• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    酮還原酶中立體選擇性還原位點(diǎn)的突變及其產(chǎn)物分析

    2017-06-21 12:28:47李凌凌呂早生左振宇楊忠華劉曜寧宋采薇
    生物技術(shù)通報(bào) 2017年6期
    關(guān)鍵詞:環(huán)己酮突變型還原酶

    李凌凌 呂早生 左振宇 楊忠華 劉曜寧 宋采薇

    (武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,武漢 430081)

    酮還原酶中立體選擇性還原位點(diǎn)的突變及其產(chǎn)物分析

    李凌凌 呂早生 左振宇 楊忠華 劉曜寧 宋采薇

    (武漢科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,武漢 430081)

    為驗(yàn)證糖多孢紅霉菌聚酮合成酶中酮還原酶(EryKR)的LDD模式序列是否為控制2-甲基環(huán)己酮立體選擇性還原的位點(diǎn),構(gòu)建了分別異源表達(dá)聚酮合成酶模塊1的酮還原酶(EryKR1)、模塊2的酮還原酶(EryKR2)、LDD殘基替換為PQQ(LDD→PQQ)的EryKR1及PQQ替換為L(zhǎng)DD(PQQ→LDD)的EryKR2的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21(pET28a-eryKR1)、E.coli BL21(pET28a-eryKR2)、E.coli BL21(pET28a-TeryKR1)和E.coli BL21(pET28a-TeryKR2)。SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)證明,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后4個(gè)重組菌中都表達(dá)出相應(yīng)的酮還原酶。粗酶液的比酶活分別為1.49 U/mg、0.37 U/mg、0.94 U/mg和0.31 U/mg。利用氣相色譜分別檢測(cè)4個(gè)重組菌還原2-甲基環(huán)己酮體系中產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示與野生型EryKR1的還原產(chǎn)物以順式-2-甲基環(huán)己醇為主不同,LDD→PQQ的突變型EryKR1催化2-甲基環(huán)己酮的還原產(chǎn)物主要為反式-2-甲基環(huán)己醇,而PQQ→LDD的突變型EryKR2的主要還原產(chǎn)物也由野生型EryKR2的反式-2-甲基環(huán)己醇轉(zhuǎn)變成順式-2-甲基環(huán)己醇,證實(shí)了LDD模式序列確實(shí)為酶中控制2-甲基環(huán)己酮立體選擇性還原的位點(diǎn)。

    聚酮合成酶;酮還原酶;2-甲基環(huán)己酮;突變;立體選擇性

    含有環(huán)己基的手性醇是很多醫(yī)藥、農(nóng)藥、有機(jī)化工產(chǎn)品及材料的重要中間體[1],譬如,合成酸增殖劑的關(guān)鍵前體1-苯基-cis-1,2-環(huán)己二醇,合成手性藥物的手性砌塊光學(xué)純的β-氨基環(huán)己醇等。利用基因工程技術(shù)構(gòu)建不對(duì)稱還原取代環(huán)己酮的生物催化劑,為合成這類手性醇提供了一種安全性、環(huán)境相容性、立體選擇性均高的方法,但是,目前關(guān)于這方面的報(bào)道較少[2]。糖多孢紅霉菌聚酮合成酶的6個(gè)模塊中有5個(gè)酮還原酶(EryKR),是一個(gè)催化羰基不對(duì)稱還原的天然酶庫(kù)。酮還原酶表現(xiàn)出廣泛的底物譜:酮還原酶不僅能還原天然底物鏈?zhǔn)骄弁溂芭c其相似的底物如(2R,S)-2-甲基-3-羰基戊酰N-乙酰半胱酰胺硫酸酯等[3,4],而且還能以完全不同于鏈?zhǔn)骄弁湹暮h(huán)己基結(jié)構(gòu)的化合物作為底物[5,6],如環(huán)己酮、2-甲基環(huán)己酮和2-烯丙基環(huán)己酮等,顯示了EryKR有望成為立體選擇性還原取代環(huán)己酮的手性生物催化劑的巨大潛力。

    Ⅰ型聚酮合成酶的酮還原酶根據(jù)對(duì)鏈?zhǔn)骄弁湹牧Ⅲw選擇性還原情況分為A型和B型,糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊1的酮還原酶(EryKR1)為B型酮還原酶,在第88-103個(gè)氨基酸處有一個(gè)LDD模式序列,而糖多孢紅霉菌聚酮合成酶模塊2的酮還原酶(EryKR2)為A型酮還原酶,其中沒(méi)有這個(gè)模式[7]。多種聚酮合成酶的酮還原酶對(duì)包括(2R,S)-2-甲基-3-羰基戊酰N-乙酰半胱酰胺硫酸酯在內(nèi)的若干α-替代的β-羰基雙酮化合物進(jìn)行的立體選擇性還原研究,發(fā)現(xiàn)若這些位點(diǎn)發(fā)生了突變,酮還原酶對(duì)這些底物的立體選擇性會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變,證實(shí)了這些酶中存在有控制立體選擇性還原的模式序列[7,8]。

    考慮到除了鏈?zhǔn)骄弁?,酮還原酶還能以含環(huán)己基結(jié)構(gòu)的化合物為底物。為了探討LDD模式序列是否也是控制含環(huán)己基結(jié)構(gòu)的化合物立體選擇性還原的位點(diǎn),本研究利用重疊PCR技術(shù)將EryKR1(B型KR)中控制立體選擇性還原的LDD模式序列突變成EryKR2(A型KR)中的相應(yīng)位點(diǎn)PQQ,并且將EryKR2中的PQQ突變成EryKR1中的LDD,通過(guò)比較突變型酮還原酶與野生型酮還原酶以2-甲基環(huán)己酮為底物的酶活以及還原產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu),分析2-甲基環(huán)己酮的主要還原產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變與LDD模式序列的變化之間的關(guān)聯(lián),確定LDD模式序列是否為酶中負(fù)責(zé)控制2-甲基環(huán)己酮立體選擇性還原的位點(diǎn),旨在為指導(dǎo)催化不對(duì)稱還原取代環(huán)己酮的手性生物催化劑的構(gòu)建及開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基 糖多孢紅霉菌(Saccharopolyspora erythraea)、大腸桿菌表達(dá)載體pET28a質(zhì)粒及重組菌E.coli BL21(pET28a-gdh)為本實(shí)驗(yàn)室保藏;大腸桿菌BL21(E.coli BL21(DE3))為本實(shí)驗(yàn)宿主菌,購(gòu)買于康為世紀(jì)生物科技有限公司。LB培養(yǎng)基[9]:酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L,pH7.0,用于培養(yǎng)大腸桿菌BL21,篩選抗性菌株時(shí),加卡拉霉素終濃度為100 μg/mL;TSB培養(yǎng)基:Tryptic Soy Broth 30 g/L,用于糖多孢紅霉菌的液體培養(yǎng)。

    1.1.2 酶和化學(xué)試劑 Lysozyme、蛋白酶K、pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ、T4DNA連接 酶、DNA ladder Marker、Protein Marker、DNA Loading Buffer、微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及高純度質(zhì)粒小提試劑盒均為康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品,2-甲基環(huán)己酮(98%)和反式-2-甲基環(huán)己醇(97%)為Alfa Aesar公司的產(chǎn)品,順式-2-甲基環(huán)己醇(98%)購(gòu)自Aldrich。

    1.2 方法

    1.2.1 野生型及突變型eryKR1或eryKR2基因的克隆及表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 糖多孢紅霉菌A226基因組DNA的提取參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。根據(jù)文獻(xiàn)[5]報(bào)道的EryKR1和EryKR2的邊界,設(shè)計(jì)擴(kuò)增野生型eryKR1基因和eryKR2基因(或突變型eryKR1即TeryKR1基因和突變型eryKR2即TeryKR2基因)的兩端引物,為便于克隆,在正向引物和反向引物前分別加上NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn),其中用于擴(kuò)增野生型和突變型eryKR1基因的兩端引物為L(zhǎng)KR1:5'-gcc atatggacgaggtttccgcgctgcg-3'(gc為保護(hù)性堿基,catatg為NdeⅠ酶切位點(diǎn));RKR1:5'-ggaattctcacgcgcccacc cgcggttcggc-3'(g為保護(hù)性堿基,gaattc為EcoRⅠ酶切位點(diǎn))。

    為了采用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增TeryKR1基因,設(shè)計(jì)中間的將EryKR1酶中的LDD對(duì)應(yīng)的堿基突變成EryKR2酶中的PQQ相應(yīng)的堿基的正反向引物分 別 TKR1-L:5'-cacgccgccgccacgccgcagcagggcaccg tggacaccctcacc-3',TKR1-R:5'-ggtgtccacggtgccctgctg cggcgtggcggcggcgtggaacac-3';而用于擴(kuò)增野生型和突變型eryKR2基因的兩端引物為L(zhǎng)KR2:5'-gccatatgg acgagctcgacggctggttc-3'(gc為保護(hù)性堿基,catatg為NdeⅠ酶切位點(diǎn)),RKR2:5'-ggaattctcaccggtcgcgcag gctctccgtc-3'(gaattc為EcoRⅠ酶切位點(diǎn),前面g為保護(hù)性堿基)。

    為了采用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增TeryKR2基因,設(shè)計(jì)中間的將EryKR2酶中的PQQ突變成EryKR1酶中的LDD的正反向引物分別為T(mén)KR2-L:5'-cacgcgg cgggactgctcgacgacgtcgcgatcaac gacatggac-3';TKR2-R:5'-gtcgttgatcgcgacgtcgtcgagcagtcccgccgcgtgcaccac-3';PCR擴(kuò)增體系和條件參考文獻(xiàn)[6]。

    獲得的PCR特異片段產(chǎn)物按照微量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)回收純化后,按照文獻(xiàn)[9],雙酶切連接到載體pET28a上,再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中。從篩選到的陽(yáng)性克隆中利用高純度質(zhì)粒小提試劑盒提取出重組質(zhì)粒,經(jīng)武漢擎科公司測(cè)序后,再利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的核苷酸比對(duì)功能進(jìn)行比對(duì),檢測(cè)質(zhì)粒中克隆的基因片段與目標(biāo)基因的一致性。

    1.2.2 重組酮還原酶的誘導(dǎo)表達(dá)和酶活測(cè)定 按照1%的接種量將構(gòu)建的重組菌種子液接種到含100 μg/mL 卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37℃、150 r/min培養(yǎng)3 h左右加入終濃度為1 mmol/L的 IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)4 h[10]。離心(4℃,10 000 r/min,10 min)收集菌體沉淀,用0.1 mol/L的磷酸鉀緩沖液(pH7.0)洗滌重懸后,超聲波破碎(破胞強(qiáng)度60%,工作3 s間歇5 s,10 min)。離心(4℃,10 000 r/min,10 min)收集上清液(即粗酶液),測(cè)定其酶活、蛋白質(zhì)含量及進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。測(cè)定酶活的反應(yīng)體系(3 mL):粗酶液20 μL、2 mmol/L NADPH 500 μL、2-甲基環(huán)己酮50 μL和0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)。該體系置于37℃反應(yīng)30 min,期間在340 nm條件下測(cè)量NADPH的吸光值變化曲線,根據(jù)曲線斜率代入NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的公式(y=0.004 83x+ 0.004 53,R2=0.999 82,其中y為 340 nm處的吸光值,x為NADPH濃度(μmol/L)),計(jì)算NADPH含量變化情況。酶活單位U定義為在本實(shí)驗(yàn)條件下,1 min催化氧化1 μmol NADPH到NADP+所需要的酶量。采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[9],根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品牛血清白蛋白的濃度與吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.005 79x-0.064,R2=0.997 01,y為595 nm處的吸光值,x為蛋白質(zhì)含量(μg/mL)),計(jì)算上清液中蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)文獻(xiàn)[9]進(jìn)行SDSPAGE分析。

    1.2.3 雙重組菌耦合全細(xì)胞催化2-甲基環(huán)己酮的還原 雙重組菌耦合的發(fā)酵體系(10 mL):0.4 g E.coli BL21(pET28a-eryKR1)(或E.coli BL21(pET28a-ery-KR2)、E.coli BL21(pET28a- TeryKR1)、E.coli BL21(pET28a-TeryKR2)),0.1 g E.coli BL21(pET28a-gdh),0.1 mol/L葡 萄 糖,0.2 mmol/L NADPH,10 mmol/L 2-甲基環(huán)己酮,0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH6.0)。該體系置于30℃、120 r/min振蕩反應(yīng)6 h。反應(yīng)液離心(4℃,10 000 r/min,10 min)收集上清并用等體積乙酸乙酯萃取,得到的上層有機(jī)相采用Agilent6890型氣相色譜儀檢測(cè)分析底物和產(chǎn)物的濃度,并按照文獻(xiàn)[6]計(jì)算轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)物收率及對(duì)映體過(guò)量值(e.e值)。色譜條件為:采用毛細(xì)管柱CYCLODEXB(30 m×0.25 mm×0.25 m),載氣為氮?dú)?,進(jìn)樣量為1 μL,F(xiàn)ID檢測(cè)器。氣化溫度為250℃,檢測(cè)器溫度為300℃;色譜柱初始溫度90℃,維持4 min;升溫速度20℃,終溫為180℃,維持6 min;柱前壓為0.27 MPa,分流比為50∶1。

    2 結(jié)果

    2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

    eryKR1基因和eryKR2基因的突變位點(diǎn)兩側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物TeryKR1-L、TeryKR1-R、TeryKR2-L和TeryKR2-R分別進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖1和圖2,可見(jiàn)TeryKR1-L和TeryKR2-L均位于1 000 bp附近,與兩個(gè)目標(biāo)基因突變位點(diǎn)左側(cè)的序列長(zhǎng)度分別為965 bp和893 bp吻合,而片段TeryKR1-R和TeryKR2-R都略高于500 bp,與兩個(gè)目標(biāo)基因的突變位點(diǎn)右側(cè)的序列長(zhǎng)度分別為550 bp和553 bp吻合。

    突變型eryKR1基因(命名為T(mén)eryKR1)和突變型eryKR2基因(命名為T(mén)eryKR2)的重疊PCR產(chǎn)物,野生型eryKR1基因和eryKR2基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,分別以1.0 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),結(jié)果如圖3-圖6。產(chǎn)物片段的大小都位于1 000 bp和2 000 bp之間,與目標(biāo)eryKR1基因和eryKR2基因的序列長(zhǎng)度分別為1 461 bp和1 395 bp吻合。

    將基因片段eryKR1、eryKR2、TeryKR1和Tery-KR2分別克隆到pET28a載體上,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a-eryKR1、pET28a-eryKR2、pET28a-TeryKR1和pET28a-TeryKR2。對(duì)獲得的重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切鑒定(圖7),證實(shí)了4個(gè)重組質(zhì)粒中克隆的基因片段均在1 000和2 000 bp之間,與目標(biāo)片段的大小一致。含有這4個(gè)質(zhì)粒的重組大腸桿菌分別命 名 為E.coli BL21(pET28a-eryKR1)、E.coli BL21(pET28a-eryKR2)、E.coli BL21(pET28a-TeryKR1)和E.coli BL21(pET28a-TeryKR2)。

    圖1 eryKR1基因的突變位點(diǎn)兩側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖2 eryKR2基因的突變位點(diǎn)兩側(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖3 突變型eryKR1基因(TeryKR1)的PCR產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖4 突變型eryKR2基因(TeryKR2)的PCR產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖5 野生型eryKR1基因的PCR產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖6 野生型eryKR2基因的PCR產(chǎn)物的1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖7 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳圖

    利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)提供的核苷酸比對(duì)功能,對(duì)重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析,得出測(cè)序結(jié)果中克隆的野生型和突變型eryKR1基因、野生型和突變型eryKR2基因與登錄號(hào)為AM420293.1報(bào)道的糖多孢紅霉菌NRRL2338的基因組DNA中792 285-793 727 bp、796 692-798 068 bp的堿基序列的相似度分別達(dá)到100%、99%、100%和99%。

    突變型eryKR1和eryKR2基因序列的核苷酸比對(duì)結(jié)果分別如圖8和圖9,突變型eryKR1基因中對(duì)應(yīng)AM420293.1序列中的第793 209-793 218個(gè)堿基ctcgacgac(編碼的氨基酸殘基為L(zhǎng)DD)已替換成測(cè)序結(jié)果中的ccgcagcag(編碼的氨基酸殘基為PQQ);而突變型eryKR2基因中對(duì)應(yīng)AM420293.1序列中的第79 7547-797 556個(gè)堿基ccgcagcag(編碼的氨基酸序列為PQQ)已替換成測(cè)序結(jié)果中的ctcgacgac(編碼的氨基酸序列為L(zhǎng)DD),說(shuō)明質(zhì)粒pET28a-TeryKR1和pET28a-TeryKR2中克隆的突變型eryKR1和eryKR2基因編碼的氨基酸序列,其中調(diào)控底物的立體選擇性還原的氨基酸殘基發(fā)生了LDD?PQQ互換。

    圖8 重組質(zhì)粒pET28a-TeryKR1的核苷酸比對(duì)結(jié)果(截圖)

    圖9 重組質(zhì)粒pET28a-TeryKR2的核苷酸比對(duì)結(jié)果(截圖)

    2.2 野生型和突變型酮還原酶在大腸桿菌中的異源表達(dá)情況

    以E.coli BL21(pET28a)菌為陰性對(duì)照,SDSPAGE檢測(cè)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組菌E.coli BL21(pET-28a-eryKR1)、E.coli BL21(pET28a-TeryKR1)、E.coli BL21(pET28a-eryKR2)和E.coli BL21(pET28a-TeryKR2)中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。如圖10和11所示,與陰性對(duì)照中的蛋白質(zhì)條帶不同,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌在45.0 kD和66.2 kD之間都有酮還原酶的表達(dá)條帶(目標(biāo)蛋白的相對(duì)分子量為57 kD,包括了pET28a載體表達(dá)的His tag片段)。

    利用BandScan 5.0軟件分析這些重組菌的總可溶性蛋白的SDS-PAGE圖,可知,重組菌E.coli BL21(pET28a-TeryKR1)中目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)量占全菌可溶性蛋白質(zhì)的8.49%(圖10中的孔道4),E.coli BL21(pET28a-eryKR1)中EryKR1的表達(dá)量為5.66%(圖10中孔道2),而重組菌E.coli BL21(pET28aeryKR2)(圖11中孔道3)和E.coli BL21(pET28a-TeryKR2)(圖11中孔道5)中表達(dá)出來(lái)的EryKR2分別占全菌可溶性蛋白質(zhì)的5.92%和5.04%。取這些孔道對(duì)應(yīng)的重組菌進(jìn)行后續(xù)的酶活和生物催化2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原實(shí)驗(yàn)。

    圖10 野生型和突變型酮還原酶EryKR1的SDS-PAGE檢測(cè)圖

    圖11 野生型和突變型酮還原酶EryKR2的SDS-PAGE檢測(cè)圖

    2.3 野生型和突變型酮還原酶的活性

    E.coli BL21(pET28a-eryKR1)、E.coli BL21(pET28a-TeryKR1)、E.coli BL21(pET28a-eryKR2)和E.coli BL21(pET28a-TeryKR2)的重組酮還原酶的粗酶液酶活分別為187.02 U/L、192.94 U/L、51.02 U/L和35.43 U/L,其中的蛋白質(zhì)濃度分別為125.73 μg/mL、205.52 μg/mL、138.26 μg/mL和 115.68 μg/ mL,由此得出粗酶液的比酶活分別為1.49 U/mg、0.94 U/mg、0.37 U/mg和0.31 U/mg。根據(jù)野生型或突變型酮還原酶粗酶液的酶活和比酶活數(shù)據(jù),可知控制立體選擇性還原的位點(diǎn)(motif)處的氨基酸序列LDD突變成PQQ(LDD→PQQ)的突變型EryKR1的比酶活,比起野生型EryKR1的略微有所下降,這說(shuō)明突變對(duì)酶的活性有所影響。另外,與EryKR1相比,EryKR2當(dāng)以2-甲基環(huán)己酮作為底物時(shí),酶活較低,而PQQ→LDD的突變型EryKR2與野生型EryKR2的比酶活相較,變化不大。

    2.4 雙重組菌耦合催化2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原實(shí)驗(yàn)

    氣相色譜檢測(cè)構(gòu)建的四個(gè)重組大腸桿菌分別與E.coli BL21(pET28a-gdh)耦合還原2-甲基環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化液(圖12),根據(jù)底物和產(chǎn)物的峰面積,利用外標(biāo)法計(jì)算底物及產(chǎn)物的濃度,進(jìn)而得出轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)物產(chǎn)率及對(duì)映體過(guò)量值(e.e值),數(shù)據(jù)見(jiàn)表1,可知:與陰性對(duì)照的轉(zhuǎn)化液中沒(méi)有還原產(chǎn)物檢出不同(圖12-E),野生型EryKR1催化2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原的產(chǎn)物以順式2-甲基環(huán)己醇為主,產(chǎn)率為8.05%,e.e值為58.14%(圖12-A),而突變型EryKR1催化不對(duì)稱還原的產(chǎn)物主要為反式,產(chǎn)率為8.54%,e.e值為27.16%(圖12-B);野生型EryKR2催化2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原,產(chǎn)物以反式2-甲基環(huán)己醇為主,產(chǎn)率僅為4.00%,e.e值為8.89%(圖12-C),而突變型EryKR2催化不對(duì)稱還原的產(chǎn)物主要為順式,產(chǎn)率2.94%,e.e值為13.92%(圖12-D),說(shuō)明EryKR1和EryKR2中分別發(fā)生LDD→PQQ和PQQ→LDD的突變時(shí),催化2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原生成的主要產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,這擴(kuò)展了LDD 模式序列為酮還原酶中控制鏈?zhǔn)骄弁溋Ⅲw選擇性還原的位點(diǎn)的理論,得出該位點(diǎn)也是控制2-甲基環(huán)己酮不對(duì)稱還原的模序。

    另外,根據(jù)酮還原酶催化鏈?zhǔn)骄弁溋Ⅲw選擇性還原的情況,EryKR1為B型酮還原酶,而EryKR2為A型KR,本研究結(jié)果還擴(kuò)展了該理論,即EryKR1和EryKR2催化含環(huán)己基結(jié)構(gòu)的化合物還原時(shí)形成的主要產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)也是不同的。

    3 討論

    對(duì)聚酮合成酶的特殊結(jié)構(gòu)、催化機(jī)制的研究,有助于了解酶的催化、分子識(shí)別及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的分子機(jī)制[11],其中聚酮合成酶中的酮還原酶如何控制底物的立體選擇性還原的機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)。Ⅰ型聚酮合成酶的酮還原酶域(ketoreductase,KR)根據(jù)鏈?zhǔn)骄弁溋Ⅲw選擇性還原的情況分為A型和B型,這兩種KR在第88-103和第134-149個(gè)氨基酸處的兩個(gè)模式序列(motif)有很大區(qū)別。B型KR如EryKR1,在第88-10個(gè)氨基酸處有一個(gè)LDD模式序列,而A型KR如 EryKR2,沒(méi)有這個(gè)模式。另外,在第134-149個(gè)氨基酸處,B型KR有個(gè)P144、N148,而A型KR中是W141。若這些位點(diǎn)發(fā)生了突變,酶域?qū)Γ?R,S)-2-甲基-3-羰基戊酰N-乙酰半胱酰胺硫酸酯的立體選擇性會(huì)發(fā)生相應(yīng)的改變,證實(shí)了這些酶域中存在有控制立體選擇性還原的模式序列[4,7,8]。另外,A型和B型KR的晶體結(jié)構(gòu)分析顯示A型KR中的W殘基與B型KR中的LDD序列分別位于這兩種KR的活性中心裂縫的兩側(cè),說(shuō)明這兩種類型的KR中底物是從不同的方向被引至酶的活性中心,導(dǎo)致底物中的β-羰基以不同方向結(jié)合NADPH,從而生成不同立體結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物[12]。而且,與B型KR不同,A型KR的活性中心處于一種井然有序、隨時(shí)準(zhǔn)備好催化的Lys-2’-O-核糖-Tyr的氫鍵結(jié)合的狀態(tài)。在底物和輔酶結(jié)合時(shí),A型KR會(huì)關(guān)閉蓋子環(huán)(lid loop),限制底物只從一個(gè)方向進(jìn)入活性中心,導(dǎo)致生成的產(chǎn)物具有特定的立體結(jié)構(gòu)[13]。在這個(gè)過(guò)程中,酶的一些殘基能夠有助于底物的定位[14]。

    圖12 雙重組菌耦合還原2-甲基環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化液的氣相色譜檢測(cè)圖譜

    表1 雙重組菌耦合還原2-甲基環(huán)己酮的轉(zhuǎn)化液的氣相色譜檢測(cè)結(jié)果

    聚酮合成酶的酮還原酶域可以還原的底物類型多種多樣,不僅能對(duì)類似天然底物——鏈?zhǔn)骄弁湹聂驶孜镉休^好的還原能力,如(2R,S)-2-甲基-3-羰基戊酰N-乙酰半胱酰胺硫酯[3],而且還能以那些結(jié)構(gòu)不同于鏈?zhǔn)骄弁湹幕衔镒鳛榈孜铮纾?RS)-反式-1-萘烷酮[3]、脂環(huán)酮[5]等。但是,目前針對(duì)聚酮合成酶酮還原酶域的控制立體選擇性還原的機(jī)理研究,多以(2R,S)-2-甲基-3-羰基戊酰N-乙酰半胱酰胺硫酸酯、(9RS)-反式-1-萘烷酮為研究底物,對(duì)聚酮合成酶的酮還原酶域?yàn)楹文芙Y(jié)合潛手性取代環(huán)己酮以及如何控制此反應(yīng)的立體選擇性機(jī)理還未見(jiàn)報(bào)道。本研究基于LDD模式序列可能也負(fù)責(zé)控制取代環(huán)己酮類底物的立體選擇性還原的假設(shè),構(gòu)建了分別異源表達(dá)聚酮合成酶模塊1的酮還原酶(EryKR1)、模塊2的酮還原酶(EryKR2)、LDD殘基替換為PQQ(LDD→PQQ)的EryKR1及PQQ替換為L(zhǎng)DD(PQQ→LDD)的EryKR2的重組大腸桿菌,考察了野生型模塊1和模塊2的重組酮還原酶對(duì)2-甲基環(huán)己酮的不對(duì)稱還原能力,結(jié)果顯示在底物濃度為10 mmol/L的條件下,EryKR1的還原產(chǎn)物主要為順式-2-甲基環(huán)己醇,產(chǎn)率為8.05%,e.e值為58.14%,而EryKR2的還原產(chǎn)物主要為反式-2-甲基環(huán)己醇,產(chǎn)率為4.00%,e.e值為8.89%,說(shuō)明即使以2-甲基環(huán)己酮為底物,模塊1和模塊2的酮還原酶的立體選擇性還原情況也是不同的。通過(guò)比較突變前后的重組EryKR1和EryKR2以2-甲基環(huán)己酮為底物的酶活及產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然突變對(duì)酶活的影響不大,但是突變后的重組EryKR1催化還原2-甲基環(huán)己酮的主要產(chǎn)物由突變前的順式-2-甲基環(huán)己醇轉(zhuǎn)變成反式-2-甲基環(huán)己醇,而突變后的重組EryKR2催化的主要還原產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)則由突變前的反式變成了順式,說(shuō)明酮還原酶催化2-甲基環(huán)己酮還原的主要產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu)變化與酶中LDD模式序列的突變之間存在關(guān)聯(lián),得出LDD模序確實(shí)為酶中控制取代環(huán)己酮類底物立體選擇性還原的位點(diǎn)。

    4 結(jié)論

    本研究構(gòu)建了分別異源表達(dá)聚酮合成酶模塊1的酮還原酶(EryKR1)、模塊2的酮還原酶(EryKR2)、LDD殘基替換為PQQ(LDD→PQQ)的EryKR1和PQQ替換為L(zhǎng)DD(PQQ→LDD)的EryKR2的重組大腸桿菌,比較突變型和野生型重組大腸桿菌還原2-甲基環(huán)己酮的主要產(chǎn)物的立體結(jié)構(gòu),得出LDD→PQQ的突變使得EryKR1的主要還原產(chǎn)物從順式-2-甲基環(huán)己醇轉(zhuǎn)變成反式-2-甲基環(huán)己醇,而PQQ→LDD的突變可使EryKR2的主要還原產(chǎn)物2-甲基環(huán)己醇的立體結(jié)構(gòu)由反式變成順式,確定了聚酮合成酶的酮還原酶的LDD模式序列為控制2-甲基環(huán)己酮立體選擇性還原的位點(diǎn)。

    [1] Long JX, Shu SY, Wu QY, et al. Selective cyclohexanol production from the renewable lignin derived phenolic chemicals catalyzed by Ni/MgO[J]. Energy Conversion and Management, 2015, 105(15):570-577.

    [2] Conti RMD, Porto ALM, Augusto J, et al. Microbial reduction of cyclohexanones[J]. Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 2001, 11(4-6):233-236.

    [3] Siskos AP, Baerga-Ortiz A, Bali S, et al. Molecular basis of Celmer’s rules:stereochemistry of catalysis by isolated ketoreductase domains from modular polyketide synthases[J]. Chemistry & Biology, 2005, 12(10):1145-1153.

    [4] Piasecki SK, Taylor CA, Detelich JF, et al. Employing modular polyketide synthase ketoreductases as biocatalysts in the preparative chemoenzymatic syntheses of diketide chiral building blocks[J].Chemistry & Biology, 2011, 18(10):1331-1340.

    [5] Bali S, O’Hare HM, Weissman KJ. Broad substrate specificity of ketoreductases derived from modular polyketide synthases[J]. ChemBiochem, 2006, 7(3):478-484.

    [6] 李凌凌, 呂早生, 關(guān)海燕, 等. 糖多孢紅霉菌酮還原酶域在羰基還原中的應(yīng)用[J]. 華中科技大學(xué):自然科學(xué)版, 2011, 39(2):72-75.

    [7] Baerga-Ortiz A, Popovic B, Siskos AP, et al. Directed mutagenesis alters the stereochemistry of catalysis by isolated ketoreductase domains from the erythromycin polyketide synthase[J]. Chemistry & Biology, 2006, 13(3):277-285.

    [8] O’Hare HM, Baerga-Ortiz A, Popovic B, et al. High-throughput mutagenesis to evaluate models of stereochemical control in ketoreductase domains from the erythromycin polyketide synthase[J]. Chemistry & Biology, 2006, 13(3):287-296.

    [9] 楊忠華, 左振宇, 黃皓, 等. 生物工程專業(yè)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2014:65-73.

    [10] 李凌凌, 呂早生, 左振宇, 等. 嗜酸喜溫硫桿菌硫加氧還原酶基因的克隆、表達(dá)及酶活性研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2015, 31(11):186-194.

    [11] Shen B. Polyketide biosynthesis beyond the typeⅠ, Ⅱ and Ш polyketide synthase paradigms[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2003, 7(2):285-295.

    [12] Keatinge-Clay AT. A tylosin ketoreductase reveals how chirality is determined in polyketides[J]. Chemistry & Biology, 2007, 14(8):898-908.

    [13] Bonnet SA, Whicher JR, Papireddy K, et al. Structural and stereochemical analysis of a modular polyketide synthase ketoreductase domain required for the generation of a cisalkene[J]. Chemistry & Biology, 2013, 20(6):772-783.

    [14] Zheng J, Taylor CA, Piasecki SK, et al. Structural and functional analysis of A-type ketoreductases from the amphotericin modular polyketide synthase[J]. Structure, 2010, 18(8):913-922.

    (責(zé)任編輯 李楠)

    Mutation of Amino Acid Motif Involved in Stereoselectivity by Ketoreductases and Analysis of Its Product

    LI Ling-ling Lü Zao-sheng ZUO Zhen-yu YANG Zhong-hua LIU Yao-ning SONG Cai-wei
    (School of Chemistry and Chemical Engineering,Wuhan University of Science and Technology,Wuhan 430081)

    In order to identify whether LDD motif in ketoreductase domain of polyketide synthase from Saccharopolyspora erythraea(EryKR)can account for the stereocontrol of 2-methylcyclohexanone reduction,we constructed the 4 recombinants,Escherichia coli BL21(pET28a-eryKR1)with heterologous expressing ketoreductase in the first module(EryKR1)of polyketide synthase, E.coli BL21(pET28aeryKR2)with heterologous expressing ketoreductase in the second module(EryKR2)of polyketide synthase,E.coli BL21(pET28a-TeryKR1)of the site-mutated EryKR1 in which the nucleotide sequence coding for amino acid residues LDD replaced by PQQ,and E.coli BL21(pET28a-TeryKR2)of the site-mutated EryKR2 while PQQ replaced by LDD. SDS-PAGE demonstrated that ketoreductases were expressed in these 4 recombinants after induction by IPTG. Specific activity of crude enzyme was 1.49 U/mg,0.37 U/mg,0.94 U/mg and 0.31 U/mg,respectively. Gas chromatography analyses of 2-methylcyclohexanone reduction catalyzed by 4 recombinants showed that mutated recombinant E.coli BL21(pET28a-TeryKR1)mainly reduced 2-methylcyclohexanone to trans-2-methylcyclohexanol,unlike the main product of cis-2-methylcyclohexanol catalyzed by wild-type recombinant Escherichia coli BL21(pET28a-eryKR1). Furthermore,main reduction product of mutant E.coli BL21(pET28a-TeryKR2)was cis-2-methylcyclohexanol,rather than the trans-2-methylcyclohexanol by wild-type recombinant E.coli BL21(pET28a-eryKR2),confirming the key role of LDD motif in controlling the stereoselectivity of 2-methylcyclohexanone reduction.

    polyketide synthase;ketoreductase;2-methylcyclohexanone;mutation;stereoselectivity

    10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1195

    2017-01-05

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21376184),湖北省科技廳基金項(xiàng)目(2009CDA006),武漢科技大學(xué)青年科技骨干培育計(jì)劃項(xiàng)目(2016XZ014),武漢科技大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金研究項(xiàng)目(16ZRA044)

    李凌凌,女,博士,副教授,研究方向:生物催化及微生物浸礦技術(shù);E-mail:moonletsmile@163.com

    猜你喜歡
    環(huán)己酮突變型還原酶
    四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與冠心病嚴(yán)重程度的相關(guān)性
    環(huán)己烷催化氧化生產(chǎn)環(huán)己酮催化劑的專利技術(shù)綜述
    化工管理(2021年7期)2021-05-13 00:45:22
    宇部興產(chǎn)公司采用新工藝生產(chǎn)環(huán)己酮
    聚對(duì)二氧環(huán)己酮的合成及其結(jié)晶性能
    表皮生長(zhǎng)因子受體非突變型非小細(xì)胞肺癌分子靶治療有效1病例報(bào)道及相關(guān)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)
    發(fā)酵液中酮基還原酶活性測(cè)定方法的構(gòu)建
    CD41-42突變型β地中海貧血重組載體pEGFP-C2-CD41-42的構(gòu)建及其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞模型的建立
    突變型PUMA(S10A)對(duì)Hela細(xì)胞的凋亡作用及其分子機(jī)制
    中國(guó)罕見(jiàn)的移碼突變型β珠蛋白生成障礙性貧血家系調(diào)查
    羰基還原酶不對(duì)稱還原?-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯
    色综合欧美亚洲国产小说| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲三区欧美一区| 亚洲色图综合在线观看| aaaaa片日本免费| 99re6热这里在线精品视频| 悠悠久久av| 国产精品国产高清国产av | 啦啦啦 在线观看视频| 日韩欧美国产一区二区入口| 搡老乐熟女国产| 在线观看免费午夜福利视频| 国产三级黄色录像| 成人国产一区最新在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影 | 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 亚洲人成电影观看| 在线永久观看黄色视频| 三上悠亚av全集在线观看| 超碰成人久久| 精品第一国产精品| 中文字幕色久视频| 国产精品.久久久| 少妇精品久久久久久久| 少妇 在线观看| 不卡av一区二区三区| 国产99久久九九免费精品| 亚洲国产欧美在线一区| 99riav亚洲国产免费| 午夜福利视频在线观看免费| 在线观看舔阴道视频| 色综合婷婷激情| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 午夜福利,免费看| 日本欧美视频一区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产亚洲精品一区二区www | 777米奇影视久久| 最黄视频免费看| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 日韩大码丰满熟妇| 国产福利在线免费观看视频| 一二三四社区在线视频社区8| 国产真人三级小视频在线观看| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产单亲对白刺激| 欧美精品一区二区大全| 蜜桃在线观看..| 久久久久久久国产电影| 国产成+人综合+亚洲专区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产av国产精品国产| 亚洲精品国产色婷婷电影| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲av第一区精品v没综合| 岛国毛片在线播放| 国产又色又爽无遮挡免费看| 91字幕亚洲| 欧美精品啪啪一区二区三区| 精品卡一卡二卡四卡免费| 91精品国产国语对白视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 高清在线国产一区| 亚洲avbb在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 天堂动漫精品| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲欧美激情在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 91麻豆av在线| 国产亚洲欧美精品永久| 色综合欧美亚洲国产小说| 夫妻午夜视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 久久久精品94久久精品| 黑人猛操日本美女一级片| 中文字幕色久视频| 欧美一级毛片孕妇| 成人国语在线视频| 国产一区二区激情短视频| 精品乱码久久久久久99久播| 国产深夜福利视频在线观看| 美女福利国产在线| 老司机午夜福利在线观看视频 | 久久九九热精品免费| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产免费av片在线观看野外av| 一区福利在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 亚洲熟妇熟女久久| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 曰老女人黄片| 国产精品国产高清国产av | 久久99热这里只频精品6学生| 久久久国产一区二区| 亚洲成国产人片在线观看| 精品国产一区二区久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 深夜精品福利| av在线播放免费不卡| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 热re99久久精品国产66热6| 成年人午夜在线观看视频| 老司机深夜福利视频在线观看| av国产精品久久久久影院| 欧美国产精品一级二级三级| 国产麻豆69| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 天堂中文最新版在线下载| 精品一区二区三卡| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 黄色a级毛片大全视频| 国产成人精品久久二区二区免费| 久久精品国产综合久久久| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 老司机深夜福利视频在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 人人妻人人看人人澡| 午夜精品一区二区三区免费看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 色视频www国产| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日韩欧美在线二视频| 无人区码免费观看不卡| 国产单亲对白刺激| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品一区二区免费欧美| 可以在线观看毛片的网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 99国产精品99久久久久| 特级一级黄色大片| 亚洲专区国产一区二区| 手机成人av网站| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美丝袜亚洲另类 | av视频在线观看入口| 天堂√8在线中文| 少妇人妻一区二区三区视频| 丁香欧美五月| 美女免费视频网站| 国产高清激情床上av| 一进一出好大好爽视频| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲av美国av| 日本精品一区二区三区蜜桃| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产一区二区在线av高清观看| 久久精品影院6| 亚洲精品美女久久av网站| 国产欧美日韩精品亚洲av| 黄色视频,在线免费观看| 国产一区二区在线av高清观看| 久久精品影院6| 他把我摸到了高潮在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 亚洲国产精品999在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产成人系列免费观看| 精华霜和精华液先用哪个| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产真人三级小视频在线观看| 一进一出好大好爽视频| 宅男免费午夜| 深夜精品福利| 国产成人福利小说| 亚洲av电影在线进入| 91在线精品国自产拍蜜月 | 亚洲九九香蕉| 亚洲精华国产精华精| 成人午夜高清在线视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 男女那种视频在线观看| 窝窝影院91人妻| 亚洲av成人精品一区久久| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美日韩综合久久久久久 | 一本一本综合久久| 日本a在线网址| 成人无遮挡网站| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲国产精品久久男人天堂| 成人一区二区视频在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| av女优亚洲男人天堂 | 看黄色毛片网站| 国产熟女xx| 看免费av毛片| 国产在线精品亚洲第一网站| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 午夜福利在线在线| 香蕉av资源在线| 日韩欧美精品v在线| 亚洲成人中文字幕在线播放| 一级a爱片免费观看的视频| 亚洲美女黄片视频| 在线永久观看黄色视频| 哪里可以看免费的av片| 日本a在线网址| 免费在线观看亚洲国产| 一级毛片女人18水好多| 国产成人av激情在线播放| 国产欧美日韩精品一区二区| 午夜日韩欧美国产| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 99热这里只有是精品50| 国产精品野战在线观看| 无限看片的www在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 在线观看66精品国产| 国产高潮美女av| 亚洲自拍偷在线| 久久亚洲精品不卡| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 99久久无色码亚洲精品果冻| 精品欧美国产一区二区三| 首页视频小说图片口味搜索| 午夜成年电影在线免费观看| 91在线观看av| 在线观看66精品国产| av在线蜜桃| 男女下面进入的视频免费午夜| 香蕉av资源在线| 两个人视频免费观看高清| 99热6这里只有精品| 免费在线观看日本一区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲美女黄片视频| 久久香蕉国产精品| 国产精品 国内视频| 一本一本综合久久| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 黑人欧美特级aaaaaa片| 99精品在免费线老司机午夜| 国产毛片a区久久久久| 午夜两性在线视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 久久这里只有精品中国| 国产三级黄色录像| 精品久久久久久久末码| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产在线精品亚洲第一网站| 欧美不卡视频在线免费观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产91精品成人一区二区三区| 久久中文字幕人妻熟女| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 又大又爽又粗| www.www免费av| 99久久国产精品久久久| 美女 人体艺术 gogo| 久久这里只有精品19| 国产精品 欧美亚洲| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲人成网站高清观看| 麻豆一二三区av精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 草草在线视频免费看| 久久中文字幕人妻熟女| 午夜激情福利司机影院| 日本一本二区三区精品| 小说图片视频综合网站| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 偷拍熟女少妇极品色| 美女cb高潮喷水在线观看 | 757午夜福利合集在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲国产看品久久| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久久久大精品| 久久中文字幕一级| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 欧美一级毛片孕妇| 美女被艹到高潮喷水动态| 免费无遮挡裸体视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲av免费在线观看| av视频在线观看入口| 午夜激情福利司机影院| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 丁香欧美五月| 我要搜黄色片| 亚洲最大成人中文| 国产亚洲精品av在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 麻豆成人av在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 成人国产一区最新在线观看| 久久精品影院6| 男人和女人高潮做爰伦理| xxx96com| 悠悠久久av| 久久香蕉国产精品| 99精品久久久久人妻精品| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日韩精品中文字幕看吧| 日本黄大片高清| 国产欧美日韩一区二区三| 成人午夜高清在线视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 91在线观看av| av福利片在线观看| 成人三级黄色视频| 男女之事视频高清在线观看| 久久久久性生活片| 久久精品国产综合久久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品电影一区二区三区| 三级国产精品欧美在线观看 | 老司机福利观看| 激情在线观看视频在线高清| 精品久久久久久,| 18禁国产床啪视频网站| 久久久久久大精品| 99riav亚洲国产免费| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲午夜理论影院| 在线观看66精品国产| 一级a爱片免费观看的视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 黑人操中国人逼视频| av中文乱码字幕在线| 我要搜黄色片| 欧美一级毛片孕妇| 成年版毛片免费区| 免费av毛片视频| 国产精品 国内视频| 99久久成人亚洲精品观看| 九九在线视频观看精品| 99在线人妻在线中文字幕| 丝袜人妻中文字幕| 国产精品永久免费网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲激情在线av| 日本 欧美在线| 亚洲av成人精品一区久久| 国产一区二区三区视频了| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产精品精品国产色婷婷| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产一区在线观看成人免费| 日韩欧美免费精品| 桃色一区二区三区在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 色综合站精品国产| 亚洲欧美激情综合另类| 韩国av一区二区三区四区| 18禁观看日本| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 色老头精品视频在线观看| 久久这里只有精品中国| 毛片女人毛片| 最新美女视频免费是黄的| 成年女人看的毛片在线观看| 天堂动漫精品| 99热6这里只有精品| 搞女人的毛片| 国产高清激情床上av| 高清毛片免费观看视频网站| 伦理电影免费视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产精品精品国产色婷婷| 精品日产1卡2卡| 动漫黄色视频在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 成人av在线播放网站| 亚洲av成人精品一区久久| 嫩草影视91久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 久久久国产成人精品二区| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美黑人欧美精品刺激| 母亲3免费完整高清在线观看| 伦理电影免费视频| 欧美日韩综合久久久久久 | 无限看片的www在线观看| 亚洲真实伦在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 99久国产av精品| h日本视频在线播放| 国产精品久久久久久精品电影| 男人和女人高潮做爰伦理| 一区二区三区国产精品乱码| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲黑人精品在线| 国产激情久久老熟女| 免费无遮挡裸体视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 成人无遮挡网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产av在哪里看| 天天添夜夜摸| 校园春色视频在线观看| 久久精品91蜜桃| 成人特级av手机在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲精品在线美女| 一个人免费在线观看电影 | 免费看a级黄色片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 怎么达到女性高潮| 丝袜人妻中文字幕| 国产激情欧美一区二区| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 十八禁人妻一区二区| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日本免费a在线| 日韩大尺度精品在线看网址| 身体一侧抽搐| 国产av不卡久久| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产伦在线观看视频一区| 欧美黑人欧美精品刺激| 香蕉国产在线看| 免费观看精品视频网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲无线在线观看| 高清在线国产一区| 日韩免费av在线播放| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产 一区 欧美 日韩| 又爽又黄无遮挡网站| 成年人黄色毛片网站| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲激情在线av| 成年免费大片在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 国产一区二区激情短视频| 欧美中文日本在线观看视频| 久久国产精品影院| 哪里可以看免费的av片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 亚洲精品粉嫩美女一区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 欧美日韩综合久久久久久 | 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲av电影在线进入| 高清在线国产一区| 此物有八面人人有两片| 久久精品91无色码中文字幕| 99国产精品99久久久久| 久久久成人免费电影| 午夜激情欧美在线| 色老头精品视频在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成人18禁在线播放| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产成人精品无人区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 精华霜和精华液先用哪个| 99久久精品国产亚洲精品| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 91在线精品国自产拍蜜月 | 黄色丝袜av网址大全| 亚洲精品在线观看二区| 一本久久中文字幕| 成年版毛片免费区| 国产精品av久久久久免费| 精品久久久久久久久久久久久| 国产三级中文精品| 亚洲五月天丁香| 看黄色毛片网站| 午夜免费观看网址| 日本黄色片子视频| 999久久久精品免费观看国产| 我要搜黄色片| 日日夜夜操网爽| 午夜a级毛片| 国产69精品久久久久777片 | 久久亚洲真实| 搞女人的毛片| 亚洲中文av在线| 亚洲人成网站高清观看| avwww免费| 两人在一起打扑克的视频| 日本黄大片高清| 啪啪无遮挡十八禁网站| 日韩欧美在线乱码| 国产成年人精品一区二区| 校园春色视频在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 午夜精品在线福利| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲av熟女| 高潮久久久久久久久久久不卡| 午夜影院日韩av| 美女cb高潮喷水在线观看 | 99在线人妻在线中文字幕| 久久久国产成人精品二区| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品女同一区二区软件 | 欧美成人免费av一区二区三区| 日韩精品青青久久久久久| 俺也久久电影网| 亚洲av五月六月丁香网| 18禁美女被吸乳视频| 亚洲成av人片在线播放无| 床上黄色一级片| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产一区二区在线观看日韩 | 久久久久久国产a免费观看| 九色国产91popny在线| 男人舔女人下体高潮全视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 三级国产精品欧美在线观看 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲av成人av| 国产精品一区二区免费欧美| 久久亚洲精品不卡| 亚洲精品456在线播放app | 黄色日韩在线| 久久中文字幕一级| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 丰满人妻一区二区三区视频av | 亚洲欧美一区二区三区黑人| 99国产精品99久久久久| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 级片在线观看| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 国产成人欧美在线观看| 久久精品人妻少妇| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 国内精品一区二区在线观看| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲av电影不卡..在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 欧美黄色淫秽网站| 99国产极品粉嫩在线观看| 一进一出抽搐动态| 午夜视频精品福利| 99精品久久久久人妻精品| 国产午夜福利久久久久久| 十八禁人妻一区二区| av福利片在线观看| 午夜福利在线观看吧| 亚洲色图av天堂| 久久久久久久精品吃奶| 又黄又爽又免费观看的视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 色综合婷婷激情| 国产一区二区激情短视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久中文看片网| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久精品国产清高在天天线| 成人18禁在线播放| 国产主播在线观看一区二区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 搡老岳熟女国产| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 久久人人精品亚洲av| 免费在线观看成人毛片| 91字幕亚洲| 久久这里只有精品19| 日本五十路高清| 国产精华一区二区三区| 亚洲无线观看免费| 亚洲九九香蕉| 色综合婷婷激情| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品午夜福利视频在线观看一区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99久久综合精品五月天人人| 国产高清激情床上av| 日本一本二区三区精品| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲专区字幕在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品av久久久久免费| 日韩欧美在线乱码| 综合色av麻豆| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 一个人免费在线观看电影 | 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产免费av片在线观看野外av| 伦理电影免费视频| 日韩欧美三级三区| 两个人看的免费小视频| 亚洲av美国av| 少妇的逼水好多| 一个人免费在线观看的高清视频| 一区二区三区国产精品乱码| 久久中文字幕人妻熟女| 少妇熟女aⅴ在线视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 九九在线视频观看精品| 久久久色成人|