Opiorphin在肛腸手術模型大鼠針刺鎮(zhèn)痛調(diào)節(jié)效應中的作用

林玉芳韓薇陳愛文沈衛(wèi)東

1．浙江醫(yī)院杭州3100132．上海中醫(yī)藥大學3．上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院

Opiorphin在肛腸手術模型大鼠針刺鎮(zhèn)痛調(diào)節(jié)效應中的作用

林玉芳1韓薇2陳愛文2沈衛(wèi)東3

1．浙江醫(yī)院杭州3100132．上海中醫(yī)藥大學3．上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院

[目的]在肛腸手術切口痛模型大鼠中，通過觀察各組大鼠的熱痛反應時間、血清阿片類物質(zhì)（opiorphin，OPI）及腦啡肽的表達水平，探索OPI蛋白的鎮(zhèn)痛效應機制及其在穴位電針鎮(zhèn)痛效應中的調(diào)節(jié)作用。[方法]將大鼠隨機分為空白對照組、模型組、電針組、OPI組、納洛酮組、納洛酮+電針組，除空白對照組外，其余5組均建立手術切口痛模型，實施相關干預，于1h后觀察各模型大鼠的熱痛反應時間，觀察結(jié)束后將空白對照組、模型組、電針組及OPI組大鼠麻醉猝死后取血清，并用ELISA檢測大鼠血清OPI蛋白及腦啡肽的表達水平。[結(jié)果]各組大鼠的熱痛反應時間在組間比較中差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠的熱痛反應時間明顯短于空白對照組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。模型組、納洛酮組和納洛酮+電針組的熱痛反應時間明顯短于電針組和OPI組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；模型組大鼠的血清腦啡肽表達較空白對照組顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），電針組血清OPI蛋白較模型組顯著增加,差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。[結(jié)論]電針組及OPI組大鼠的熱痛反應時間明顯延長，但其鎮(zhèn)痛效應可被納洛酮所阻斷，電針干預可能通過促進血清OPI蛋白釋放，進而通過阿片受體參與及介導電針對手術切口痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應，血清腦啡肽在其中的作用有待更進一步的研究確認。

手術切口痛；電針；熱痛反應時間；opiorphin；腦啡肽；納洛酮；針灸

前期針刺麻醉的科研工作已經(jīng)證明，穴位電針具有減少麻醉藥量，鎮(zhèn)痛效果明顯等作用[1-2]。并且已有研究顯示，血清阿片類物質(zhì)（opiorphin，OPI）、腦啡肽在疼痛調(diào)節(jié)方面具有重要作用[3-4]。為了研究電針鎮(zhèn)痛麻醉在肛腸手術期間的作用機制及OPI的作用效應，先期通過建立肛腸手術切口痛大鼠模型，并觀察穴位電刺激在肛腸手術切口痛模型中的鎮(zhèn)痛效應和血清OPI、腦啡肽表達的變化情況，探索穴位電刺激可能通過調(diào)節(jié)OPI、腦啡肽水平發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應的機制，為后續(xù)臨床試驗提供理論基礎。

1 材料

1.1 主要試劑OPI ELISA試劑盒（Rapidbio，批號：XSD-20150629）；腦啡肽ELISA試劑盒（Rapidbio，批號：XSD-20150607）；水合氯醛（上海將來生物科技公司，批號：20150525-0004），其余試劑均為市售分析等級。

1.2 主要設備飛利浦紅外線輻射加熱燈（功率100W），大鼠固定架（北京創(chuàng)博環(huán)球科技公司）, “energy”牌無菌針灸針：0.38*40mm（佳健醫(yī)療衛(wèi)生材料有限公司），電針儀：華佗牌SDZ-II型電子針療儀（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

1.3 實驗動物清潔級健康成年雄性SpragueDawley(SD)大鼠30只，7周齡，體質(zhì)量280-320g，培養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心，室溫23土10℃，12小時明暗交替，適應性喂養(yǎng)1周，無不良反應，飲食、飲水正常者，即納入實驗。所有動物處死前8h禁食，自由飲水。

2 方法

2.1 實驗動物分組空白對照組：不進行任何干預措施。模型組：固定后只在肛門周圍建立手術切口模型，不進行電針干預。電針干預模型組（簡稱電針組）：固定大鼠后，予接通電針針刺內(nèi)關、神門穴，疏密波，2/100hz，強度以大鼠局部肢體微微抖動，大鼠不嘶叫或不劇烈掙扎甩尾等反應為宜，同時在肛門周圍建立手術切口模型，電針干預30min。OPI腹腔注射干預組（簡稱OPI組）：固定大鼠后，用2ml注射器在大鼠右下腹腔注射25ug/ml的OPI注射液，大鼠注射藥量為100ug/kg。同時在肛門周圍建立手術切口模型。納洛酮腹腔注射干預組（簡稱納洛酮組）：固定大鼠后，用2ml注射器在大鼠右下腹腔注射1.5ug/ml的納洛酮注射液，大鼠注射藥量為5ug/kg。同時在肛門周圍建立手術切口模型。納洛酮腹腔注射+電針干預組（簡稱納洛酮+電針組）：固定大鼠后，用2ml注射器在大鼠右下腹腔注射1.5ug/ml的納洛酮注射液，大鼠注射藥量為5ug/kg，并予接通電針干預，電針干預同電針組。同時在肛門周圍建立手術切口模型。

2.2 手術切口痛大鼠模型建立目前用于研究手術疼痛最常用的是足底切口模型，本研究結(jié)合前期臨床針刺麻醉在肛腸手術過程中的研究結(jié)果[5]，為進一步探索其臨床內(nèi)在機理，參考足底切口模型建立方法[6]，建立了大鼠肛門周圍的手術切口痛模型。方法：全程無菌操作。大鼠經(jīng)固定于特定的大鼠固定架上，呈俯臥位，露出四肢、頭、肛門、尾部等部位。碘伏消毒大鼠肛門周圍皮膚，用刀片及組織剪在大鼠肛門左右兩側(cè)對稱做八字形兩道手術切口，每個切口1.5cm長，0.5cm深，成功切開后再用帶線縫合針將手術切口進行縫合，避免大量流血及切開污染。

2.3 實驗動物熱痛閾觀察光熱測痛儀是測定大鼠熱痛閾值的常規(guī)儀器，本研究參考熱痛閾值測定的相關文獻[7]，使大鼠處于固定后安靜的狀態(tài)，采用飛利浦紅外線輻射加熱燈做為光熱測痛儀，于輻射加熱燈的燈罩下再無縫固定鏈接一錐形鐵罩以做聚光調(diào)整，于錐形鐵罩中央留一直徑1cm的圓孔以讓紅外線通過，光斑直徑為1cm，加熱燈熱源至大鼠肛周的距離為10cm，在模型建立1h后觀察大鼠手術切口局部的熱痛反應時間，或空白對照組大鼠肛周局部皮膚的熱痛反應時間，以反應大鼠熱痛閾值。

記錄每次輻射熱照射到動物手術切口或肛周局部皮膚后出現(xiàn)明顯的掙扎行為或嘶叫、甩尾反應的時間。每只測2次,每次相隔約3min，取兩次的均值作為該時段熱痛閾值。以上所有測痛操作均由同一人完成，測痛過程中防止動物興奮、抑制或激惹，并注意保持安靜的環(huán)境。

2.4 實驗動物取材觀察結(jié)束后立即予10%水合氯醛（0.5mL/100g）腹腔注射麻醉，麻醉后空白對照組、模型組、電針組、OPI組予腹主動脈采血，血液靜置后離心取上清液，放至-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）參照OPI蛋白ELISA試劑盒及腦啡肽ELISA試劑盒的說明書進行操作，以測定血清OPI蛋白和腦啡肽的濃度。根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值，在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。每個標本設置兩個復孔，重復3次試驗。

2.6 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用GraphPad prism 5進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以“均數(shù)±標準差”的形式表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，并結(jié)合Tukey's Multiple Comparison Test進行兩兩比較，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 OPI及電針干預對手術切口痛大鼠熱痛反應時間的影響One-way ANOVA方差分析結(jié)果顯示：大鼠的熱痛反應時間在組間比較中存在統(tǒng)計學差異。模型組大鼠的熱痛反應時間明顯短于空白對照組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。模型組、納洛酮組和納洛酮+電針組的熱痛反應時間明顯短于電針組和OPI組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；而模型組、納洛酮組和納洛酮+電針組的熱痛反應時間之間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；電針組和OPI組大鼠的熱痛反應時間比較亦無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖1。

3.2 電針干預對手術切口痛大鼠OPI及腦啡肽表達的影響ELISA檢測血清指標顯示，與空白對照組大鼠比較，模型組大鼠的血清腦啡肽表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而模型組大鼠的血清OPI蛋白表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。與模型組相比，電針組血清的OPI蛋白表達呈顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余組間比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見圖2。

圖1 各組大鼠熱痛反應時間示意圖(mean±SD.secs)Fig.1 Diagrammatic sketch of heat pain response time(mean±SD.secs)

4 分析與討論

圖2 各組大鼠血清OPI、腦啡肽示意圖(mean±SD.pg/mL)Fig.2 Diagrammatic sketch of serum opiorphin and enkephalin(mean±SD.pg/mL)

4.1 針刺麻醉鎮(zhèn)痛針刺麻醉已應用于臨床數(shù)十年，具有安全、簡便、生理干擾少等優(yōu)點，臨床上被廣泛運用于各類外科手術中。國內(nèi)外對針刺麻醉或鎮(zhèn)痛的機理也進行了大量研究，并進行了大量的臨床效應研究，取得了顯著的臨床療效。本研究在前期臨床肛腸手術行針刺麻醉研究的基礎上，進一步行動物實驗機理研究。

4.2 熱痛反應時間一般情況下，當各種刺激達到一定強度時才能夠使機體感到疼痛，而能夠引起機體感覺到疼痛的最小刺激量即為機體的痛感受閾。痛閾受年齡、性別、性格、心理狀態(tài)以及致痛刺激的性質(zhì)所影響。根據(jù)刺激性質(zhì)的不同，又分為機械痛閾、熱痛閾、冷痛閾等等類型，本研究所涉及的是大鼠的熱痛閾。動物實驗研究中，熱痛閾值往往以熱痛刺激儀刺激后大鼠產(chǎn)生疼痛反應的時間來表示，刺激后引起大鼠疼痛反應的時間越長則熱痛閾值越大，反之則越小。本研究中通過觀察大鼠被熱刺激后引起疼痛樣反應的時間即熱痛反應時間代表大鼠的熱痛閾值情況。

4.3 OPIOPI是由2006年法國巴斯德研究所的Catherine Rougeot小組在人唾液中分離得到一種只有5個氨基酸殘基的短肽，也是人體中發(fā)現(xiàn)的第一個能夠緩解疼痛的天然物質(zhì)，經(jīng)ESI質(zhì)譜檢測其相對分子質(zhì)量為692.5 Da[8]。OPI具有顯著的鎮(zhèn)痛效應，其主要是通過帶動人體自身的阿片系統(tǒng)對抗疼痛。腦啡肽是腦內(nèi)含量最高的阿片肽，在腦區(qū)廣泛存在。但是腦啡肽在細胞體內(nèi)形成后很容易被特殊的鋅金屬外肽酶裂解，主要的降解腦啡肽的鋅金屬肽酶包括人中性內(nèi)肽酶(hNEP)和氨基肽酶N(hAP-N)。OPI作為人體內(nèi)第一個被發(fā)現(xiàn)的天然雙重酶抑制劑，主要抑制NAP及NEP對腦啡肽的降解，加強腦啡肽對止痛作用的調(diào)節(jié)。因此OPI具有良好的鎮(zhèn)痛作用，且其鎮(zhèn)痛效果比其它非肽類雙重酶抑制劑更強。在大鼠物理疼痛和化學疼痛模型中，OPI的止痛效果是相同劑量下單獨使用腦啡肽的3-6倍[3]。側(cè)腦室注射OPI也表現(xiàn)出劑量和時間依賴的強鎮(zhèn)痛作用，其鎮(zhèn)痛作用主要是通過內(nèi)源性u-片和δ-阿片受體途徑實現(xiàn)的。側(cè)腦室注射5微克/公斤OPI產(chǎn)生與注射10微克/公斤嗎啡相當?shù)逆?zhèn)痛效果，這表明OPI具有比嗎啡更有效的鎮(zhèn)痛作用[3]。此外，與外源性阿片受體激動劑嗎啡相比，OPI在亞慢性治療后不產(chǎn)生顯著的藥物濫用依賴性或鎮(zhèn)痛藥物耐受性[9]。當OPI重復治療劑量達3mg/kg也未能產(chǎn)生阿片依賴[10]，其機理可能是OPI通過抑制根據(jù)疼痛刺激釋放的內(nèi)源性腦啡肽的破壞，限制性激活參與疼痛控制的阿片途徑，從而比嗎啡更有助于實現(xiàn)鎮(zhèn)痛和副作用之間更大的平衡。研究表明OPI天生的靈活性和柔軟性結(jié)構(gòu)是其鎮(zhèn)痛活性所必需[11]，OPI具有成為一種新型鎮(zhèn)痛藥物的潛能，但是OPI用于臨床治療還有很多的鄰域需要探索。

本實驗研究結(jié)果1顯示，模型組大鼠的熱痛反應時間明顯短于空白對照組大鼠，差異有統(tǒng)計學意義，與模型組、納洛酮組和納洛酮+電針組相比，電針組和OPI組大鼠的熱痛反應時間則呈顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義，而模型組、納洛酮組和納洛酮+電針組的熱痛反應時間之間比較無統(tǒng)計學差異，電針組和OPI組大鼠的熱痛反應時間比較亦無統(tǒng)計學差異。說明電針干預和OPI蛋白腹腔注射干預可以明顯改善模型大鼠熱痛閾值，提高熱痛反應時間，緩解大鼠的疼痛水平。但是，電針干預的鎮(zhèn)痛作用可以被阿片受體阻斷劑納洛酮所逆轉(zhuǎn)，提示阿片受體介導了電針的鎮(zhèn)痛效應。

此外，本實驗研究結(jié)果2顯示，空白對照組大鼠與模型組大鼠血清OPI蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異，提示手術切口痛大鼠體內(nèi)OPI蛋白表達無明顯升高。與模型組相比，電針組血清的OPI蛋白表達呈顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義，提示在1小時內(nèi)，電針可以提高手術切口痛模型大鼠的血清OPI蛋白表達，結(jié)合本實驗研究結(jié)果1，表明血清OPI蛋白可能參與及介導了電針干預的鎮(zhèn)痛效應。

4.4 腦啡肽內(nèi)源性阿片肽主要通過與體內(nèi)阿片類受體結(jié)合以調(diào)控疼痛信息的傳遞，從而產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[12]。其中腦啡肽家族是腦內(nèi)含量最高的內(nèi)源性阿片肽，其按結(jié)構(gòu)分為亮啡肽和甲啡肽。腦啡肽廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)的各級水平和各個部位，且腦啡肽主要作用于u受體和δ受體參與內(nèi)源性痛覺調(diào)制系統(tǒng)的構(gòu)成，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛效應。相關受體主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和調(diào)控疼痛相應的解剖部位。腦啡肽還可以調(diào)節(jié)機體的內(nèi)分泌和運動等功能，但在各種生理功能中，以腦啡肽的鎮(zhèn)痛作用最突出，研究表明，增加體內(nèi)腦啡肽的釋放可以起到良好的鎮(zhèn)痛作用[4]。不僅如此，腦啡肽還參與了針灸的鎮(zhèn)痛效應。電針可以促進下丘腦前阿黑皮素、前腦啡肽原mRNA、以及下丘腦腦啡肽的表達來緩解模型大鼠的疼痛水平[13-14]。針灸對大鼠的鎮(zhèn)痛作用還與腺垂體腦啡肽的含量呈正相關[15]，腺垂體腦啡肽可釋放入血液對針刺效應產(chǎn)生調(diào)節(jié)。針刺在促使腦與脊髓內(nèi)甲啡肽釋放的同時還能促進其與受體的結(jié)合來實現(xiàn)鎮(zhèn)痛效果[16]。此外，疼痛刺激也可以激活內(nèi)阿片肽基因表達，疼痛模型大鼠痛閾降低的同時也伴隨脊髓與下丘腦中腦啡肽的含量升高，但程度上與針刺效應有差異，針刺后腦內(nèi)腦啡肽原的含量多于痛刺激組[17]。

本實驗研究結(jié)果2顯示，與空白對照組大鼠比較，模型組大鼠的血清腦啡肽表達呈顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義，提示疼痛刺激1小時內(nèi)可以促進體內(nèi)血清腦啡肽的釋放，表明應對疼痛應激血清水平的腦啡肽釋放效應較迅速。但對于干預方法，大鼠血清腦啡肽表達組間比較無統(tǒng)計學差異，提示本實驗中電針鎮(zhèn)痛的干預效應與1小時后血清腦啡肽的含量增加不相關。本研究結(jié)果與上述針刺通過促進腦啡肽表達以產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應的結(jié)果不一致，可能與本研究所采用的電針時間、電針參數(shù)以及采血時間點存在差異有關。電針干預后可能促進了血清腦啡肽的即時釋放，但血清腦啡肽釋放后又被迅速降解，更進一步的研究應該考慮觀察針刺半小時后血清腦啡肽的即時變化情況，或針刺干預兩小時及更長時間的血清腦啡肽變化情況，或許會有統(tǒng)計學差異。

5 總結(jié)

本研究表明，電針干預和OPI蛋白腹腔注射干預可以明顯改善模型大鼠熱痛閾值，提高熱痛反應時間，緩解大鼠的疼痛水平；疼痛刺激1h內(nèi)可以促進體內(nèi)血清腦啡肽的釋放，在干預1h內(nèi)，電針則可以提高手術切口痛模型大鼠的血清OPI蛋白表達，應對疼痛應激血清水平的腦啡肽釋放效應更迅速，但電針鎮(zhèn)痛干預1h后血清腦啡肽的含量與模型組比較未見明顯增加，可能與體內(nèi)腦啡肽釋放后又被迅速降解有關，有待進一步的探索和研究。但電針干預和OPI蛋白腹腔注射的鎮(zhèn)痛作用可以被阿片受體阻斷劑納洛酮所逆轉(zhuǎn)，提示阿片受體介導了電針及OPI蛋白的鎮(zhèn)痛效應。電針干預可能通過促進血清OPI蛋白釋放，進而通過阿片受體參與及介導了電針對手術切口痛大鼠的鎮(zhèn)痛效應，而腦啡肽在其中的作用和角色有待進一步的研究確認。

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To Study the Regulating Effect of Opiorphin in Acupuncture Analgesia in A Rat Model of Anorectal Surgery

LIN Yufang1,HAN Wei2,CHEN Aiwen2,et al 1.Zhejiang Hospital,Hanzhou(310013),China.2.Shanghai University of Traditional Chinese Medicine(201203),China

[Objective]In rats model of anorectal surgical incision pain,the heat pain reaction time and the expression level of serum OPI and enkephalin were observed,to explore the mechanism of the analgesic effect of OPI proteins and its role in regulating the analgesic effect of electro-acupuncture.[Methods] The rats were randomly divided into control group,model group,electro-acupuncture(EA)group,OPI group,naloxone group,naloxone+EA group,except control group,other 5 groups were established the incision pain model,after an hour of implementation of the relevant intervention,to observe the heat pain reaction time of the rats model,after the observation,the rats of blank control group,model group,electro-acupuncture group and OPI group were anesthetized and given sudden death,the expression of rats’serum OPI protein and enkephalin were detected by ELISA.[Results]The rats’heat pain reaction time had significant differences in the comparison of groups(P＜0.05),the heat pain reaction time of rats in model group was significantly shorter than the control group,the difference was statistically significant(P＜0.001),the heat pain reaction time of rats in model group,naloxone group and naloxone+EA group was significantly shorter than the acupuncture group and the OPI group,the difference was statistically significant(P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001);the expression of serum enkephalin in rats of model group was significantly increased more than control group,the difference had statistical significance(P＜0.05), the serum OPI protein increased significantly in EA group than control group(P＜0.05),the difference was statistically significant(P＜0.05).[Conclusion]The rats’heat pain reaction times of EA group and OPI group were significantly prolonged,but the analgesic effect was blocked by naloxone.EA may promote the release of serum OPI protein which could protect the enkephalin peptides from enzymatic degradation,and then EA participated the analgesia effect on rats’incision pain through the opioid receptor mediated.The role of serum enkephalin needed further study.

surgical incision pain;electroacupuncture;thermal pain response time;opiorphin;enkephalin;naloxone;acupuncture

R245.9

A

1005-5509（2017）06-0518-05

10.16466/j.issn1005-5509.2017.06.017

2016-11-14）

沈衛(wèi)東，E-mail：shenweidong@163.com