原核表達(dá)重組牛凝乳酶的純化

普燕，李軼杰，張富春

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊，830046)

原核表達(dá)重組牛凝乳酶的純化

普燕，李軼杰，張富春*

(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊，830046)

原核表達(dá)獲得的重組牛凝乳酶與商品重組牛凝乳酶有相似的酶學(xué)特性，具商業(yè)潛力，故進(jìn)一步研究其純化方法。使用離心與飽和硫酸銨沉淀，成功純化出有活性的重組牛凝乳酶。蛋白最終回收率為1.82%，總活力比純化前提高了73.3%，比活力提高了95.3倍。同時，討論了如何提高包涵體復(fù)性率與產(chǎn)物回收率，為今后該酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

原核表達(dá)；重組凝乳酶；純化；飽和硫酸銨沉淀；回收率；比活力

重組凝乳酶是將動物凝乳酶的cDNA克隆到表達(dá)載體中，通過微生物宿主進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)后續(xù)分離純化而獲得。美國食品藥品管理局(FDA)通過全面審查發(fā)表的文獻(xiàn)資料得出結(jié)論，大腸桿菌K-12表達(dá)的重組牛凝乳酶與天然凝乳酶在組分與純度方面沒有差異，且重組凝乳酶制劑中的雜質(zhì)沒有顯示出不安全[1]。1990年，該酶成為第一個被FDA批準(zhǔn)用于食品的重組酶[2]。現(xiàn)在有3個重組牛凝乳酶符合FDA條例并認(rèn)為是安全的(GRAS)已被用于干酪生產(chǎn)，它們是EscherichiacoliK-12(大腸桿菌K-12)、kluyveromycesmarxianusvar.lactis(馬克斯克魯維酵母變種)和Aspergillusniger(黑曲霉)表達(dá)的重組牛凝乳酶[3]。用這些酶進(jìn)行Camembert、Cheddar等多種干酪品種的制備，檢測干酪出品率、質(zhì)地、氣味、風(fēng)味和干酪成熟等指標(biāo)，結(jié)果顯示這些干酪的重要特性在重組酶與天然牛凝乳酶制備的干酪中沒有顯著差異，表明重組牛凝乳酶在制備干酪的過程中，其作用方式與天然牛凝乳酶完全相同[1]。如今，估計(jì)重組牛凝乳酶占到全世界凝乳酶市場的70%～80%[4]。由此可見，因重組凝乳酶純度高(含100%凝乳酶)、產(chǎn)量高，以及非特異蛋白水解活性低、凝乳過程的可預(yù)測性、符合猶太教規(guī)、素食主義者接納、符合宗教情感和動物權(quán)益的保護(hù)等特點(diǎn)[1]，已經(jīng)成為小牛皺胃凝乳酶(rennet)的最佳替代品來應(yīng)對日益增長的干酪市場及伴隨的小牛皺胃凝乳酶短缺的問題。

重組凝乳酶在大腸桿菌[5-9]、酵母[3,10]、霉菌[11-12]宿主中均獲得成功表達(dá)。大腸桿菌能在低廉培養(yǎng)基中高密度快速增殖，且遺傳背景清楚，方便克隆表達(dá)載體和突變宿主從而被廣泛用于外源基因的表達(dá)[1]。但也發(fā)現(xiàn)，只有轉(zhuǎn)入凝乳酶原cNDA的宿主能最終獲得有活性的凝乳酶，直接轉(zhuǎn)入凝乳酶cDNA的宿主表達(dá)的蛋白沒有活性。凝乳酶原在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量隨著表達(dá)系統(tǒng)的改進(jìn)而不斷增加，酶原占總菌蛋白的比例從1%～5%[8]增加到12～19%[7]，如今已達(dá)66.3%[5]～68%[9]，通過包涵體溶解復(fù)性和酶原激活步驟，最終獲得有活性的成熟的凝乳酶。

凝乳酶原包含365個AA，分子量為40.777 kDa。自然條件下，凝乳酶原在胃的酸性環(huán)境下，發(fā)生構(gòu)象改變并自剪切形成有活性的凝乳酶，同時釋放N端42個AA(被稱為激活片段，activation segment或propeptide)，故最后成熟的凝乳酶含有323個AA，分子量為35.6 kDa[1]。體外重組牛凝乳酶原常用的活化方法是：將酶原pH調(diào)至pH 2.0，模擬胃的酸性環(huán)境，室溫放置2 h或更長時間，使酶原發(fā)生自剪切產(chǎn)生凝乳酶，再回調(diào)pH到pH 6.0左右，進(jìn)行酶活力測定、酶學(xué)特性、純化等研究。

本實(shí)驗(yàn)室原核表達(dá)的重組牛凝乳酶的酶學(xué)特性與商品化重組凝乳酶(CHY-MAX)沒有區(qū)別[5]，有商業(yè)化生產(chǎn)并運(yùn)用于干酪制作的潛能，故探討了重組凝乳酶的純化方法，計(jì)算回收率和比活力，為今后該酶在工業(yè)上的生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒

宿主細(xì)胞采用大腸桿菌(Escherichiacoli)菌株BL21 ( DE3)，表達(dá)載體pET30a-b-proCHY為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.1.2 試劑

蛋白 Marker購于北京天根試劑公司和大連寶生物工程有限公司；Bradford法蛋白定量試劑盒購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組牛凝乳酶原的表達(dá)與復(fù)性[5]

重組牛凝乳酶原由含有pET30a-b-proCHY的E.coliBL21(DE3)通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)1 L菌液，8 000 r/min離心1 min后除去培養(yǎng)基上清，菌體沉淀用20 mL PBS洗滌3次，加18 mL細(xì)胞裂解液(50 mmol/L Tris-HCl，2 mmol/L EDTA，pH 8.0)，2 mL 10% Triton X-100，加苯甲基磺酰氟(PMSF)至終濃度為1 mmol/L及添加溶菌酶至終濃度1 mg/mL，冰浴超聲約30 min，至菌液不再黏稠。12 000 r/min離心20 min，棄去上清，沉淀加20 mL細(xì)胞裂解液和2 mL 2%脫氧膽酸，冰浴30 min，期間不斷攪拌。12 000 r/min 離心15 min，棄去上清，重復(fù)洗滌3次。加20 mL 6 mol/L尿素溶解包涵體，12 000 r/min離心去除不溶雜質(zhì)，將溶液裝入透析袋中，放入約50倍體積的透析液(20 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)中透析，每12 h換1次尿素含量從高向低逐級遞減的透析液，最后用不含尿素的透析液透析3次，12 000 r/min離心20 min，上清分裝后保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 重組牛凝乳酶原的活化[5]

將透析復(fù)性獲得的重組凝乳酶原用1 mol/L HCl調(diào)至pH 2.0，室溫放置2 h，再用1.5 mol/L Tris回調(diào)至pH 6.0。此過程中酶原經(jīng)過酸化自剪切形成有活性的凝乳酶，用于后續(xù)純化及酶活力測定實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 酶原活化渾濁液的離心處理步驟及不同組分的SDS-PAGE檢測

將酶原經(jīng)酸化/中和處理后得到的渾濁酶液，用12 000 r/min離心10 min，輕緩吸出上清于干凈的離心管中，沉淀用無菌蒸餾水重懸(目的是提高凝乳酶的回收率)，將重懸溶液離心后取上清，重復(fù)2次，將3次上清合并混勻進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取適量上清和沉淀樣品，進(jìn)行SDS-PAGE檢測，分析上清與沉淀中的組分。

1.2.4 酶原活化渾濁液的自然沉淀處理方法及SDS-PAGE檢測

將酸化/中和處理后的渾濁酶液，于4 ℃靜置2 h，已經(jīng)能明顯看到分層現(xiàn)象，上層有澄清的趨勢，繼續(xù)放置至24 h，可以得到清亮的上清，輕緩地吸出上清液適量制樣(動作要輕，勿使沉淀懸起)，繼續(xù)將上清完全吸出，取適量沉淀制樣。上清樣和沉淀樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以檢測上清與沉淀中的組分。

1.2.5 飽和硫酸銨沉淀

配制飽和硫酸銨溶液，即在操作溫度下，不能再溶解硫酸銨顆粒，過濾去除不溶顆粒備用。按照1.2.3離心方法處理樣品，取上清液分裝至11個1.5 mL離心管中，每管分裝100 μL，分別加入飽和硫酸銨的體積為0、5.3、11.1、17.6、25、33.3、42.9、53.9、66.7、81.8、100 μL，加入飽和硫酸銨時邊加邊緩慢攪拌，最后吹打混勻，此時得到每管酶液中含飽和硫酸銨比例分別為0、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%。將以上離心管置于4℃ 24 h，取出于4℃、12 000 r/min離心10 min，將上清輕輕移至干凈的1.5 mL離心管中，用滅菌蒸餾水補(bǔ)體積至200 μL/管，制樣。沉淀加水200μL，混勻后制樣。上清樣和沉淀樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，以確定凝乳酶沉淀時需達(dá)到的飽和硫酸銨濃度。

1.2.6 酶活力的測定[5]

取10 mL 10%的脫脂乳(用0.01 mol/L CaCl2配制)，在35℃下保溫5 min，加入0.5 mL初步純化的凝乳酶液，迅速混合均勻，直到在管壁上觀察到凝乳顆粒，準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳液凝固的時間(s)，把40 min凝固1 mL 10%的脫脂乳定義為1個索氏單位(Soxhlet unit)。

酶活力計(jì)算：

式中：T為乳液凝固時間，s；D為酶液稀釋倍數(shù)

1.2.7 蛋白定量

按照bradford法蛋白定量試劑盒的說明書操作并計(jì)算。

1.2.8 蛋白回收率和酶活提高倍數(shù)計(jì)算

2 結(jié)果與分析

2.1 經(jīng)酸化/中和處理的重組牛凝乳酶原出現(xiàn)大量沉淀

當(dāng)對透析離心后的凝乳酶原進(jìn)行酸化/中和處理時，發(fā)現(xiàn)從pH 2.0回調(diào)到pH 6.0時出現(xiàn)大量白色沉淀，該沉淀物隨放置時間的延長，逐步集中在離心管底部，而上清無色透明，將該液進(jìn)行離心，結(jié)果得到清亮透明上清與沉淀。(見圖1)

1-透析后的重組凝乳酶原；2-用1 mol/L HCl將重組凝乳酶原液調(diào)至pH2.0；3-用1.5 mol/L Tris-HCl(pH8.8)回調(diào)酸化的酶液至pH6.0；4-酸化/中和處理后的酶液于4℃靜置2 h；5-渾濁的酶液于12 000 r/min離心10 min圖1 重組凝乳酶原經(jīng)酸化/中和后產(chǎn)生沉淀Fig.1 Recombinant prochymosin was treated by activation/neutralization

2.2 SDS-PAGE檢測離心上清與沉淀的組分

將酸化/中和處理的渾濁酶液進(jìn)行離心(12 000 r/min，10 min)，用SDS-PAGE檢測離心上清與沉淀，以及檢測自然沉淀的酶液(4 ℃靜置24 h)上清與沉淀。發(fā)現(xiàn)兩種方式得到的上清與沉淀組分相同(見圖2)。上清中包含凝乳酶和his-propeptide融合肽(見圖2中箭頭所示)，只含有極少量的雜蛋白，沉淀中包含絕大部分細(xì)菌雜蛋白以及部分凝乳酶。若將離心處理的沉淀用無菌蒸餾水重懸，再次離心(12 000 r/min，10 min)，SDS-PAGE檢測上清，發(fā)現(xiàn)通過重懸洗滌沉淀，可以從沉淀中溶解出一定量的凝乳酶，這樣我們可以通過離心或自然沉淀的方法初步純化凝乳酶，去除細(xì)菌雜蛋白，并且可通過洗滌沉淀來提高凝乳酶的回收率。

1-酶原經(jīng)酸化/中和處理，渾濁酶液離心后取出上清，沉淀用少量滅菌蒸餾水重懸洗滌，再于12 000 r/min離心10min，取上清檢測；2,3-12 000 r/min離心10 min處理渾濁酶液的沉淀與上清；4,5-渾濁酶液靜置24 h的沉淀與上清圖2 檢測酸化/中和處理后渾濁酶液的上清與沉淀組分Fig.2 Detection of the supernatant and pellet of the activation/ neutralization treated recombinant prochymosin

2.3 酶原酸化后回調(diào)至不同pH值時上清與沉淀組分檢測

重組凝乳酶原經(jīng)pH2.0酸化2 h，在回調(diào)至pH 6.0的過程中，當(dāng)pH大于3.5時出現(xiàn)白色沉淀，且沉淀量隨著pH值的增大(pH 3.5～pH 8.0)，先增后減。故將pH2.0酸化酶液回調(diào)至不同pH值，經(jīng)12 000 r/min離心10 min，將上清與沉淀分別制樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測上清與沉淀組分。如圖3所示，不同的pH值，上清與沉淀的組分不同。當(dāng)pH低于3.0時，無沉淀產(chǎn)生；當(dāng)pH調(diào)為pH 3.5時，只有較少的細(xì)菌雜蛋白沉淀，凝乳酶和多數(shù)細(xì)菌雜蛋白均存在上清中；當(dāng)調(diào)到pH4.0時，絕大多數(shù)細(xì)菌的雜蛋白沉淀而凝乳酶和his-propeptide融合肽仍留在上清中，尤其是pH4.5～pH7.0時，上清中幾乎只含凝乳酶和his-propeptide融合肽。但我們也發(fā)現(xiàn)，在pH4.0-8.0時，沉淀中始終包含一定量的凝乳酶。其次，回調(diào)到不同的pH值，獲得的凝乳酶量也不同，在pH5.0附近，上清中的凝乳酶量最低，pH4.5和pH5.5較低，其他pH值比較高。為了兼顧凝乳酶較高的回收率和最佳的酶活力，建議選擇pH6.0-6.5作為凝乳酶的初步純化條件。

2.4 飽和硫酸銨沉淀凝乳酶

酸化/中和處理后的酶溶液經(jīng)離心初步純化后，于上清液中加入飽和硫酸銨至不同終濃度，4 ℃放置24 h，12 000 r/min離心10 min，取上清和沉淀制樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)當(dāng)飽和硫酸銨終濃度大于35%時，凝乳酶沉淀而his-propeptide融合肽(約10 kDa)依然留在上清中(圖4箭頭所示)，故選擇40%～50%的飽和硫酸銨將凝乳酶與his-propeptide融合肽分離，對凝乳酶進(jìn)一步純化。

2.5 重組凝乳酶的純化步驟

綜合上述結(jié)果，我們?nèi)∫欢康哪槊冈M(jìn)行酸化/中和處理，12 000 r/min離心10 min，上清吸出保留，沉淀用無菌蒸餾水洗滌并離心，重復(fù)2次，合并所有上清，再以飽和硫酸銨終濃度為40%和50%進(jìn)行沉淀，將各個階段的樣品制樣后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖5。我們可以看到，酶原經(jīng)酸化/中和處理初期含有很多雜蛋白，而離心后，上清中只包含凝乳酶與his-propeptide融合肽，再經(jīng)硫酸銨沉淀，凝乳酶能在40%和50%的飽和硫酸銨終濃度下完全沉淀，而his-propeptide融合肽存在于上清中，最終達(dá)到了純化凝乳酶的目的。

圖3 活化酶液回調(diào)至不同pH值經(jīng)離心處理上清與沉淀組分檢測Fig.3 Detection of the supernatant and pellet of the activation/neutralization treated recombinant prochymosin in different pH value

圖4 不同飽和硫酸銨終濃度沉淀凝乳酶Fig.4 The different final concentration of saturated ammonium sulfate were used to precipitate chymosin

1-酸化/中和處理的酶原；2-活化酶液離心后上清；3,4-經(jīng)50%和40%飽和硫酸銨沉淀后離心沉淀物；5,6-經(jīng)50%和40%飽和硫酸銨沉淀后離心上清圖5 重組凝乳酶的純化步驟Fig.5 The purification of the recombinant prochymosin

2.6 重組凝乳酶在純化過程中的蛋白回收率與比活力變化情況

用bradford方法測定每一步純化步驟中蛋白濃度及酶活，結(jié)合體積計(jì)算出各個時期蛋白回收率，并根據(jù)蛋白含量和總酶活計(jì)算出凝乳酶的比活力。如表1所示，酶原活化后回調(diào)到pH 6.0時的離心上清和硫酸銨沉淀凝乳酶兩步相對于原始蛋白含量，蛋白回收率分別為4.93%和1.82%，但總活力卻隨純化進(jìn)行而增加，最后比活力較原始活化酶液提高了27.65和95.33倍。

表1 重組凝乳酶純化過程中蛋白回收率和比活力變化情況

注：a-酶原經(jīng)酸化/中和處理得到的渾濁酶液；b-因?yàn)闇啙崦敢簷z測蛋白含量不準(zhǔn)，故用酶原的測定值來代替；c-將活化酶液離心后，取上清，沉淀經(jīng)2次洗滌離心，合并3次上清的溶液。

3 討論

凝乳酶是酶凝干酪制作的關(guān)鍵性酶，隨著干酪市場的迅速增長，凝乳酶的用量也不斷增加，重組凝乳酶是目前小牛皺胃酶替代品中表現(xiàn)最突出的，因其純度高，制備干酪的感官指標(biāo)優(yōu)于小牛皺胃酶制作的干酪，許多國家都已經(jīng)自主生產(chǎn)并應(yīng)用到干酪的制作當(dāng)中[13-14]。我國目前也非常重視凝乳酶的研發(fā)，被列為國家863計(jì)劃優(yōu)先發(fā)展的項(xiàng)目和國家“七五”、“八五”、“九五”重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目[14]。

重組凝乳原是最早在大腸桿菌中合成、純化、鑒定的有活性真核生物蛋白酶之一[8]。從大腸桿菌表達(dá)的凝乳酶原占總菌蛋白的5%到我們實(shí)驗(yàn)中檢測的重組凝乳酶原表達(dá)量占總菌蛋白的66.3%[5]，這些進(jìn)步包含了宿主、表達(dá)載體等方面的改進(jìn)。當(dāng)表達(dá)量達(dá)到一定程度時，包涵體的復(fù)性率和產(chǎn)物的回收率研究就顯得迫切了。本研究對原核表達(dá)的重組凝乳酶進(jìn)行純化，最終產(chǎn)物的回收率為1.82%，對于酶原激活時產(chǎn)生大量沉淀和隨著酶的逐步純化，酶總活力逐步提高的現(xiàn)象，我們進(jìn)行了以下討論。

3.1 分析重組凝乳酶原活化過程中產(chǎn)生的沉淀原因

包涵體復(fù)性的重組凝乳酶原，在酸化/中和處理前，用高速離心去除雜質(zhì)，上清透明清亮，用HCl調(diào)pH到pH 2.0，溶液一直保持無色透明，但在回調(diào)pH到pH 6.0的過程中，出現(xiàn)白色沉淀物(見圖1)，而且隨著pH值的增大，沉淀物的表現(xiàn)也不同，先是沉淀量由少到多，然后是溶液的黏稠度增加，沉淀白色而均勻，最后出現(xiàn)碎絮狀沉淀，黏稠度稍有降低，放置一段時間，觀察到上清與沉淀的分離。將回調(diào)至不同pH值的活化酶液離心，并對上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳(見圖3)，當(dāng)pH回調(diào)到pH 5.0附近時，上清中凝乳酶的含量最低，這也許是因?yàn)榇藭r的pH接近重組牛凝乳酶的pI，據(jù)報(bào)道說牛凝乳酶的pI值為4.6～5.1[1]，故重組凝乳酶在pH5.0附近沉淀，在表觀上觀察到溶液黏稠度增加。當(dāng)pH增加到6.0以上，凝乳酶溶解度增加，上清中凝乳酶含量也增加。與此同時，我們也觀察到沉淀中也有相當(dāng)含量的凝乳酶，這些凝乳酶可以通過洗滌沉淀的過程回收一部分，原因可能是蛋白總濃度太高，導(dǎo)致一部分凝乳酶隨其他雜蛋白一起沉淀下來，可以通過降低活化酶原的濃度來解決。

酶原以包涵體形式在原核細(xì)胞中表達(dá)，難免包涵體復(fù)性透析過程中摻雜一定量的細(xì)菌蛋白。一般情況下，絕大多數(shù)蛋白不能耐受強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境，這些細(xì)菌蛋白也許因pH2.0的酸化處理而被降解，但此時溶液中存在較多的H+，這些蛋白的表面電荷因帶有正電荷而相互排斥，使其保持可溶狀態(tài)。當(dāng)回調(diào)pH到一定范圍時，這些蛋白表面電荷發(fā)生變化，從而聚集沉淀。凝乳酶屬于天冬氨酸蛋白酶，在酸性條件下穩(wěn)定，不同種屬來源的凝乳酶最適酶活力的pH也均處在酸性環(huán)境中，一般在pH5.5～6.5[1]，故當(dāng)雜蛋白都因酸化降解后，凝乳酶依然保持可溶狀態(tài)并存留于上清中。

我們觀察酶原和活化酶液SDS-PAGE電泳圖發(fā)現(xiàn)[5]，若酶原全部自剪切生成凝乳酶，按照分子量大小比例計(jì)算，理論上蛋白條帶的灰度約為4∶3，但實(shí)際觀察到酶的條帶灰度不及酶原的一半，也就是說部分酶原在激活過程中出現(xiàn)降解。張俊瑞[9]、ESKANDARI[15]等也曾觀察到酶原活化產(chǎn)生大量沉淀的現(xiàn)象。猜測可能是酶原復(fù)性過程中，僅部分凝乳酶原能正確折疊，這些酶原在活化過程中進(jìn)行自剪切形成凝乳酶，而錯誤折疊的酶原不能在酸化時進(jìn)行自剪切，被酸降解析出。

包涵體的復(fù)性率一直是原核表達(dá)蛋白的研究重點(diǎn)。若不能正確折疊形成三級結(jié)構(gòu)，那么表達(dá)量再高也沒有應(yīng)用價(jià)值。目前已經(jīng)證明凝乳酶原包涵體的復(fù)性包括兩個階段，1是要在pH11的緩沖液中完全伸展變性，2是中和到pH8進(jìn)行復(fù)性，而且高pH步驟對酶原復(fù)性是必不可少的[16]。WEI等[16]人通過在復(fù)性液中添加GroE和10倍的二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)實(shí)現(xiàn)在pH8一步法完成復(fù)性，其認(rèn)為GroE和PDI可以有助于凝乳酶原獲得天然構(gòu)象。中國科學(xué)院微生物所的楊開宇等人[17]，在其發(fā)明專利中采用優(yōu)化的溶解包涵體及再折疊的工藝，可使復(fù)性率達(dá)到50%左右。唐兵[18]對蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)與GSH/GSSG 促進(jìn)重組凝乳酶原復(fù)性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)二硫鍵的錯誤配對是影響凝乳酶原多肽鏈正確折疊的主要原因。牛凝乳酶中存在3對二硫鍵[19-20]，本實(shí)驗(yàn)所采用的酶原復(fù)性方法中并沒有加入任何能促進(jìn)二硫鍵形成的酶或試劑(主要考慮今后工業(yè)化生產(chǎn)的成本)，故可能也存在二硫鍵的錯配。

3.2 凝乳酶的總活力隨著凝乳酶的純化而增高

表1給我們顯示了從酶原活化到凝乳酶最終純化各步驟中蛋白含量、蛋白濃度、酶活力、總活力和比活力的數(shù)據(jù)。我們看到凝乳酶總的酶活力和比活力都是增高的。首先，通過離心步驟，總的酶活力上升到了1 889 SU，再經(jīng)飽和硫酸銨沉淀，總酶活力上升到2 400 SU，比一開始的1 385 SU增高了73.3%。一般酶在純化過程中，因?yàn)榇嬖诘鞍椎膿p失和酶的失活，會表現(xiàn)出酶的總活力下降的趨勢，但我們純化過程中卻發(fā)現(xiàn)凝乳酶的總活力隨著純化的進(jìn)行而增高，分析可能有以下3種原因。

(1)propeptide的存在干擾了酶的催化作用。凝乳酶在體內(nèi)是以酶原形式分泌，在胃酸環(huán)境中，通過自剪切去除N端42個AA(propeptide)而產(chǎn)生有活性的凝乳酶。將凝乳酶原前體、凝乳酶原和凝乳酶的cDNA克隆到不同的表達(dá)載體上，通過不同宿主菌進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)克隆凝乳酶原cDNA能夠成功表達(dá)出具有自剪切功能的凝乳酶原，通過酸化/中和處理得到有活性的凝乳酶，而克隆凝乳酶原前體和凝乳酶cDNA往往得不到有活性的凝乳酶，如VALLEJO等[23]克隆了水牛前凝乳酶原、凝乳酶原和凝乳酶序列，只有凝乳酶原克隆表達(dá)出了有活性的凝乳酶，這也說明凝乳酶原中的propeptide對凝乳酶的正確折疊有重要作用。YONEZAWA等[21]也證明酶原的N端對整個酶原分子的折疊過程中起決定作用。故目前進(jìn)行的重組凝乳酶克隆與表達(dá)均選用凝乳酶原的cDNA。關(guān)于天冬氨酸蛋白酶原的活化過程認(rèn)為是：propeptide與酶的活性位點(diǎn)以靜電作用結(jié)合，propeptide的存在阻止了底物進(jìn)入酶活性中心，故酶原在pH中性環(huán)境中不具有催化作用；當(dāng)pH降低，propeptide與酶活性中心的靜電作用被破壞，此時propeptide的構(gòu)象發(fā)生改變，酶原的自剪切位點(diǎn)暴露并與酶活性中心結(jié)合，酶對該位點(diǎn)進(jìn)行切割，propeptide從酶活性中心解離，酶的N端發(fā)生構(gòu)象改變，形成一個反式β折疊位于底物與酶結(jié)合的裂隙處[24]。同時，CHRISTENSEN等[25]還發(fā)現(xiàn)酶原的活化既可以是分子內(nèi)的，也可以是分子間的。根據(jù)此機(jī)制，酶原的活化在體外是通過酸化處理模擬的，通常將pH調(diào)到pH 2.0，室溫活化2 h，再將pH回調(diào)到pH 6.0用于后續(xù)的純化與凝乳活力檢測。既然在酶原中，propeptide與酶的活性中心以靜電作用方式結(jié)合，那么在酶原活化后，如果propeptide和有活性的成熟酶共存于高濃度的溶液中，可能propeptide或多或少會干擾酶與底物的結(jié)合，從而降低了酶活力。但Uren等人[26]也同樣通過離心和60%飽和硫酸銨沉淀酸化/中和處理后的重組凝乳酶原溶液，其計(jì)算的總酶活力是隨著純化步驟的進(jìn)行逐漸降低的，故是否因?yàn)閜ropeptide的存在干擾酶的催化而降低了活力測定值，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

(2)His標(biāo)簽的存在影響了酶活。一般認(rèn)為凝乳酶C端區(qū)域的負(fù)電荷叢與κ-酪蛋白His98-His102正電荷叢之間的靜電吸引，對酶與底物的特異結(jié)合有重大作用[27]。his標(biāo)簽包含6個串聯(lián)的his，帶正電荷，類似于κ-酪蛋白的His98-His102正電荷叢，可能成為κ-酪蛋白競爭性抑制物從而影響酶活。

(3)純化去除了溶液中的凝乳酶抑制劑。原核表達(dá)系統(tǒng)中是否存在某種物質(zhì)能夠抑制凝乳酶的活性，當(dāng)其隨純化進(jìn)行而被去除后，則酶活力提高。NOSEDA等[28]用畢赤酵母GS115表達(dá)密碼子優(yōu)化的牛凝乳酶原，發(fā)現(xiàn)凝乳酶原自動剪切，產(chǎn)生有活性的凝乳酶上清。將培養(yǎng)基上清先用0.22 μm的濾器過濾，酶活力和總活力以及體積均沒有改變，蛋白濃度降低；再進(jìn)行3 kDa快速超濾，總活力提高到114%，接下來用高效凝膠過濾，總活力回收率為42%，最后再用3 kDa快速超濾，總活力回收率又提高到56%。作者認(rèn)為純化過程中出現(xiàn)酶活力提高的情況，推測可能是去除了凝乳酶的假定的抑制劑或蛋白酶之故。

以上3種假設(shè)都能解釋表1中的離心上清液的酶活力為2 553 SU/mL，而經(jīng)飽和硫酸銨沉淀后，體積相同的情況下，酶液的酶活力為3 243 SU/mL，提高了27%，但具體原因都還需后續(xù)研究驗(yàn)證。

本研究對原核表達(dá)獲得的重組凝乳酶進(jìn)行了純化，使用簡單的離心和飽和硫酸銨沉淀的方法獲得高純度、高比活力的凝乳酶。該純化方法成本低，易操作，對于重組凝乳酶的工業(yè)化生產(chǎn)非常有利，然而蛋白的回收率還有提高的空間，如何提高酶原的復(fù)性率將是我們下一步研究工作的方向。

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The purification of the recombinant bovine chymosin expressed in prokaryotic system

PU Yan, LI Yi-jie, ZHANG Fu-chun*

(Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering， College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

The recombinant bovine chymosin expressed in prokaryotic expression system has the similar enzymatic properties to the commercial recombinant bovine chymosin, so it has the potential to be commercialized. Therefore the purification of the enzyme was studied. The recombinant bovine chymosin was purified successfully by centrifugation and saturated ammonium sulfate precipitation. The ultimate recovery is 1.82%. The total activity increased by 73.3% and the specific activity increased 95.3-fold. How to improve the renaturation of inclusion body and recovery also were discussed, which provided technical reference for industrial production of the enzyme in the future.

prokaryotic expression; recombinant chymosin; purification;saturated ammonium sulfate precipitation; recovery; specific activity

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201704010

博士，講師(張富春教授為通訊作者，E-mail：zfcxju@gmail.com)。

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金青年基金(2013211B10)

2016-10-16，改回日期：2016-11-27