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法,用于牛奶中舒巴坦的快速檢測(cè),以期為乳品安全提供更有效的保障,切實(shí)保障消費(fèi)者的身體健康。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

舒巴坦(SBT)、辣根過(guò)氧化酶(HRP) 上海源葉科技有限公司;牛血清白蛋白(BSA)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB) Sigma公司;抗SBT多克隆抗體 本實(shí)驗(yàn)室自制;96孔酶標(biāo)板 美國(guó)Costar;NaNO2、Na2CO3、NaHCO3、NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl(分析純) 天津市科密歐試劑有限公司;免疫動(dòng)物 雄性新西蘭大耳白(10周齡),1.5～2.0 kg。

酶標(biāo)儀、洗板機(jī) 美國(guó)Thermo公司;八道微量可調(diào)移液槍 德國(guó)eppendorf公司;電子感量分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司;MS3 digital渦旋混勻器 德國(guó)IKA公司;pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司;TDL-5冷凍離心機(jī) 上海Anke;電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 緩沖溶液的配制

1.2.1.1 包被緩沖液(CBS,pH=9.6) 準(zhǔn)確稱取1.6 g Na2CO3與2.9 g Na3HCO3,加雙蒸水至1000 mL,調(diào)節(jié)pH至9.6。

1.2.1.2 磷酸鹽緩沖液(5×PBS) 準(zhǔn)確稱取NaCl 45 g,Na2HPO4·12H2O 68.8 g,NaH2PO4·2H2O 8.97 g,加雙蒸水至1000 mL,并調(diào)節(jié)pH至7.4。

1.2.1.3 洗滌液(PBST) 取200 mL 5×PBS緩沖溶液,雙蒸水800 mL,10% Tween-20 5 mL,充分混勻后待用。

1.2.1.4 封閉液 5%(w/v)的BSA/PBS溶液。

1.2.1.5 底物液 為3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)-過(guò)氧化氫脲溶液,配制方法如下:

底物A:取β-糊精0.25 g,無(wú)水醋酸鈉0.82 g,過(guò)氧化氫脲 42.86 mg,加雙蒸水至100 mL,檸檬酸調(diào)節(jié)pH至5.0,4 ℃保存,使用時(shí)需恢復(fù)室溫;

底物B:取3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺100 mg溶于10 mL二甲基亞砜;

使用前15 min,將底物A與底物B進(jìn)行混合。

1.2.1.6 終止液 1.25 mol/L硫酸。

1.2.2 動(dòng)物免疫程序 選取10周齡左右,體重為2 kg左右的新西蘭大耳白兔,在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中飼養(yǎng)。觀察一周之后,確定身體狀況正常后進(jìn)行免疫。分別采取多點(diǎn)皮下和大腿肌肉注射法進(jìn)行免疫。初次免疫人工抗原的量均是1 mg/只,分別于初次免疫后2、4、6、8周進(jìn)行加強(qiáng)免疫。第二、三、四、五次加強(qiáng)免疫完后10 d,兔子耳緣靜脈取血后進(jìn)行抗血清效價(jià)與特異性的測(cè)定。第五次加強(qiáng)免疫后10 d進(jìn)行心臟取全血,4 ℃離心15 min,收集全部血清。

1.2.3 抗體的純化 采用Protein A-Sephaorse 4B親和層析法對(duì)抗體進(jìn)行純化。以1×PBS為空白,在280 nm處測(cè)吸光度值,計(jì)算抗體濃度。

1.2.4 ELISA操作步驟 包被:用CBS稀釋抗血清,4 ℃包被過(guò)夜;封閉:PBST洗板3次,加入封閉液,37 ℃封閉1 h;加樣:PBST洗板3次,用1×PBS將SBT標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成10000、1000、10、1、0.01、0.0001 ng/mL,50 μL/well,再加入50 μL稀釋到最佳倍數(shù)的酶標(biāo)抗原,并設(shè)空白和陰性對(duì)照,37 ℃孵育1 h;顯色:PBST洗板5次,加入TMB顯色劑,37 ℃顯色30 min;終止:加入終止液,用酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)定OD值。

1.2.5 直接ELISA反應(yīng)體系條件的優(yōu)化

1.2.5.1 抗SBT抗體與酶標(biāo)抗原最佳工作濃度的確定 采用矩陣法確定直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的抗SBT抗體與酶標(biāo)抗原最佳工作濃度。用1×PBS將初始濃度為653.55 μg/mL的抗體依次稀釋為16、14、12、10、8、6、4、0 μg/mL,加入96孔酶標(biāo)板,4 ℃包被過(guò)夜;PBST洗板3次,加入封閉液,37 ℃封閉1 h;PBST洗板3次,加入用PBS梯度稀釋的酶標(biāo)抗原,37 ℃孵育1 h;PBST洗板5次,加入TMB顯色劑,37 ℃顯色30 min;加入終止液,用酶標(biāo)儀在450 nm下測(cè)定OD值,以O(shè)D值為1.0左右確定抗SBT抗體與酶標(biāo)抗原最佳工作濃度。

1.2.5.2 封閉液濃度的優(yōu)化 將抗SBT抗體稀釋至最佳工作濃度,包被過(guò)夜;采用不同濃度(0%、2.5%、5%、10%)的牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽緩沖液進(jìn)行封閉,再依次進(jìn)行加樣、顯色和終止步驟。選擇OD為1.0左右,靈敏度高的封閉液濃度作為最佳條件。

1.2.5.3 離子濃度的優(yōu)化 將抗SBT抗體稀釋至最佳工作濃度,包被過(guò)夜;用最適濃度的牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽緩沖液進(jìn)行封閉;采用不同的離子強(qiáng)度(雙蒸水、1×PBS、2×PBS、3×PBS、4×PBS、5×PBS)稀釋SBT標(biāo)準(zhǔn)品后,進(jìn)行加樣,顯色和終止步驟。選擇OD為1.0左右,靈敏度高的離子濃度作為最佳條件。

1.2.5.4 pH的優(yōu)化 將抗SBT抗體稀釋至最佳工作濃度,包被過(guò)夜;用最適濃度的牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽緩沖液進(jìn)行封閉;采用不同pH的磷酸鹽緩沖液(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)稀釋SBT標(biāo)準(zhǔn)品后,進(jìn)行加樣,顯色和終止步驟。選擇OD為1.0左右,靈敏度高的pH作為最佳條件。

表1 SBT抗體與酶標(biāo)抗原稀釋度的確定Table 1 The optimum concentration of SBT antibody and enzyme labeled antigens

1.2.5.5 包被條件的確定 將抗SBT抗體稀釋至最佳工作濃度,采用不同的條件(4 ℃過(guò)夜、37 ℃孵育1 h、37 ℃孵育2 h)進(jìn)行包被;用最適濃度的牛血清白蛋白(BSA)磷酸鹽緩沖液進(jìn)行封閉;采用最適pH的磷酸鹽緩沖液稀釋SBT標(biāo)準(zhǔn)品后,進(jìn)行加樣,顯色和終止步驟。選擇OD為1.0左右,靈敏度高的包被條件作為最佳條件。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 在最優(yōu)工作條件下,將SBT標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為10000、1000、10、1、0.01、0.0001 ng/mL,采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法,以SBT濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)X,抑制率為縱坐標(biāo)Y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并確定其靈敏度(IC50)、最低檢測(cè)限(IC15)以及線性檢測(cè)范圍。抑制率計(jì)算公式如下:

式(1)

1.2.7 抗體特異性與精密度

1.2.7.1 特異性 他唑巴坦、克拉維酸與SBT都屬于β-內(nèi)酰胺酶的抑制劑,三者結(jié)構(gòu)相近。將他唑巴坦、克拉維酸配成不同質(zhì)量濃度的溶液作為待測(cè)樣品,采用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè),按式(2)計(jì)算交叉反應(yīng)率。

式(2)

1.2.7.2 精密度 對(duì)建立的ELISA方法進(jìn)行板內(nèi)與板間變異系數(shù)的分析測(cè)定。板內(nèi)和板間變異系數(shù)分別是同一包被批次與不同包被批次的SBT標(biāo)準(zhǔn)曲線的變異系數(shù)。

1.2.8 樣品的檢測(cè)

1.2.8.1 樣品的前處理 準(zhǔn)確稱取牛奶樣品15 g,加入5 mL三氯醋酸(TCA,300 g/L),高速渦旋5 min后,于5000 r/min離心15 min,取上清液,加入NaOH調(diào)節(jié)pH到7.0。將牛奶樣品處理后所得的上清液,用1×PBS分別進(jìn)行0倍、10倍、20倍、40倍、80倍稀釋后,繪制基質(zhì)曲線,再與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對(duì)比,以考察樣品基質(zhì)的影響。

1.2.8.2 添加回收率測(cè)定 向空白牛奶中分別添加25、50、100 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品,按照1.2.7.1方法進(jìn)行樣品處理,dcELISA測(cè)定樣品中SBT濃度,每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù),計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 直接ELISA反應(yīng)體系條件的優(yōu)化

2.1.1 SBT抗體與酶標(biāo)抗原最適工作濃度 通過(guò)方陣法選擇OD值為1.0左右的SBT抗體包被質(zhì)量濃度與酶標(biāo)抗原的稀釋度為最佳工作濃度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1:

由表1可知,包被抗體的最適質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL,酶標(biāo)抗原最佳稀釋倍數(shù)為400。

2.1.2 封閉液濃度的優(yōu)化 由圖1可以看出隨著封閉液濃度的增加,OD值降低,后期逐漸平穩(wěn)。這主要是因?yàn)?隨著封閉液濃度的增加,游離的結(jié)合位點(diǎn)逐漸減少,則結(jié)合的酶標(biāo)抗原也相應(yīng)減少;當(dāng)封閉液能夠完全封閉酶標(biāo)板上的結(jié)合位點(diǎn)后,則酶標(biāo)抗原也不會(huì)與板上的位點(diǎn)結(jié)合,此時(shí)再增加封閉液的濃度,OD值也不減少。當(dāng)封閉液濃度達(dá)到5%時(shí),OD值基本穩(wěn)定在1.0左右,且IC50與封閉液濃度為10%時(shí)相差不大,所以選擇5%的BSA作為封閉液。

圖1 封閉液濃度的優(yōu)化Fig.1 The selection experiment of blocking solution concentration

2.1.3 離子濃度的優(yōu)化 在選定的條件下,比較了雙蒸水、1×PBS、2×PBS、3×PBS、4×PBS、5×PBS對(duì)ELISA反應(yīng)體系的影響。由圖2可以看出OD值隨著離子濃度的增加逐漸減小。當(dāng)離子濃度是1×PBS時(shí),OD值在1.0左右,且IC50最低,故選擇1×PBS作為最適工作濃度。

圖2 離子濃度的優(yōu)化Fig.2 The optimization of ion concentration

2.1.4 pH的優(yōu)化 在選定的條件下,比較了不同pH緩沖液對(duì)ELISA反應(yīng)體系的影響,為后續(xù)樣品的測(cè)定條件提供借鑒。由圖3看出,隨著pH的升高OD逐漸降低;而IC50先降低,于過(guò)堿的條件下又升高。當(dāng)緩沖液pH為7.5時(shí),OD為1.0左右,且IC50最低,所以選擇7.5為最佳反應(yīng)條件。

圖3 pH的優(yōu)化Fig.3 The optimization of pH value

2.1.5 包被條件的優(yōu)化 在所確定的條件下,比較了4 ℃過(guò)夜、37 ℃孵育1 h和37 ℃孵育2 h三種包被條件的OD值和IC50。由圖4可以看出,當(dāng)包被條件為4 ℃過(guò)夜時(shí),OD值較大,并且IC50最低,因此選其作為最佳包被條件。

圖4 包被條件的優(yōu)化Fig.4 The optimization of different conditions of coating

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將SBT標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為10000、1000、10、1、0.01、0.0001 ng/mL,在確定的最優(yōu)條件下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并進(jìn)行方程的擬合(見(jiàn)圖5),擬合方程為Y=4.121X+43.17(R2=0.9941),IC50是5.25 ng/mL,IC15可以達(dá)到1.07×10-3ng/mL,靈敏度較高。

圖5 舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合Fig.5 Equation fitting of standard curve for detecting sulbactam

2.3 抗體的特異性

用上述所建立的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)舒巴坦的結(jié)構(gòu)類似物他唑巴坦和克拉維酸進(jìn)行直接競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2)表明,抗體對(duì)他唑巴坦和克拉維酸的交叉反應(yīng)率分別為7.12%、0.93%,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)獲得的抗體具有很高的特異性。

表2 SBT抗體對(duì)他唑巴坦、克拉維酸的交叉反應(yīng)率Table 2 The Cross-reactivity of tazobactam,clavulanic acid

表3 板內(nèi)與板間變異實(shí)驗(yàn)Table 3 Plate variation with inter-assay and intra-assay

2.4 方法的精密度

通過(guò)對(duì)板內(nèi)與板間系數(shù)的分析,確定板內(nèi)變異系數(shù)與板間平均變異系數(shù)分別是6.69%、9.02%。因此,該方法的準(zhǔn)確性比較高,可以滿足食品中SBT檢測(cè)的要求。

2.5 樣品的添加回收率

2.5.1 樣品的基質(zhì)消除 如圖6所示,未經(jīng)稀釋的、稀釋10倍的與稀釋20倍的牛奶樣品上清液的基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線均不能重合,說(shuō)明基質(zhì)影響沒(méi)有消除。而樣品上清液經(jīng)過(guò)40倍稀釋后繪制的基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線均基本吻合,說(shuō)明基質(zhì)影響基本消除。因此,樣品提取液稀釋40倍后可以直接用于dcELISA檢測(cè)。

圖6 牛奶曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較Fig.6 Comparison between curves of SBT in milk and standard curve of SBT

2.5.2 添加回收率 在陰性牛奶樣品中分別添加不同量的SBT標(biāo)準(zhǔn)品,每一濃度重復(fù)5次,求出平均ELISA結(jié)果,計(jì)算添加回收率(見(jiàn)表4)。結(jié)果顯示回收率在85.66%～89.23%之間,變異系數(shù)為1.19%～6.59%。

表4 牛奶的添加回收實(shí)驗(yàn)(n=5)Table 4 Test of recovery in milk(n=5)

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)體系中封閉液濃度、離子濃度、包被條件和pH進(jìn)行優(yōu)化,建立了舒巴坦直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分析方法。該方法的IC50值為5.25 ng/mL,IC15值為1.07×10-3ng/mL,檢測(cè)的線性范圍為0.0001～1000 ng/mL?？贵w與同屬于β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的他唑巴坦和克拉維酸的交叉反應(yīng)率較低,分別為7.12%、0.93%。該方法對(duì)牛奶平均回收率在85.66%～89.23%之間,變異系數(shù)為1.19%～6.59%,靈敏度較高,穩(wěn)定性好,可以應(yīng)用于乳制品中舒巴坦殘留的快速和大批量檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室以此實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),正在進(jìn)行電化學(xué)免疫傳感器的研究,以期可以建立更加靈敏、快速的舒巴坦檢測(cè)方法。

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Research on the direct competition ELISA analysis ofβ-lactamase inhibitor-sulbactam in milk

SHA Fang-fang,LIU Wei-hua,WANG Jing,YU Wen-long,WANG Xiang-hong*

(College of Food Science & Technical,Agricultural University of Hebei,Baoding 071001,China)

The aim of this study was to establish a direct competitive enzyme-linked immunoassay(dc-ELISA)method to detect the representativeβ-lactamase inhibitor-sulbactam in dairy products. After analyzing the condition of blocking solution concentration,ion concentration,coating conditions,pH,and other optimization,this developed method presented an IC50of 5.25 ng/mL,a detection limit IC15of 1.07×10-3ng/mL. Intra-and inter-batch relative standard deviations(RSD)were 6.69%,9.02%,respectively. The cross-reactivity rates for tazobactam and clavulanic acid were 7.12%,0.93%,respectively. The recoveries of milk in spiked samples ranged from 85.66%～89.23%. The developed dcELISA method was satisfied for the the field of mass rapid screen of sulbactam residue in milk samples.

sulbactam;dcELISA;test method

2016-11-08

沙芳芳(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全，E-mail：shp14181514@163.com。

*通訊作者:王向紅(1973-)，博士，教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail:wangxianghong@hebau.edu.cn。

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 (2016YFD0401101)；河北省科技支撐項(xiàng)目(152776120D)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)10-0067-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.005