曾 智 朱志強(qiáng) 易 鳴
科研園地
液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中氯霉素殘留的技術(shù)研究
曾 智 朱志強(qiáng) 易 鳴
氯霉素(Chloroamphenicol,CAP)是一種有效的廣譜抗生素,常用于動(dòng)物各種傳染性疾病的治療,對(duì)多種病原菌有較強(qiáng)的抑制作用,人們經(jīng)常使用氯霉素進(jìn)行水體消毒和防治漁業(yè)病蟲(chóng)害,但由于氯霉素對(duì)人體產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用,是多個(gè)國(guó)家禁止使用的獸用藥物。目前水產(chǎn)品中氯霉素的殘留主要用GB/T20756-2006國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè),本文在此標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化了前處理方法,提高了檢測(cè)效率,并且能夠達(dá)到規(guī)定的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性。具體通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/ MS),多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式(MRM)和同位素內(nèi)標(biāo)法定量,直接對(duì)草魚(yú)、鱖魚(yú)、對(duì)蝦等水產(chǎn)品中的氯霉素進(jìn)行了檢測(cè)。
1.儀器
AB QTRAP4500液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀,配電噴霧離子源(ESI)、勻漿機(jī)、離心機(jī)、超聲波清洗儀、垂直振蕩器、氮吹儀等。
2.材料
草魚(yú)、鱖魚(yú)、對(duì)蝦等水產(chǎn)品,均采自于養(yǎng)殖場(chǎng)和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),去皮去骨去內(nèi)臟取可食部分切碎、混勻、冷凍,作為樣品備用。
3.試劑和藥品
甲醇(色譜純)德國(guó)Merck(默克)公司;乙酸乙酯(分析純)、正己烷(分析純)、氫氧化銨(25%-28%)(分析純)國(guó)藥集團(tuán)。
表1 梯度洗脫液比例
表2 氯霉素(CAP)和氘代氯霉素(CAP-D5)的質(zhì)譜參數(shù)
4.標(biāo)準(zhǔn)品
氯霉素(CAP)標(biāo)準(zhǔn)品德國(guó)Dr公司、氘代氯霉素(CAP-D5)BESTOWN北京振翔科技有限公司。
表3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線
1.色譜條件
色譜柱:Thermo C18柱(1.9μm×2.1mm ×50mm);柱溫40℃;進(jìn)樣量10.0μL;流動(dòng)相乙腈和水,流速0.4mL/min,運(yùn)行時(shí)間6min。
2.質(zhì)譜條件
采用電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式(MRM);霧化器、碰撞器為氮?dú)狻Y|(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。
1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置
氯霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(100.0μg/mL)用甲醇配置,氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間工作液(40.0ng/mL)用水稀釋;氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)使用液(20.0ng/mL)用水稀釋。
準(zhǔn)確量取一定量的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)中間工作液,用水稀釋成濃度為0.10ng/mL、0.25ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/ mL、3.50ng/mL、5.00ng/mL、10.00ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列使用液,氘代氯霉素的濃度均為1.50ng/mL。
2.樣品前處理
樣品的前處理過(guò)程比較重要,直接影響檢測(cè)結(jié)果,提取步驟如下:準(zhǔn)確稱量5.00g勻漿樣品,置于50mL離心管中,加入20ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液75.0μL,加入15mL乙酸乙酯,0.4mL氫氧化銨,垂直振蕩1min,4500轉(zhuǎn)離心5min,取上清液至另一50mL離心管中,重復(fù)提取一次,合并提取液,混勻。取10mL提取液40℃氮吹吹干,加入1.0mL水渦旋,再加入2mL正己烷渦旋30秒,4500轉(zhuǎn)離心5min,棄去上清液,樣液經(jīng)0.22μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后,待上機(jī)分析。
3.樣品加標(biāo)回收率的測(cè)定
準(zhǔn)確稱取氯霉素的陰性樣品5.00g,添加濃度為40.0ng/mL的氯霉素使用液12.5μL、62.5μL、87.5μL共3組,加入濃度為20.0ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液75.0μL,每組5個(gè)平行樣。
表4 氯霉素的添加濃度及其平均回收率的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(n=5)
1.氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線
按上述色譜和質(zhì)譜條件測(cè)定一系列6個(gè)質(zhì)量濃度的氯霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量濃度與內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量濃度之比為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(見(jiàn)表3),線性范圍為0.25-5.00ng/mL,線性方程為y=0.45422x+0.01047,線性相關(guān)系數(shù)為0.99993,定量限為0.10μg/kg,在以實(shí)驗(yàn)所取的0.10-10.00ng/mL之間的8個(gè)點(diǎn)做線性回歸時(shí),當(dāng)用10.00ng/mL作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最大濃度時(shí),低濃度的點(diǎn)偏差較大,高于實(shí)際濃度的50%左右,所以該線性關(guān)系不適用于氯霉素含量高的水產(chǎn)品檢測(cè)。
2.不同水產(chǎn)品中氯霉素含量的檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表4)
氯霉素檢測(cè)的線性范圍為0.25-5.00ng/mL,定量限為0.10μg/kg,在加標(biāo)量為0.10μg/kg、0.50μg/kg、1.00μg/kg時(shí),樣品加標(biāo)回收率均在80%-120%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10.0%。
3.結(jié)論
目前水產(chǎn)品中氯霉素的殘留主要按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T20756-2006進(jìn)行檢測(cè),此方法在實(shí)際操作中操作步驟較為繁瑣,前處理時(shí)間較長(zhǎng),且存在一定的污染風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了前處理方法,用氮吹取代旋蒸,同時(shí)簡(jiǎn)化操作步驟,節(jié)省操作時(shí)間,且檢測(cè)結(jié)果均能滿足檢測(cè)要求,提高了檢測(cè)效率,但本實(shí)驗(yàn)方法也有一定局限性,當(dāng)樣品中氯霉素含量超過(guò)1μg/kg時(shí),線性要求可能無(wú)法滿足,此時(shí)我們可以通過(guò)減少取樣量或增加內(nèi)標(biāo)液的加入量等方法進(jìn)行改善。綜上所述,我們?cè)谝嘿|(zhì)聯(lián)用法測(cè)定水產(chǎn)品中氯霉素殘留時(shí),應(yīng)根據(jù)自己的實(shí)際情況和需求來(lái)選擇適當(dāng)?shù)那疤幚矸椒?,已達(dá)到較好的檢測(cè)效果。
(通聯(lián):430070,農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心·武漢 電話:13971303160)