地衣芽胞桿菌α-淀粉酶酸性pH穩(wěn)定性提升突變體的生化特征

羅丹，靳曉，牛丹丹*，謝銀珠，林娟，葉秀云

1(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州, 350116)2(福建福大百特科技發(fā)展有限公司，酶高效表達(dá)國家工程實驗室，福建 福州, 350002)

地衣芽胞桿菌α-淀粉酶酸性pH穩(wěn)定性提升突變體的生化特征

羅丹1，靳曉1，牛丹丹1*，謝銀珠2，林娟1，葉秀云1

1(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州, 350116)2(福建福大百特科技發(fā)展有限公司，酶高效表達(dá)國家工程實驗室，福建 福州, 350002)

地衣芽胞桿菌α-淀粉酶(Bacilluslicheniformisα-amylase, BLA) 的pH穩(wěn)定性在提升發(fā)酵生產(chǎn)過程特別是后提取工段的操作穩(wěn)定性，提高產(chǎn)品得率，弱化酶成品貯存條件和延長貨架期等方面具有重要價值。該研究對1株能夠合成更好pH穩(wěn)定性BLA的地衣芽胞桿菌B186 1-1的BLA進(jìn)行了分子克隆、序列分析及性質(zhì)研究，與模式菌株ATCC14580來源的BLA氨基酸序列相比發(fā)現(xiàn)，有4個位點的差異，包括：N4K、R134L、E243D和S320A。進(jìn)一步克隆表達(dá)與純化了該菌株的BLA，重組酶在80 ℃、pH 6.0～7.5下顯示最高活性；在pH 5.0下放置1 h，該酶保留80%以上酶活力，而來源于菌株ATCC14580的BLA在此相同條件下僅保留約10%酶活力；通過3D結(jié)構(gòu)模擬分析顯示BLA中的差異性堿基與其pH穩(wěn)定性存在相關(guān)關(guān)系。

高溫α-淀粉酶；天然突變體；pH穩(wěn)定性；酶學(xué)性質(zhì)

地衣芽胞桿菌α-淀粉酶(Bacilluslicheniformisα-amylase，BLA，EC 3.2.1.1)，又稱高溫α-淀粉酶，是工業(yè)上極其重要的高溫淀粉液化酶，可以以隨機(jī)作用方式水解淀粉分子內(nèi)的α-1,4-糖苷鍵，將其水解為糊精和一系列以葡萄糖為組成單位的低聚糖[1-2]，被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、紡織、造紙、洗滌液、飼料及石油開采等多種領(lǐng)域，占全球淀粉加工酶制劑總用量的30%[3-4]。

長期以來，針對BLA的研究主要包括：高表達(dá)、分子克隆與序列特征、定點突變與分子進(jìn)化獲得性能改進(jìn)的新分子等等[5-9]。如，通過建立與優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)，可實現(xiàn)BLA的超高水平的表達(dá)[10]；通過隨機(jī)突變篩選與體外人工進(jìn)化，顯著改善BLA在酸性條件下的催化活力[11]。另一方面，在BLA工業(yè)生產(chǎn)過程中，BLA的pH穩(wěn)定性對生產(chǎn)過程高效實施與控制也是十分重要的。BLA的pH穩(wěn)定性尤其是在較低pH下的穩(wěn)定性，可顯著提升發(fā)酵生產(chǎn)過程特別是后提取工段的操作穩(wěn)定性，提高產(chǎn)品得率，弱化酶成品貯存條件和延長貨架期。因此，找尋BLA的pH穩(wěn)定性突變體成為必然的研究內(nèi)容[12-14]。

本文在前期工作的基礎(chǔ)上，對1株產(chǎn)BLA的pH穩(wěn)定性能提高的地衣芽胞桿菌高溫α-淀粉酶進(jìn)行進(jìn)一步的分析鑒定，采用分子克隆技術(shù)克隆與序列分析了其編碼基因并就其重組酶的相關(guān)性能進(jìn)行了分析。研究結(jié)果可為BLA工業(yè)屬性的人工進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis) B186 1-1為從自然樣本中分離保藏的野生菌株；地衣芽胞桿菌模式菌株ATCC14580、用于質(zhì)粒構(gòu)建宿主的大腸桿菌(Escherichiacoli) JM109、用作表達(dá)宿主的E.coliBL21(DE3)、用作表達(dá)載體的質(zhì)粒pET28a(+)，皆由福建省海洋酶工程重點實驗室保藏。

1.2 試劑

限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I及T4DNA連接酶等購自Thermo公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒等分別購于Axygen；LATaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；硫酸卡那霉素購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基及配制方法

大腸桿菌常規(guī)培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10、酵母浸提物5、NaCl 5，加入2%瓊脂為固體培養(yǎng)基。必要時，在培養(yǎng)基中添加20g/mL硫酸卡那霉素。

1.4 分子克隆與基因擴(kuò)增通用方法

染色體DNA的提取、質(zhì)粒DNA的提取、酶切以及連接等按照常規(guī)實驗方法進(jìn)行[15]，使用試劑盒時按照試劑盒說明書進(jìn)行；大腸桿菌轉(zhuǎn)化采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法[16]。

PCR基因擴(kuò)增按如下方法進(jìn)行：設(shè)計BLA引物并化學(xué)合成，引物序列分別是：BLA-F：5'-TCGGGATCCGCAAATCTTAATGGGACGCTGATG-3'(下劃線部分為人工設(shè)計BamHI位點)、BLA-R：5'-GGGGAATTCCATTTCATCCCCGCCTTACCTAT-3'(下劃線部分為人工設(shè)計EcoRI位點)；PCR基因擴(kuò)增條件是：95 ℃ 5 min；94 ℃ 15s，62 ℃ 30s，72 ℃ 90s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.5 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

按照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行。將上述PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，再用BamHI和EcoRI雙酶切并純化，將此酶切后PCR產(chǎn)物克隆入pET28a(+)BamHI和EcoRI位點，重組質(zhì)粒pET28a(+)-amyLB186和pET28a(+)-amyL14580在E.coliJM109中鑒定與保藏。

1.6 重組菌的構(gòu)建與酶液制備

將上述構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-amyLB186和pET28a(+)-amyL14580轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，在含卡那霉素的LB平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子[17]。轉(zhuǎn)化子進(jìn)一步經(jīng)質(zhì)粒提取和限制性酶切圖譜分析。將正確的轉(zhuǎn)化子接種于在250 mL三角瓶中用LB 培養(yǎng)基在37 ℃，200 r/min下培養(yǎng)12～14 h；10% (v/v)的接種量將上述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min下振蕩培養(yǎng)至菌濃(OD600) 達(dá)到0.8左右，添加終濃度為1 mmol/L的IPTG，于30 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)8 h；離心收集菌體，以磷酸鹽緩沖液(pH 7.0) 洗滌懸浮，超聲波細(xì)胞破碎儀破碎菌體(600 W，破碎8 s，間隔10 s，共20 min)。離心收集上清即為粗酶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 重組酶的酶活測定

α-淀粉酶的活力檢測采用二硝基水楊酸(DNS)法[18]。0.9 mL 1.0%可溶性淀粉底物，70 ℃ 預(yù)熱5～8 min，加入用PBS緩沖液(pH 6.0)稀釋后的酶液0.1 mL，立即計時，準(zhǔn)確反應(yīng)30 min，迅速吸取反應(yīng)液0.5 mL加入到裝有1.5 mL DNS的比色管中，準(zhǔn)確煮沸15 min，立即冷卻至室溫并加入10.5 mL去離子水后于OD550測定吸光度。

酶活力單位定義為：1 mL稀釋酶液在pH 6.0、70 ℃條件下，1 h水解1.0%可溶性淀粉產(chǎn)生1 mg葡萄糖定義為1個酶活力，用U/mL表示。

1.8 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.8.1 酶的最適反應(yīng)溫度

用pH 6.0的PBS緩沖液配制1.0%的可溶性淀粉底物，并用pH 6.0的PBS緩沖液稀釋酶液，用1.7的酶活測定方法在30～100 ℃溫度下進(jìn)行淀粉酶的酶活測定。以最高酶活力為100%，計算其他溫度下的相對酶活力，以確定其最適反應(yīng)溫度。

1.8.2 酶的熱穩(wěn)定性

用最適pH的PBS緩沖液配制1.0%的可溶性淀粉底物，并用最適pH的PBS緩沖液稀釋酶液，將稀釋好的酶液分別在60、65、70、75、80 ℃下保溫1 h，每隔10 min取樣，冰浴30 min后，用1.7的方法在最適溫度下測定處理后各酶液的相對酶活力，以未進(jìn)行熱處理的酶液酶活力為100%，計算相對酶活，以確定酶的熱穩(wěn)定性。

1.8.3 酶的最適pH

用pH 3.0～9.0的PBS緩沖液配制1.0%的可溶性淀粉底物，并用相應(yīng)pH的PBS緩沖液稀釋酶液，以保證酶液處于不同的pH環(huán)境中，用1.7的方法在最適溫度下測定酶液在不同pH環(huán)境中的相對酶活力，以最高酶活力為100%，計算其他作用pH值下的相對酶活力，以確定其最適作用pH。

1.8.4 酶的pH穩(wěn)定性

用最適pH的PBS緩沖液配制1.0%的可溶性淀粉底物，并用pH 3.0～9.0的PBS緩沖液稀釋酶液，把稀釋好的酶液放在37 ℃條件下處理1 h，用1.7的方法在最適溫度下測定處理后各酶液的相對酶活力，以未進(jìn)行處理的酶液酶活力為100%，計算相對酶活，以確定酶的pH穩(wěn)定性。

1.9 序列分析與三級結(jié)構(gòu)模擬分析

PCR產(chǎn)物的核苷酸序列測定，采用雙脫氧核苷鏈終止法進(jìn)行[19]。核苷酸序列相似性分析利用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行，氨基酸序列比對分析使用Clustal X2進(jìn)行。BLA的三維結(jié)構(gòu)模擬，利用在線軟件Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org)，以PDB數(shù)據(jù)庫中的1vjs.1.A(序列相似度99.38%)為模板進(jìn)行同源建模分析[20]。

2 結(jié)果與討論

2.1 高溫α-淀粉酶的基因克隆

菌株B186 1-1為前期分離鑒定的1株地衣芽胞桿菌，合成與分泌pH穩(wěn)定性能顯著提高的BLA(未發(fā)表數(shù)據(jù))。以此染色體DNA為模板，BLA-F、BLA-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出1.45 kb的基因片段。將此基因片段經(jīng)酶切并克隆入pET28a(+)，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-amyLB186。相似地，以模式菌株14580的染色體DNA為模板，擴(kuò)增獲得相應(yīng)BLA編碼基因，克隆獲得重組質(zhì)粒pET28a(+)-amyL14580。

2.2 高溫α-淀粉酶的重組表達(dá)與重組酶的制備

將構(gòu)建獲得的重組質(zhì)粒pET28a(+)-amyLB186和pET28a(+)-amyL14580轉(zhuǎn)入大腸桿菌DE3中，分別獲得重組菌DE3(pET28a(+)-amyLB186)和DE3(pET28a(+)-amyL14580)。重組菌DE3(pET28a(+)-amyLB186)在培養(yǎng)與誘導(dǎo)條件下能夠很好地表達(dá)，SDS-PAGE顯示，在55 kDa處第2～3泳道均出現(xiàn)了明顯條帶，與第1泳道中條帶對比有明顯差異，且大小與BLA理論值相符[7]，證明目的蛋白成功表達(dá)(圖1)。進(jìn)一步經(jīng)過收集細(xì)胞、破碎菌體、親和柱純化等步驟制備與純化重組酶，獲得了電泳純的重組酶(圖1)。同樣的方式制備并純化模式菌株14580來源的α-淀粉酶。

M-蛋白質(zhì)分子標(biāo)準(zhǔn)樣品；1-菌株DE3(pET28a)菌體(對照)；2-菌株DE3(pET28a(+)-amyLB186))誘導(dǎo)培養(yǎng)后菌體破碎后離心上清；3-親和純化后的B186 1-1α-淀粉酶圖1 重組大腸桿菌表達(dá)α-淀粉酶的SDS-PAGE分析Fig.1 The profile of SDS-PAGE of the recombinant E.coli expressed α-amylase

2.3 B186 1-1 α-淀粉酶在酸性pH條件下的穩(wěn)定性顯著提高

B186 1-1 α-淀粉酶及14580 α-淀粉酶分別用pH 3.0～9.0的PBS緩沖液在37 ℃條件下保溫處理1 h，采用1.7描述的方法以未進(jìn)行保溫處理的酶活力為100%，在pH 7.0，80 ℃下測定酶活力，計算殘余酶活力，確定酶的pH穩(wěn)定性，得到B186 1-1 α-淀粉酶和模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶的pH穩(wěn)定性曲線(圖2)。

圖2 α-淀粉酶的pH穩(wěn)定性Fig.2 Effect of pH on the stability of the α-amylase

從圖2可以看到，B186 1-1 α-淀粉酶在pH值5.5～9.0的范圍內(nèi)基本保持穩(wěn)定，酶活力在95%以上，模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶在pH為5.5時，酶活力已經(jīng)降至64%；在pH 5.0下放置1 h，B186 1-1 α-淀粉酶保留80%以上酶活力，而模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶僅保留約10%酶活力；當(dāng)pH<5.0時B186 1-1 α-淀粉酶活力迅速減小，在pH 4.5～5.0緩沖液下于37 ℃保溫1 h，還能保持50%以上的酶活力，而模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶就基本檢測不到活性了。和模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶相比，B186 1-1 α-淀粉酶有更好的pH穩(wěn)定性。

2.4 B186 1-1 α-淀粉酶在酸性pH條件下的活力有所提高

用pH 3.0～9.0的PBS緩沖液配制1.0%的可溶性淀粉底物，并用不同pH的PBS緩沖液稀釋酶液，采用1.7的方法在80 ℃條件下測定酶液在不同pH環(huán)境中的相對酶活力，得到pH對B186 1-1 α-淀粉酶和模式菌株ATCC14580α-淀粉酶酶活力的影響曲線(圖3)。

從圖3可以看到，pH對酶活力的影響較大，在pH值為7.0時，B186 1-1 α-淀粉酶和ATCC14580 α-淀粉酶都能發(fā)揮最大活性，2種酶的最適作用pH為pH 7.0；pH在6.0～7.0范圍內(nèi)，B186 1-1 α-淀粉酶可保留90%以上的酶活力，模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶在pH為6時，酶活力已經(jīng)降至80%； pH 5.0時，B186 1-1 α-淀粉酶可保留30%左右的酶活，而ATCC14580 α-淀粉酶，就基本已經(jīng)檢測不到活性了。

圖3 pH對酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on the activity

2.5 B186 1-1 α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度與熱穩(wěn)定性發(fā)生顯著變化

用pH 6.0的PBS緩沖液配制1.0%的可溶性淀粉底物，用1.7的方法測定30 ℃～100 ℃的相對酶活力，得到溫度對B186 1-1 α-淀粉酶和模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶酶活力的影響曲線(圖4)。

圖4 溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity

由圖4可知，B186 1-1 α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為80 ℃，模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶的最適反應(yīng)溫度為75 ℃。溫度小于80 ℃時，隨著溫度的升高酶活力都慢慢上升；溫度大于80 ℃時，隨著溫度的上升酶活力都急劇下降；溫度為30～95 ℃時，B186 1-1 α-淀粉酶可保留50%以上的酶活力，模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶在95 ℃時，酶活力已經(jīng)降至20%；溫度為100 ℃時，該淀粉酶保留了約40%的酶活力，而模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶僅保留15%左右的酶活力。與模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶相比，B186 1-1 α-淀粉酶的溫度作用范圍更廣。

進(jìn)一步研究其熱穩(wěn)定性，用pH 7.0的PBS緩沖液配制1.0%的可溶性淀粉底物，將酶液分別在60、65、70、75、80 ℃下保溫1 h，每隔10 min取樣，冰浴30 min后，用1.7的方法在80 ℃條件下測定處理后各酶液的相對酶活力，得到B186 1-1 α-淀粉酶和模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性曲線(圖5)。

圖5 α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 Effect of temperature on the stability of the α-amylase

從圖5可以看出，B186 1-1 α-淀粉酶在60 ℃和65 ℃條件下比較穩(wěn)定，保溫1 h后酶活力都能保留90%以上，而模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶在60 ℃和65 ℃條件下保溫1 h后酶活力僅剩分別為35%和10%左右； B186 1-1 α-淀粉酶70 ℃條件下保溫1 h后酶活力約為80%，模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶在70 ℃條件下保溫20 min后就檢測不到酶活力了；當(dāng)溫度在75 ℃和80 ℃時，B186 1-1 α-淀粉酶活性的半衰期為分別為50 min和20 min，而模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶此條件下10 min不足10%。與模式菌株ATCC14580 α-淀粉酶相比，B186 1-1 α-淀粉酶的熱穩(wěn)定性有很大的提高。

2.6 α-淀粉酶編碼基因的序列分析與3D結(jié)構(gòu)模擬分析

將菌株B186 1-1來源的BLA編碼基因進(jìn)行核苷酸序列測定，與模式菌株14580來源的BLA編碼基因進(jìn)行序列比對，由圖6可知二者的核苷酸序列中的存在A12T、C72T、G401T、T729G、T939C、G958T等6個核苷酸堿基的差異，進(jìn)一步對其演繹的氨基酸序列進(jìn)行比對分析(圖7)，其相應(yīng)的成熟肽中K4N、R134L、D243E、A320S等4個位點存在差異。

圖6 BLA編碼基因核苷酸序列比對Fig.6 The nucleotide sequences alignment of BLA encoding gene

圖7 BLA編碼基因氨基酸序列比對Fig.7 The amino acid sequences alignment of BLA encoding gene

通過Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org)獲得其3D結(jié)構(gòu)模型(圖8和圖9)。通過對模型進(jìn)行觀察知，K4N和D243E兩個位點位于α-螺旋上，A320S和R134L兩個位點位于β-折疊上。推測這些位點對其酶學(xué)性質(zhì)有相關(guān)性，尤其是提升了BLA在酸性條件下的pH的穩(wěn)定性。后續(xù)將進(jìn)一步通過定點突變及飽和突變進(jìn)一步探究這些位點對酸性條件下pH穩(wěn)定的影響，為改造工業(yè)應(yīng)用屬性的BLA奠定生物信息學(xué)基礎(chǔ)。

圖8 B186 1-1 α-淀粉酶的3D結(jié)構(gòu)模型Fig.8 The 3D structure model of B186 1-1 α-amylase

圖9 ATCC14580 α-淀粉酶的3D結(jié)構(gòu)模型Fig.9 The 3D structure model of ATCC14580 α-amylase

3 結(jié)論

通過對1株產(chǎn)BLA的pH穩(wěn)定性能提高的地衣芽胞桿菌高溫α-淀粉酶的分析鑒定，采用分子克隆技術(shù)克隆與序列分析了其編碼基因并對其重組酶的相關(guān)性能進(jìn)行了分析。本論文的研究結(jié)果可為BLA工業(yè)屬性的人工進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。

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Biochemical characterization ofBacilluslicheniformisα-amylase mutant with improved acidic pH stability

LUO Dan1, JIN Xiao1, NIU Dan-dan1*, XIE Yin-zhu2,LIN Juan1,YE Xiu-yun1

1 (Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering, College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116,China)2 (National Engineering Laboratory for High-Efficiency Enzyme Expression，F(xiàn)udaBioTech Co． Ltd，F(xiàn)uzhou 350002,China)

The pH stability ofBacilluslicheniformisα-amylase (BLA) has important value in its manufacturing by a fermentation process, especially at downstream recovery stage, improvement of recovery yield, easy storage conditions and extended shelf life of enzyme product. In the present studies, the cloning, sequence analysis and biochemical characterization of an α-amylase gene fromB.licheniformisstrain B186 1-1, a wild type isolate with BLA activity and improved pH stability were reported. In comparison withB.licheniformisATCC 14580, four residues were different, including N4K, R134L, E243D and S320A. This BLA was then expressed in Escherichia coli and the recombinant enzyme was prepared and purified to SDS-PAGE-grade purity. The biochemical properties of the recombinant enzyme were investigated. The recombinant enzyme exhibited the highest activity at 80 ℃ and pH 6.0-7.5 and retained more than 80% of the activity after incubating at pH 5.0 for 1 h, which is significantly improved compared with BLA fromB.licheniformisATCC14580 retaining only about 10% of the enzyme activity. The 3D structure prediction and analysis were further performed and the relationship between the mutated amino acid residues and acidic pH stability was discussed.

B.licheniformisα-amylase; natural mutant; pH stability; enzymatic properties

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705004

碩士研究生(牛丹丹為通訊作者,E-mail：ddniu0529@fzu.edu.cn)。

福建省教育廳產(chǎn)學(xué)研項目(JA15049)；國家自然科學(xué)基金(31601407)；福建省自然科學(xué)基金(2016J01157)；福州大學(xué)人才基金(XRC-1564)

2016-012-13，改回日期：2017-02-17