磷脂微乳電動(dòng)色譜的定量結(jié)構(gòu)保留關(guān)系研究

宋靜+鄭園+霍長(zhǎng)虹+劉建芳

摘 要 以大豆磷脂為主要的表面活性劑，制備適合毛細(xì)管電動(dòng)色譜使用的不同構(gòu)成比的微乳體系， 應(yīng)用溶劑化參數(shù)模型研究了中性溶質(zhì)在其中的定量結(jié)構(gòu)保留關(guān)系。使用動(dòng)態(tài)涂層毛細(xì)管， 以二甲基亞砜和十二烷基苯分別作為電滲流和微乳液滴遷移的標(biāo)記物， 測(cè)定了26個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)小分子中性化合物在17種微乳電動(dòng)色譜體系下的保留因子， 建立了線性溶劑化能量關(guān)系（LSER）方程。通過(guò)比較兩體系的LSER方程系數(shù)比較體系相似性。結(jié)果表明， 本研究建立的磷脂微乳電動(dòng)色譜體系在線性溶劑化特征上和其它構(gòu)成的微乳電動(dòng)色譜體系相似。對(duì)溶質(zhì)保留貢獻(xiàn)較大的是溶質(zhì)體積和有效氫鍵堿度， 油相種類(lèi)及濃度對(duì)溶質(zhì)的保留選擇性無(wú)明顯影響。

關(guān)鍵詞 微乳電動(dòng)色譜； 大豆磷脂； 保留因子； 線性溶劑化能量關(guān)系

1 引 言

微乳電動(dòng)色譜（Microemulsion electrokinetic chromatography， MEEKC）是使用微乳作為分離介質(zhì)的電泳技術(shù)， 具有分離效率高、適用范圍廣和樣品消耗少等優(yōu)勢(shì)， 已廣泛應(yīng)用于分離科學(xué)領(lǐng)域[1，2]。中性物質(zhì)在MEEKC系統(tǒng)中依據(jù)其在水相和假固定相（微乳液滴）的分配系數(shù)不同而實(shí)現(xiàn)分離， 而帶電物質(zhì)除了在兩相間的分配系數(shù)不同外， 還有物質(zhì)間的靜電作用。MEEKC的選擇性通過(guò)假固定相的改變實(shí)現(xiàn)， 不同的表面活性劑、油相、助表面活性劑和有機(jī)改性劑的加入都會(huì)改變微乳對(duì)分離物的選擇性。盡管MEEKC的應(yīng)用已有20余年， 已有許多關(guān)于微乳體系構(gòu)成的報(bào)道[3]， 但最常用的仍是以十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate， SDS）作為表面活性劑制備的微乳。Lucangioli等[4，5] 最初將磷脂類(lèi)生物表面活性劑引入MEEKC體系中， 并將其應(yīng)用于免疫抑制劑倍他米松及其衍生物的正辛醇/水分配系數(shù)（nOctanol/water partition coefficient， lgP）測(cè)定， 發(fā)現(xiàn)用磷脂類(lèi)生物表面活性劑制備的微乳體系預(yù)測(cè)以上藥物的lgP值更準(zhǔn)確。但是該研究?jī)H檢測(cè)了4種藥物， 且未見(jiàn)應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)行其它藥物集合lgP值測(cè)定的報(bào)道， 因此磷脂類(lèi)微乳電動(dòng)色譜體系提高藥物lgP值預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性的結(jié)論尚不十分肯定。磷脂類(lèi)微乳與其它構(gòu)成的微乳體系是否存在保留機(jī)制的差別也未見(jiàn)報(bào)道。

線性溶劑化能量關(guān)系（Linear solvation energy relationship， LSER）模型廣泛用于各種色譜體系的溶質(zhì)保留機(jī)制研究[6～8]以及正辛醇水分配系數(shù)[7]和藥物體內(nèi)透膜過(guò)程的預(yù)測(cè)[9，10]。通過(guò)方程系數(shù)間的比較， 可以發(fā)現(xiàn)不同分配體系的相似性， 選擇合適的色譜體系用于藥物膜通透性的篩選[7，11]。本研究采用LSER模型， 對(duì)應(yīng)用大豆磷脂制備的微乳體系進(jìn)行MEEKC分離時(shí)的溶質(zhì)保留機(jī)制進(jìn)行研究， 比較了不同磷脂構(gòu)成比、不同油相及油相含量對(duì)LSER方程系數(shù)的影響， 同時(shí)將磷脂微乳體系與其它表面活性劑構(gòu)成的微乳或膠束體系進(jìn)行了比較， 擬闡明磷脂類(lèi)成分和油相組分在微乳分離體系中的作用， 為進(jìn)一步應(yīng)用磷脂類(lèi)微乳電動(dòng)色譜體系進(jìn)行藥物膜通透性的預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀、DAD檢測(cè)器（美國(guó)Beckman公司）；彈性石英毛細(xì)管柱（河北永年光導(dǎo)纖維廠， 60 cm×50 μm， （id）， 有效長(zhǎng)度50 cm）；Malvern Zetasizer Nano ZS90型激光粒度散射儀（英國(guó)Malvern公司）；KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）； pH3C型pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）

十二烷基硫酸鈉（石家莊市拜昂生物技術(shù)有限公司）；聚凝胺（PB， 美國(guó)Sigma公司）；葡聚糖硫酸鹽（DS， 美國(guó)Sigma公司）；大豆磷脂（注射級(jí)， 上海太偉藥業(yè)股份有限公司）；膽酸鈉（美國(guó)Sigma公司， BioXtra ≥ 99%）；脫氧膽酸鈉（SigmaAldrich 公司）；十七氟辛烷磺酸四乙基銨鹽（Aldrich 公司）；十六烷三甲基溴化銨、十二烷基苯（Sigma公司）；肉豆蔻酸異丙酯（上海源葉生物科技有限公司）；正丁醇、正辛醇、正庚烷（分析純， 天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；全氟辛基磺酸鉀（Aldrich 公司）；二甲基亞砜（DMSO， 分析純， 天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司）；甲醇（色譜純， 天津市康科德科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水為某品牌純凈水。

待測(cè)化合物見(jiàn)表1， 其中間二甲苯、對(duì)二甲苯由河北科技大學(xué)提供， 其余均由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供。

2.2 微乳和化合物儲(chǔ)備液的制備

優(yōu)化的微乳處方構(gòu)成見(jiàn)表2。稱(chēng)取適量的表面活性劑于密封性容器內(nèi)， 用水相（20 mmol/L NaH2PO4）溶解， 依次加入助表面活性劑、油相， 混勻、超聲30 min， 室溫靜置（12 h 以上）至微乳溶液搖晃后仍澄清， 表明形成穩(wěn)定微乳， 最后用飽和NaOH調(diào)至所需pH值， 備用， 使用前用0.45 μm濾膜過(guò)濾。

根據(jù)Vitha等[12]對(duì)建立溶劑化方程的溶質(zhì)集合篩選提出的指導(dǎo)原則， 共收集了26個(gè)具有不同結(jié)構(gòu)特征的小分子中性化合物及其Abraham分子描述符（見(jiàn)表1）， 分別用甲醇溶解， 配制成3～100 mg/mL儲(chǔ)備液， 進(jìn)樣前用微乳液稀釋至0.1～3 mg/mL。

1 mL微乳液中加入6 μL苯甲酰胺甲醇溶液（30 mg/mL）、6 μL鄰甲苯胺甲醇溶液（100 mg/mL）、4 μL 2萘酚甲醇溶液（100 mg/mL）和6 μL 電滲流標(biāo)記物DMSO、4 μL 微乳標(biāo)記物十二烷基苯， 作為標(biāo)準(zhǔn)混合液。

2.3 保留因子的測(cè)定

2.3.1 毛細(xì)管預(yù)處理 （1）毛細(xì)管活化 用甲醇沖洗新管3 min， 再依次用水沖洗0.5min、 0.1 mol/L HCl 沖洗15 min、水沖洗0.5 min、1 mol/L NaOH 沖洗15 min。（2）毛細(xì)管涂層 毛細(xì)管活化后靜置30 min， 先用5% PB溶液沖洗20 min， 靜置20 min后， 再用3%DS溶液沖洗20 min， 靜置30 min， 使用前用水沖洗5 min即可。

2.3.2 測(cè)定條件 毛細(xì)管柱總長(zhǎng)度60 cm（有效長(zhǎng)度50 cm， 內(nèi)徑50 μm）， ±20 kV恒壓分離， 檢測(cè)波長(zhǎng)208 nm， 壓力進(jìn)樣（0.8 psi， 8 s）， 柱溫25℃。

2.3.3 不同MEEKC體系下保留因子的測(cè)定與計(jì)算 陰離子型微乳（表2中ME1ME16）采用+20 kV電壓， 陽(yáng)離子型微乳（表2中ME17）采用20 kV電壓分離， 柱溫25℃。保留因子k按下式計(jì)算 [13]：

2.3.4 保留因子與Abraham描述符間LSER的建立 LSER理論是基于腔穴模型， 解釋溶質(zhì)在兩相間轉(zhuǎn)移[14]， LSER方程一般描述如下：

SP作為給定系統(tǒng)的一種溶劑化性能， 例如溶劑的保留行為的對(duì)數(shù)（lgk）、正辛醇/水分配系數(shù)（lgP）、穩(wěn)態(tài)血腦藥物濃度比（lgB）等；方程中的大寫(xiě)字母是Abraham溶質(zhì)描述符， E表示摩爾折射率， S表示溶質(zhì)偶極/極化率， B和A分別表示有效氫鍵堿度和酸度， V代表特征體積；小寫(xiě)字母 e， s， a， b和v是通過(guò)多元線性回歸得到的各個(gè)變量的系數(shù)， 反映了給定系統(tǒng)的性質(zhì)即溶劑化參數(shù)對(duì)系統(tǒng)的貢獻(xiàn)大小， 其中e代表分配系統(tǒng)中的溶質(zhì)分子與溶劑的π或n電子的作用；s反映系統(tǒng)兩相間的偶極/極化率；b和a分別代表系統(tǒng)的有效氫鍵堿度和酸度；v代表系統(tǒng)的空穴的形成能力或內(nèi)聚能；常數(shù)c是方程的截距， 由溶質(zhì)和系統(tǒng)間恒定的相互作用產(chǎn)生， 如相體積比。

本研究將不同微乳體系下測(cè)得的26個(gè)化合物的保留因子（lgk）與Abraham描述符間建立了LSER方程。

3 結(jié)果與討論

3.1 微乳體系構(gòu)成

通過(guò)改變表面活性劑及油相的種類(lèi)和濃度制備的穩(wěn)定微乳處方組成見(jiàn)表 2。

文獻(xiàn)[15]報(bào)道， 制備微乳時(shí)各組分的加入順序會(huì)影響微乳的形成， 但是本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 超聲和靜置有助于微乳的形成， 即使改變組分的加入順序， 仍能夠形成穩(wěn)定的微乳體系。微乳制備和保存都應(yīng)在密封的容器內(nèi)進(jìn)行， 以防止油相和丁醇等成分的揮發(fā)影響微乳的構(gòu)成。運(yùn)行MEEKC時(shí)， 洗脫時(shí)間窗口的大小與微乳中助表面活性劑及表面活性劑的濃度相關(guān)， 本研究控制時(shí)間窗都在20 min以上， 以保證洗脫窗內(nèi)能夠容納較多的溶質(zhì)。

3.2 微乳穩(wěn)定性

通過(guò)外觀、粒徑和電位變化考察了微乳的穩(wěn)定性， 部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。從表中粒徑和Zeta電位值可知， 微乳室溫存放30天， 粒徑和表面電位無(wú)明顯變化。

3.3 溶質(zhì)保留時(shí)間和保留因子重現(xiàn)性

以ME5為電動(dòng)色譜流動(dòng)相， 用標(biāo)準(zhǔn)混合液進(jìn)樣， 考察動(dòng)態(tài)涂層條件下溶質(zhì)保留時(shí)間的重復(fù)性， 圖1是典型的色譜圖。結(jié)果表明， 應(yīng)用文獻(xiàn)[16]報(bào)道的涂層方法（見(jiàn)2.3.1節(jié)毛細(xì)管涂層）， 使用同批次微乳液， 連續(xù)測(cè)定3天， 總進(jìn)樣60針（每針運(yùn)行時(shí)間在20 min以上）， 化合物的遷移時(shí)間RSD<2.5%。隨著進(jìn)樣針數(shù)的增加和進(jìn)樣時(shí)間的延長(zhǎng)， 遷移時(shí)間RSD變大， 原因可能是樣品在毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附或涂層有損壞。因此測(cè)定樣品過(guò)程中， 需要用標(biāo)準(zhǔn)混合溶液進(jìn)行重復(fù)性檢測(cè)， 如標(biāo)準(zhǔn)樣品的遷移時(shí)間出現(xiàn)較大偏差， 則需對(duì)毛細(xì)管進(jìn)行沖洗；沖洗后無(wú)改善則需重新涂層處理， 以確保溶質(zhì)遷移時(shí)間的重復(fù)性。從表4可見(jiàn)， 各被測(cè)物保留時(shí)間與保留因子測(cè)定的重復(fù)性均良好。但為了保證保留因子測(cè)定的準(zhǔn)確性， 每個(gè)樣品溶液中都加入DMSO和十二烷基苯， 以盡量減少遷移時(shí)間變化帶來(lái)的保留因子測(cè)定誤差。

3.4 不同微乳體系下的LSER方程

收集26個(gè)不同結(jié)構(gòu)的小分子中性化合物， 以表2中的微乳體系作為分離介質(zhì)， 測(cè)定溶質(zhì)的保留因子， 用SPSS 19.0進(jìn)行保留因子與溶質(zhì)描述符間的多元線性回歸， 建立LSER方程， 結(jié)果見(jiàn)表5。

總體上看， 實(shí)驗(yàn)中得出的各個(gè)微乳電動(dòng)色譜體系的LSER方程系數(shù)都比較接近， 其中v和b的系數(shù)絕對(duì)值較大， 表明溶質(zhì)的體積和氫鍵堿性對(duì)溶質(zhì)保留貢獻(xiàn)較大。 v絕對(duì)值較大表明體系中油滴形成腔穴對(duì)溶質(zhì)保留所需能量低于水相； b值為負(fù)值表明微乳氫鍵堿性小于緩沖液， 隨著溶質(zhì)氫鍵堿性的增加將不利于溶質(zhì)進(jìn)入假固定相中。 a值在各體系LSER方程中大部分為負(fù)值且接近于0， 表明溶劑氫鍵受體能力在油水兩相間的性能相似； s和 e的絕對(duì)值較小， 表明在溶質(zhì)保留機(jī)制中偶極/極化率和溶質(zhì)分子與溶劑的π或n電子的作用較弱[7，17]。

微乳相對(duì)于膠束溶液來(lái)說(shuō)， 主要不同在于加入了助表面活性劑和油相[18]， 本研究系統(tǒng)比較了不同油相種類(lèi)和含量對(duì)體系特征的影響。從表5中ME1～ME3， ME4～ME6體系的LSER方程可見(jiàn)， 在其它組成不變的情況下， 庚烷從0到1.0%， 辛醇從0到1.5%， LSER系數(shù)沒(méi)有明顯變化。 從ME2， ME5， ME7的方程系數(shù)可見(jiàn)， 不同油相種類(lèi)（庚烷、辛醇、IPM）對(duì)體系特征也無(wú)影響。這些結(jié)果表明油相對(duì)MEEKC測(cè)定中性化合物的分離選擇性沒(méi)有明顯影響。若待測(cè)化合物有一定的解離性， 則其分離選擇性可能與油相有關(guān)[2]。助表面活性劑一般為短鏈醇， 它的加入可以改變微乳液滴的表面電荷密度和微乳結(jié)構(gòu)的剛性， 有利于溶質(zhì)的溶解和洗脫[10]。

表面活性劑的種類(lèi)直接影響微乳的表面特性。SDS是MEEKC系統(tǒng)常用的表面活性劑， 本實(shí)驗(yàn)對(duì)以大豆磷脂和碳氟表面活性劑作為表面活性劑的新型微乳體系的溶劑化特征進(jìn)行了研究（ME1， ME4， ME8， ME17）。結(jié)果表明， 大豆磷脂的加入， 沒(méi)有改變微乳體系的基本特征。而據(jù)文獻(xiàn)[19，20]報(bào)道， 在碳氟表面活性劑構(gòu)成的膠束溶液中， 因碳原子上的所有氫原子被氟原子取代， 在溶質(zhì)分配行為中氫鍵酸度作用貢獻(xiàn)增加， 甚至強(qiáng)于氫鍵堿度， 與SDS膠束體系中氫鍵酸度貢獻(xiàn)很小的結(jié)果顯著不同。但本研究未得到一致結(jié)果， 在PFOSK或PFOSNH4形成的微乳體系中， 依然是氫鍵堿度的作用突出。這可能是因?yàn)楸狙芯縋FOSK或PFOSNH4體系中加入了SDS、SDC和丁醇等， 而SDS和SDC的氫鍵堿度作用貢獻(xiàn)較大。

此外， 本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)， 陽(yáng)離子型表面活性劑CTAB建立的MEEKC體系的LSER方程系數(shù)與陰離子型表面活性劑構(gòu)成MEEKC體系（ME1ME9）相比也無(wú)較大差異， 表明微乳液滴只是作為一個(gè)相對(duì)于水相極性較弱的假固定相， 其表面電荷性質(zhì)不影響中性化合物的分離選擇性。

3.5 與文獻(xiàn)報(bào)道的其它色譜系統(tǒng)的比較

其它應(yīng)用LSER模型研究溶質(zhì)保留機(jī)制的色譜系統(tǒng)有磷脂膜色譜、膠束、微乳電動(dòng)色譜系統(tǒng)等[21～27]， 本研究應(yīng)用Lázaro 等提出的矢量距離法[28]比較了所建新型MEEKC系統(tǒng)與其它色譜系統(tǒng)間的接近程度。距離參數(shù)d的計(jì)算方法如下方程：

其中， p代表v， s， e， b， a中的任一系數(shù)， u代表標(biāo)準(zhǔn)化， i和j指待比較的兩系統(tǒng)。本研究建立的體系與文獻(xiàn)[13～19]報(bào)道的常見(jiàn)系統(tǒng)的比較見(jiàn)表6。

根據(jù)文獻(xiàn)[6，29]報(bào)道， 系統(tǒng)間的距離d<0.25， 表明兩系統(tǒng)特征較相似。從表6可見(jiàn)， 所建立的各種微乳體系彼此間距離d<0.1， 說(shuō)明彼此間特征相近。所建微乳體系與正辛醇/水分配系數(shù)（lgP）、MEEKCSDS和磷脂膜色譜（pH 7.4）系統(tǒng)間的d值均約為0.25， 表明MEEKC、磷脂膜色譜與正辛醇水系統(tǒng)所測(cè)得的親脂性參數(shù)一致， 表明MEEKC是預(yù)測(cè)lgP值的實(shí)用工具[7]。本研究中所用的磷脂微乳體系與其它MEEKC體系相比， 基線穩(wěn)定性更好， 分離能力更強(qiáng)。

4 結(jié) 論

對(duì)于本研究測(cè)定的中性化合物， 無(wú)論是在大豆磷脂、SDS、CTAB， 還是碳氟類(lèi)表面活性劑制備的微乳電動(dòng)色譜中， 所得保留因子的LSER方程的基本特征相似， 都是v和b較大， 即溶質(zhì)的體積和氫鍵堿度對(duì)其在微乳中的保留影響較大， 前者利于保留， 后者減弱保留。各體系之間距離也非常接近， 說(shuō)明表面活性劑類(lèi)型和油相組成對(duì)中性溶質(zhì)在微乳體系中的保留選擇性均無(wú)明顯影響。若不考慮油相對(duì)微乳液滴剛性結(jié)構(gòu)的影響， 微乳體系或許可以稱(chēng)為助表面活性劑修飾的膠束體系。

References

1 Chang C W， Chen Y C， Liu C Y. Electrophoresis， 2015， 36（21）： 2745-2753

2 Xiao W， Zhang Q， Chen C， Zhang Q H， Hu Y J， Xia Z N， Yang F Q. J. Pharm. Sci， 2016， 54（9）： 1678-1686

3 Buchberger W. Method Mol. Biol.， 2016， 1483： 91-109

4 Lucangioli S E， Kenndler E， Carlucci A， Tripodi V P， Scioscia S L， Carducci C N. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2003， 33（5）： 871-878

5 Lucangioli S E， Carducci C N， Scioscia S L， Carlucci A， Bregni C， Kenndler E. Electrophoresis， 2003， 24（6）： 984-991

6 Li L X， Yang J R， Huang H Z， Xu L Y， Gao C K， Li N. Biomed. Chromatogr.， 2016， 30（7）： 996-1006

7 Subirats X， Yuan H P， Chaves V， Marzal N， Rosés M. Electrophoresis， 2016， 37（14）： 2010-2016

8 Janicka M. J. Chromatogr. Sci.， 2014， 52（7）： 676-684

9 Baynes R E， Xia X R， Vijay V， Vijay J E. SAR QSAR Environ. Res.， 2008， 19（78）： 615-630

10 Stepnik K E， Malinowska I. J. Chromatogr. A， 2013， 1286： 127-136

11 Liu J F， Sun J， Sui X F， Wang Y J， Hou Y N， He Z G. J. Chromatogr. A， 2008， 11981199： 164-172

12 Vitha M， Carr P W. J. Chromatogr. A， 2006 1126（12）： 143-194

13 Jiang Z J， Reilly J， Everatt B， Briard E. J. Pharm. Biomed. Anal.， 2011， 54（4）： 722-729

14 Lesellier. E. J. Chromatogr. A， 2015， 1389： 49-64

15 Liu J F， Sun J， Wang Y J， Li H Y， Sui X F， Li Y， He Z G. Asian J. Pharmaceut. Sci.， 2008， 3（4）： 158-167

16 Katayama H， Ishihama Y， Asakawa N. Anal. Chem.， 1998， 70（11）： 2254-2260

17 LI Jie， SUN Jin， HE ZhongGui. Acta Pharmaceutica Sinica， 2007， 42（1）： 13-18

李 潔， 孫 進(jìn)， 何仲貴. 藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2007， 42（1）： 13-18

18 LIU JianFang， SUI XiaoFan， SUN Jin， WANG Yongjun， HE ZhongGui. J. Anal. Chem.， 2008， 36（12）： 1742-1748

劉建芳， 隋曉璠， 孫 進(jìn)， 王永軍， 何仲貴. 分析化學(xué)， 2008， 36（12）： 1742-1748

19 Esaka Y， Rin F， Kobayashi M， Osako R， Murakami H， Uno B. J. Chromatogr. A， 2014， 1385（2）： 261-268

20 Fuguet E， Ràfols C， Bosch E， Rosés M， Abraham M H. J. Chromatogr. A， 2001， 907（12）： 257-265

21 Abraham M H， Chadha H S， Whiting G S，Mitchell R C. J. Pharm. Sci.， 1994， 83（8）： 1085-1100

22 Li J， Sun J， Cui S M， He Z G. J. Chromatogr. A， 2006， 1132（12）： 174-182

23 Valko K， Du C M， Bevan C D， Reynolds D P， Abraham M H. J. Pharm. Sci.， 2000， 89（8）： 1085-1096

24 Trone M D， Khaledi M G. Anal. Chem.， 1999， 71（7）： 1270-1277

25 Abraham M H， Treiner C， Rosés M，Rafols C， Ishihama Y. J. Chromatogr. A， 1996， 752（12）： 243-249

26 García M A， Vitha M F， Sandquist J， Mulville K， Marina M L. J. Chromatogr. A， 2001， 918（1）： 1-11

27 García M A， Vitha M F， Marina M L. J. Liq. Chrom. Rel. Technol.， 2000， 23（6）： 873-895

28 Lázaro E， Ràfols C， Abraham M H， Rosés M. J. Med. Chem.， 2006， 49（16）： 4861-4870

29 Poole S K， Poole C F. J. Chromatogr. A， 2008， 1182（1）： 1-24