遵義市冰核細(xì)菌分離鑒定及拮抗細(xì)菌篩選

趙晨心，丁海霞，彭麗娟

(貴州大學(xué) a.農(nóng)學(xué)院， b.煙草學(xué)院， c.煙草工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

遵義市冰核細(xì)菌分離鑒定及拮抗細(xì)菌篩選

趙晨心a，丁海霞a，彭麗娟bc*

(貴州大學(xué) a.農(nóng)學(xué)院， b.煙草學(xué)院， c.煙草工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

為了解遵義市霜凍植物上冰核細(xì)菌的種類以及篩選對冰核細(xì)菌有拮抗作用的細(xì)菌，采用小液滴凍結(jié)法鑒定冰核細(xì)菌的冰核活性，并用雙層平板法篩選冰核細(xì)菌的拮抗細(xì)菌；采用形態(tài)學(xué)特征、生理生化鑒定以及16S rDNA序列對比分析等方法確定冰核細(xì)菌和拮抗細(xì)菌種類。結(jié)果顯示，從遵義市采集到35種植物凍害標(biāo)本，共分離到4株冰核細(xì)菌Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH；從遵義市采集到23種土樣，共分離出3株拮抗細(xì)菌XH、XM、XL。經(jīng)鑒定，Z-A、Z-B是菠蘿泛菌(Pantoeaananatis)，Z-C是成團(tuán)泛菌(Pantoeaagglomerans)，Z-QCH是綠黃假單胞(Pseudomonasviridiflava)。拮抗細(xì)菌XH、XM是解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，XL是甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus)。初步了解了遵義市冰核細(xì)菌的種類，為遵義市霜凍植物生物防治奠定了一定基礎(chǔ)。

冰核細(xì)菌； 拮抗細(xì)菌； 鑒定； 生物防治

遵義市屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，冬季無嚴(yán)寒，常伴綿雨，時(shí)有凝凍。1月下旬常出現(xiàn)極端寒冷的天氣，氣溫僅有-7.1 ℃。最冷時(shí)段常常出現(xiàn)在隆冬1月，并常伴有凝凍發(fā)生[1]。遵義市除赤水河谷低熱地帶無凝凍災(zāi)害以外，其余各地都會發(fā)生不同程度的凝凍災(zāi)害。其中，習(xí)水、遵義縣為遵義市的重級凝凍區(qū)；中部地區(qū)的桐梓、兩城區(qū)(匯川區(qū)、紅花崗區(qū))、綏陽、湄潭、務(wù)川、鳳岡為中級凝凍區(qū)；正安、道真、仁懷、余慶為輕級凝凍區(qū)[2]。

霜凍是一種嚴(yán)重的自然災(zāi)害，它能在幾小時(shí)內(nèi)毀掉大片農(nóng)作物[3]和植物，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的影響。Maki等[4]首次從赤楊(Alnusjaponica(Thunb.) Steud.)樹葉中分離到冰核細(xì)菌(ice nucleation active bacteria，INA)，冰核細(xì)菌廣泛腐生于植物表面，可在-2～-5 ℃誘發(fā)植物細(xì)胞水結(jié)冰而發(fā)生霜凍[4]。國內(nèi)外大量研究證明，在自然界廣泛存在著冰核細(xì)菌，它是破壞植物的過冷卻狀態(tài)，誘發(fā)和加重植物霜凍危害的重要因素[5-10]。因此，防除INA細(xì)菌可以減輕和控制霜凍災(zāi)害。

本試驗(yàn)從遵義市5個(gè)不同縣、區(qū)，采集植物凍害標(biāo)本，分離鑒定冰核細(xì)菌。并從發(fā)生凍害植物的根部采集土壤，從中分離篩選冰核細(xì)菌的拮抗細(xì)菌。并鑒定冰核細(xì)菌及其拮抗細(xì)菌的種類，從而確定遵義市冰核細(xì)菌的種類及分布情況，初步研究冰核細(xì)菌的防治方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本采集

2014年12月至2015年3月，從遵義市匯川區(qū)、紅花崗區(qū)、習(xí)水縣、綏陽縣、正安縣等5個(gè)縣、區(qū)，6個(gè)地點(diǎn)采集或征集到35種植物霜凍標(biāo)本(表1)。

1.1.2 土樣采集

從遵義市匯川區(qū)植物園和鳳凰山2個(gè)景點(diǎn)采集發(fā)生霜凍的蔬菜、花卉和灌木的根部土壤，用以分離拮抗細(xì)菌。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基

冰核細(xì)菌實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：金氏(KB)培養(yǎng)基[11]。

拮抗細(xì)菌實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基[12]；芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：肉湯(LB)培養(yǎng)基[13]。

1.2 分離

1.2.1 冰核細(xì)菌的分離

表1 35種植物霜凍標(biāo)本的采集地點(diǎn)

采集市縣區(qū)地點(diǎn)寄主植物遵義市匯川區(qū)植物園百里香(Thymusmongolicus)、麻葉蕁麻(Urticacannabina)、瞿麥(Dianthussuperbus)、小葉黃楊(Buxusmicrophylla)鳳凰山假黃楊(Syzygiumbuxifolium)、灑金桃葉珊瑚(AucubajaponicaVariegata)、大黃(Rheumpalmatum)、芹菜(Apiumgraveolens)遵義市紅花崗區(qū)南宮山濕地公園空心菜(Ipomoeaaquatica)、南瓜(Cucurbitamoschata)、番茄(Lycopersiconesculentum)、花椰菜(Brassicaoleracea)、菊花(Chrysanthemummorifolium)、芭蕉(Musabasjoo)毛冬青(Ilexpubescens)、金銀花(Lonicerajaponica)習(xí)水縣丹霞谷茶樹(Camelliasinensis)枇杷(Eriobotryajaponica)、小葉女貞(Ligustrumquihoui)、蟹爪蓮(Zygocactustruncatus)、菠菜(Spi?naciaoleracea)、青菜(Brassicachinensis)、生菜(Lactucasativa)綏陽縣清溪湖景區(qū)滿天星(Gypsophilapaniculata)、鳶尾(Iristectorum)、馬蹄蓮(Zantedeschiaaethiopica)、常春藤(Hederanepalensis?var．sinen?sis)、豌豆(Pisumsativum)蠶豆(Viciafaba)杜英(Elaeocarpussylvestris)正安縣九道水森林公園虎眼萬年青(OrnithogalumcaudatumAit)、小藜(Chenopodiumserotinum)、老鸛草(GeraniumwilfordiiMaxim)、萵苣(Lactucasativa)

分離冰核細(xì)菌采用平板稀釋法[14]，按照10倍系列梯度將葉片懸浮液稀釋到4個(gè)濃度梯度：10-3、10-4、10-5、10-6。取10-5、10-62個(gè)稀釋度分離細(xì)菌，根據(jù)不同的菌落形態(tài)特征，采用分離培養(yǎng)劃線法，挑取不同的單菌落進(jìn)行劃線，分離純化。

1.2.2 拮抗菌的分離

采用平板稀釋法分離拮抗細(xì)菌[15]：將土壤懸浮液靜置，取上清液稀釋到10-3、10-4、10-5、10-64個(gè)濃度梯度，取10-5、10-62個(gè)稀釋度分離細(xì)菌。

1.3 冰核活性的測定

采用Vali[16]發(fā)明，后又由Lindow[9]改進(jìn)的小液滴凍結(jié)法，進(jìn)行冰核活性的測定。每個(gè)菌株重復(fù)3次。將篩選出來的冰核細(xì)菌接種到KB斜面上，用冰箱保存菌種。

1.4 冰核細(xì)菌拮抗菌的篩選

采用雙層平板打孔法[17]篩選冰核細(xì)菌的拮抗細(xì)菌。并經(jīng)初篩和復(fù)篩篩選出效果明顯的拮抗細(xì)菌。采用十字交叉法測量抑菌圈的直徑。

1.5 鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定與生理生化鑒定

冰核細(xì)菌和拮抗細(xì)菌的鑒定主要根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版[19]的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定和分類。

1.5.2 分子鑒定

刮取培養(yǎng)物，使用Biomiga的Bacterial gDNAkit試劑盒(GD2411-01)。按照試劑盒步驟提取DNA，采用通用引物27F和1492R、gyrA-F和gyrA-R(表2)[20]，擴(kuò)增后采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，確定條帶正確后，將目的片段純化回收，并與pMD19-T 載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐抗性平板上進(jìn)行陽性克隆的篩選，送樣測序。

將所測定的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析[21]。

采用最大簡約法(MP)分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)分析，運(yùn)用PAUP 4.0 BETA建立系統(tǒng)進(jìn)化樹[22]。拮抗細(xì)菌分子鑒定的方法跟冰核細(xì)菌的鑒定方法相同，但需加測gyrA基因序列。通過MEGA結(jié)合16S與gyrA基因，通過PAUP作MP分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

表2 用于鑒定冰核細(xì)菌和拮抗細(xì)菌的引物

細(xì)菌引物序列冰核細(xì)菌、芽孢桿菌27F5′?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3′16SrDNA1492R5′?GGTACCTTGTTACGACTT?3′芽孢桿菌gyrA?F5′?CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT?3′gyrAgyrA?R5′?CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT?3′

2 結(jié)果與分析

2.1 冰核細(xì)菌的分離

從貴州省遵義市5個(gè)縣、區(qū)采集了35種植物凍害標(biāo)本，并采用平板稀釋法分離出387株細(xì)菌，采用由Lindow改進(jìn)的Vali小液滴凍結(jié)法鑒定，鑒定出4株冰核細(xì)菌，編號為Z-A、Z-B、Z-C和Z-QCH。Z-A的寄主植物是瞿麥(D.superbus)、Z-B的寄主植物是鳶尾(I.tectorum)、Z-C的寄主植物是茶樹(C.sinensis)、Z-QCH的寄主植物是芭蕉(M.basjoo)。經(jīng)小液滴法鑒定：Z-QCH在-5 ℃溫度下30 s內(nèi)有2滴結(jié)冰，Z-A在-5 ℃下40 s內(nèi)有3滴結(jié)冰，Z-B和Z-C在-5 ℃下45 s內(nèi)有2滴結(jié)冰。經(jīng)過鑒定可知，Z-QCH的冰核活性最強(qiáng)，Z-A的冰核活性次之，Z-B和Z-C的冰核活性較弱。

2.2 冰核細(xì)菌拮抗菌的篩選

從遵義市匯川區(qū)和紅花崗區(qū)2個(gè)地點(diǎn)采集了23份根際土壤，共分離出87株細(xì)菌。經(jīng)過雙層平板打孔法，初次篩選出8株對冰核細(xì)菌有拮抗作用的菌株。根據(jù)8株拮抗細(xì)菌的抑菌圈平均直徑、增殖速度，復(fù)篩出3株強(qiáng)拮抗細(xì)菌XH、XM、XL。XH對冰核細(xì)菌Z-B的拮抗效果最好，抑菌圈平均直徑達(dá)19.731 mm；對冰核細(xì)菌Z-A的拮抗效果次之，抑菌圈平均直徑達(dá)11.671 mm；對Z-QCH的拮抗效果最弱，抑菌圈平均直徑僅有9.521 mm。XM對冰核細(xì)菌Z-QCH的拮抗效果最好，抑菌圈平均直徑達(dá)20.973 mm；對冰核細(xì)菌Z-B的拮抗效果較弱，抑菌圈平均直徑達(dá)15.093 mm；對Z-C的拮抗效果最弱，抑菌圈平均直徑為10.853 mm。XL對冰核細(xì)菌Z-A的拮抗效果最好，抑菌圈平均直徑達(dá)17.563 mm；對冰核細(xì)菌Z-C的拮抗效果次之，抑菌圈平均直徑達(dá)12.873 mm；對Z-B的拮抗效果最弱，抑菌圈平均直徑僅有11.151 mm。抑菌效果見圖1、圖2。

2.3 冰核細(xì)菌的鑒定

2.3.1 冰核細(xì)菌的形態(tài)學(xué)鑒定與生理生化鑒定

對4株冰核細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，并且做了氧化酶、接觸酶和需氧性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。由以下結(jié)果，初步判定這4株冰核細(xì)菌為假單胞屬(Pseudomonas)和泛菌屬(Pantoea)。

2.3.2 16S rDNA序列分析

對4株冰核細(xì)菌的16S rDNA片段進(jìn)行測序，在NCBI上用BLAST 程序與GenBank 中已登錄的基因序列進(jìn)行比對[18]，BLAST結(jié)果為：Z-QCH的16S rDNA序列與綠黃假單胞菌(P.viridiflava)有99%的同源性；Z-A、Z-B的16S rDNA序列與菠蘿泛菌(P.ananatis)有99%的同源性；Z-C的16S rDNA序列與成團(tuán)泛菌(P.agglomerans)有99%的同源性。

圖1 拮抗細(xì)菌XH、XM、XL對冰核細(xì)菌Z-B的抑菌效果

圖2 拮抗細(xì)菌XM對冰核細(xì)菌Z-QCH的抑菌效果

表3 4株冰核細(xì)菌的形態(tài)特征及生理生化反應(yīng)

項(xiàng)目Z?AZ?BZ?CZ?QCH菌落特征圓形、黃色、直桿狀、菌落邊緣整齊、光滑圓形、淺黃色、直桿狀、菌落邊緣整齊、光滑圓形、乳黃色、直桿狀、菌落邊緣整齊、光滑圓形、乳黃色、直桿狀、菌落邊緣整齊、光滑革蘭氏染色G-G-G-G-氧化酶----接觸酶++++需氧性實(shí)驗(yàn)兼性厭氧兼性厭氧兼性厭氧嚴(yán)格好氧

將4條序列的相關(guān)信息提交到GenBank，獲得登錄號：Z-A：KY604956、Z-B：KY604955、Z-C：KY604954、Z-QBH：KY604957。

使用PAUP(phylogenetic analysis using parsimony)進(jìn)行最大簡約分析，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3、圖4)。從系統(tǒng)發(fā)育樹中看出，Z-A、Z-B與泛菌屬的菠蘿泛菌(P.ananatis)在一個(gè)類群，Z-C與泛菌屬的成團(tuán)泛菌(P.agglomerans)在一個(gè)類群。Z-QCH與綠黃假單胞菌(P.viridiflava)在一個(gè)類群。根據(jù)冰核細(xì)菌Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH的菌株形態(tài)特征及生理生化反應(yīng)，并結(jié)合16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育分析，將Z-A、Z-B鑒定為菠蘿泛菌(P.ananatis)，Z-C是成團(tuán)泛菌(P.agglomerans)，Z-QCH是綠黃假單胞菌(P.viridiflava)。

圖3 依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建3株冰核細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建冰核細(xì)菌Z-QCH的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 冰核細(xì)菌拮抗菌的鑒定

2.4.1 拮抗細(xì)菌形態(tài)特征和生理生化反應(yīng)

在油鏡下觀察，3株拮抗細(xì)菌均呈直桿狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色菌體呈藍(lán)紫色，為革蘭氏陽性菌，芽孢染色為藍(lán)綠色，都能產(chǎn)芽孢，芽孢呈卵圓形或橢圓形。菌株XH、XM、XL的生理生化反應(yīng)見表4。

2.4.2 16S rDNA序列比對

通過16S rDNA序列BLAST比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3株細(xì)菌與芽孢桿菌16S rDNA的序列同源性都為99%。通過16S rDNA并不能把3株細(xì)菌鑒定到種的水平。通過加測gyrA基因，將所得序列BLAST比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XH、XM的gyrA基因與解淀粉芽孢桿菌的gyrA基因同源性達(dá)99%。

表4 菌株XH、XM、XL的生理生化反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目XHXLXMVP反應(yīng)+++MR--+硝酸鹽還原+++脂酸---氧化酶---淀粉水解+++接觸酶+++

通過測序，分別得到XH、XM的gyrA序列和XL、XM的16S rDNA序列。將序列的相關(guān)信息提交到GenBank，獲得gyrA序列登錄號XH(KY604960)、XM(KY604961)，16S rDNA序列登錄號XL(KY604958)、XM(KY604959)，建立系統(tǒng)化發(fā)育樹(圖5)。

圖5 依據(jù)16S rDNA與gyrA基因序列構(gòu)建3株拮抗菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

從圖5系統(tǒng)發(fā)育樹中看出，XH、XM離解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)最近，在一個(gè)類群，XL與甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)在一個(gè)類群。

根據(jù)拮抗菌XH、XM、XL的菌株形態(tài)特征及生理生化反應(yīng)，結(jié)合16S rDNA基因分析，將XH、XM鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens),XL是甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)。

3 討論

本試驗(yàn)從霜凍植物上分離到的4株冰核細(xì)菌Z-A、Z-B、Z-C、Z-QCH，分屬于3個(gè)種，其中Z-QCH是綠黃假單胞菌(P.viridiflava)，Z-A、Z-B是菠蘿泛菌(P.ananatis)，Z-C是成團(tuán)泛菌(P.agglomerans)；可歸為假單胞屬(Pseudomonas)和泛菌屬(Pantoea)2個(gè)屬，這2個(gè)屬的冰核細(xì)菌都具有很強(qiáng)的冰核活性。本試驗(yàn)從遵義市匯川區(qū)鳳凰山采集到瞿麥，從遵義市紅花崗區(qū)南宮濕地公園采集到芭蕉，從習(xí)水縣丹霞谷采集到茶樹，從綏陽縣清溪湖景區(qū)采集到鳶尾。Z-A的寄主植物是瞿麥，Z-B的寄主植物是鳶尾，Z-C的寄主植物是茶樹，Z-QCH的寄主植物是芭蕉。韋建福等[23]在1992—1994年從云南植物上分離到歐文氏菌屬(Erwinia)和假單胞菌屬(Pseudomonas)2個(gè)屬的冰核細(xì)菌。黃曉琴等[24]在山東茶樹上分離到泛菌屬(Pantoea)的冰核細(xì)菌。本試驗(yàn)在貴州省遵義市分離到假單胞屬(Pseudomonas)和泛菌屬(Pantoea)的冰核細(xì)菌，未分離到歐文氏菌屬(Erwinia)的冰核細(xì)菌。

從土壤中分離到的3株拮抗菌均為芽孢桿菌屬(Bacillus)，將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行BLAST分析，發(fā)現(xiàn)XH、XM、XL的16S rDNA序列與芽孢桿菌屬的基因同源性一致，由于16S rDNA跟生理生化反應(yīng)并不能將細(xì)菌的鑒定準(zhǔn)確到種，目前報(bào)道的gyrA能區(qū)別到種，因此，基于16S rDNA、gyrA基因，以及其生理生化指標(biāo)，對3個(gè)菌株進(jìn)行鑒定。將XH、XM鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，XL是甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(B.methylotrophicus)。解淀粉芽孢桿菌在其生長過程中可以產(chǎn)生一系列脂肽類物質(zhì)、聚酮類物質(zhì)還有具有蛋白活性的抑菌物質(zhì)，包括表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)和芬薺素(fengycin)等幾大類物質(zhì)，這些物質(zhì)對細(xì)菌、真菌、病毒和支原體有良好抑制作用[23-24]。本試驗(yàn)從土壤中分離的2株解淀粉芽孢桿菌對冰核細(xì)菌有很好的抑制作用。但是，由于微生物的生長繁殖容易受到外界溫度的影響，并且，環(huán)境中有很多不確定的干擾因素，如雨水會稀釋菌液的濃度、大風(fēng)會加速菌液的蒸發(fā)。因此，今后有必要就拮抗菌的抗菌機(jī)理以及如何在稀釋濃度的情況下保證甚至是提高其拮抗作用進(jìn)行更深入的研究。

[1] 任廣煉,侯偉.遵義市氣候條件及幾種園林樹木引種可行性初探[J].四川林勘設(shè)計(jì), 2014 (3):24-27.

[2] 李登文,姚正蘭. 遵義市冬季凝凍氣候概況及前期信號特征[J].貴州氣象, 2004, 28(S2):8-11.

[3] 孫福在.我國生物冰核研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 1996,29(5):62-67.

[4] MAKI L R, GALYAN E L, CHANG-CHIEN M M, et al. Ice nucleating induced byPseudomonassyringae[J]. Applied Microbiology, 1974,28(3):456-460.

[5] SCHNELLR C, VALI G. World-wide source of leaf-derfreezing nuclei[J].Nature,1973,246(5430):212-213.

[6] 馮玉香. 黃瓜霜凍與冰核活性細(xì)菌的關(guān)系[J].園藝學(xué)報(bào), 1990, 17(3): 211-216.

[7] 劉建華, 陶毓汾, 何維勛, 等. 冰核活性細(xì)菌與玉米和大豆霜凍關(guān)系的研究[J].中國農(nóng)業(yè)氣象, 1990, 11(1):1-6.

[8] 孫福在, 趙廷昌, 楊建明, 等. 杏樹上冰核細(xì)菌種類及其冰核活性與杏花霜凍關(guān)系的研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2000, 33(6):50-58.

[9] LINDOW S E. Erwinia herbicola: a bacteria ice nucleus active in increasing frost injury to corn[J]. Phytapathology, 1978,68(3):523-527.

[10] LINDOW S E, HIRANO S S, BARCHET W R, et al. Relationship between ice nucleation frequency of bacteria and frost injury[J]. Plant Physiology,1982,70(4):1090-1093.

[11] 方中達(dá).植病研究方法[M].第3版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 1998: 187.

[12] 張耀東,楊文超,賈翔,等.鄭州地區(qū)植物上冰核活性細(xì)菌的分離和鑒定[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué) 版),1996,17(3):34-38.

[13] SAMBROOK J, FRITSCH E F, MANIATIS T. Molecular cloning: a laboratory manual[M]. 2nded. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

[14] GOTO M, GOTO T, INABA T. Identification of ice nucleation-active bacteria isolated from frost-damaged vegetable leaves [J]. Japanese Journal of Phytopathology, 1989, 55(3): 330-335.

[15] 崔汝強(qiáng),姬廣海,張世珖.冰核活性細(xì)菌拮抗菌株的篩選[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,19(5):528-531.

[16] VALI G. Quantitative evaluation of experimental results on the heterogeneous freezing nucleation of supercooled liquid [J]. Journal of the Atmospheric Sciences, 1971,28(3):402-409.

[17] 李小俊,成麗霞,吳彥彬,等.拮抗菌抗菌譜及發(fā)酵液拮抗能力測定的新方法[J].生物技術(shù),2007,17(1):55-58.

[18] 東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌體系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社, 2001： 1-419.

[19] 布坎南, 吉本斯. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊[M]. 8版.北京：科學(xué)出版社，1984.

[20] 張圓圓, 付學(xué)池, 宋雪金, 等.蘋果輪紋病生防菌的篩選及機(jī)制初探[G]//中國植物病理學(xué)會,南京農(nóng)業(yè)大學(xué). 第五屆中國植物細(xì)菌病害、第七屆中國植物病害生物防治暨國際細(xì)菌學(xué)及植物病害生物防治學(xué)術(shù)研討會論文集.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2010:109-112.

[21] 張飛官,高雅慧,任慧爽,等.桑疫病病原拮抗菌的分離、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)報(bào),2013,53(12):1285-1294.

[22] 徐愛玲, 吳等等, 宋志文,等.引物選擇對污泥微生物多樣性分析的影響[J].環(huán)境科學(xué), 2013,34(9):3620-3626.

[23] 韋建福,孫福在,張世光,等.云南植物上冰核活性細(xì)菌鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào),1996,23(2):74-77.

[24] 黃曉琴,束懷瑞,張麗霞,等.冰核細(xì)菌在山東茶樹上的分布規(guī)律及消長動(dòng)態(tài)研究[J].茶葉科學(xué),2009,29(4):289-294.

(責(zé)任編輯：張 韻)

2017-02-22

冰核細(xì)菌的分離鑒定及其拮抗菌的篩選(貴大人基合字[2013]26號)

趙晨心(1992—)，女，山西高平人，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹参锊『Ψ乐?，E-mail:1099252966@qq.com。

彭麗娟(1973—)，女，四川合江人，研究生，教授，研究方向?yàn)橹参镎婢凹?xì)菌病害防治，E-mail:296430006@qq.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170530

Q933

A

0528-9017(2017)05-0817-06

文獻(xiàn)著錄格式：趙晨心，丁海霞，彭麗娟. 遵義市冰核細(xì)菌分離鑒定及拮抗細(xì)菌篩選[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(5)：817-822，825.