氮磷鎂離子濃度和培養(yǎng)溫度對三種蘭花試管開花的影響

張新平,丁群英,李 皓,張芳芳,朱根發(fā)

(1.陜西職業(yè)技術學院 旅游系, 西安 710100;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 環(huán)境園藝研究所, 廣州 510640;3.西安文理學院, 西安 710065;4 西安理工大學藝術與設計學院,西安 710054;5. 陜西省農(nóng)業(yè)廣播電視學校高陵分校，陜西 高陵 710200)

氮磷鎂離子濃度和培養(yǎng)溫度對三種蘭花試管開花的影響

張新平1,2,丁群英3,李 皓4,張芳芳5*,朱根發(fā)2

(1.陜西職業(yè)技術學院 旅游系, 西安 710100;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院 環(huán)境園藝研究所, 廣州 510640;3.西安文理學院, 西安 710065;4 西安理工大學藝術與設計學院,西安 710054;5. 陜西省農(nóng)業(yè)廣播電視學校高陵分校，陜西 高陵 710200)

以建蘭雜交種(建蘭'小桃紅'×紋瓣蘭，XTW)、密花石斛無菌播種苗和春石斛(Dendrobiumspot)側芽組培苗為研究材料，探討了氮磷鎂離子濃度比例和培養(yǎng)溫度對3種蘭試管開花的影響，得出在蔗糖40 g·L-1+卡拉膠6 g·L-1+4.0 mg·L-16-BA的基礎上，附加低氮高磷和變溫，有助于密花石斛的試管花形成，密花石斛在變溫[(18±1)℃/(25±1)℃]下，MS1(1/3 N，9 P)處理中有2株誘導出1個花芽(6.6%)，開放畸形的白花；MS4(1/6 N，15 P)處理中有1植株誘導出2個花芽(3.3%)，開放正常的黃花。但對XTW無菌播種苗和D.spotRight側芽組培苗的離體花芽沒有誘導效果。培養(yǎng)溫度、H2PO4+、Mg2+、NO3-和NH4+濃度比例對密花石斛離體花芽誘導顯著，對XTW和春石斛離體花芽誘導不顯著。

蘭花；離體開花；花芽；營養(yǎng)芽;誘導頻率

開花是植物生活史上重要的生理生化過程,試管開花(又稱離體成花，in vitro flowering)是植物細胞工程研究的熱點之一。迄今,已報道的試管開花植物共約有35科、100多種，包括園藝作物、園林植物、藥用植物和田間雜草等,其中以花卉居多[1-17]。國內(nèi)外關于試管開花的研究目的主要基于以下三個方面[17]：①為研究花的誘導和發(fā)育提供一個模式系統(tǒng)；②為實施微育種提供一種手段，解決育種和商業(yè)生產(chǎn)中的開花延遲問題；③研究離體開花過程中的生理生化變化，便于在制藥產(chǎn)業(yè)上得到一些重要的藥用的化合物，為生化藥劑和醫(yī)藥品提供原始材料。蘭花是蘭科(Orchidaceae)植物的總稱，按產(chǎn)地分為國蘭(原產(chǎn)于中國)和洋蘭(原產(chǎn)于中國以外的區(qū)域)，蘭花具有較高的觀賞價值和藥用價值。國蘭植物組織內(nèi)含有大量的酚類物質(zhì)，在植物組織培養(yǎng)過程創(chuàng)傷部位的酚類由于褐化嚴重，其組培再生體系難以建立。目前，國蘭的繁殖和育種依舊采用傳統(tǒng)的無菌播種方式。通常國蘭無菌播種苗開花需要3～5 a營養(yǎng)積累，才能正常開花，嚴重影響了觀賞型蘭花的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。蘭花的離體成花誘導逐漸成為一個研究熱點。穩(wěn)定的蘭花離體開花系統(tǒng)具有多方優(yōu)勢:①花朵的基本品種特征被保留下來；②離體開放的花，一般具有正常的授粉能力和結實能力；③離體開花為離體雜交育種工作提供了一個思路和穩(wěn)定的花粉源[15,16]并極大地縮短了育種周期。截至目前，蘭科植物試管開花方面的研究，在植物材料方面主要集中在石斛蘭屬(Dendrobium)[1,4-13.17]，另外也有蘭屬(Cymbidium)中的建蘭(C.ensifolium)[1,4]、寒蘭(C.kanran)[11]和墨蘭(C.sinense)及蝴蝶蘭(Phalaenopsis)與文心蘭屬(Oncidium)中的極少數(shù)品種試管開花方面的研究[1]。誘導試管開花的植物材料有3種不同的類型[17]：①外植體，如，莖尖、側芽、小花序、花莖及其切段等；②組培過程中的中間繁殖體，如，根狀莖、擬原球莖、原球莖等；③完整的無菌小植株，如，實生苗、組培苗。蘭花試管開花的主要誘導條件主要體現(xiàn)在以下三個方面[17]：①礦質(zhì)營養(yǎng)，如，不同的培養(yǎng)基類型、改變基本培養(yǎng)基中氮磷鉀的量、附加一定的添加物質(zhì)等；②植物激素，如，6-BA、TDZ、KT和多胺等；③添加生長延緩劑，如，PP333、ABA。已有的研究都未關注MS培養(yǎng)基中氮、磷、鎂三種無機離子濃度、培養(yǎng)溫度對蘭花無菌苗離體成花誘導的影響，因此我們以三種蘭花(密花石斛、建蘭雜交種和日本春石斛)為試驗材料，開展了不同氮、磷、鎂比例及培養(yǎng)溫度組合的對比試驗，以期探討出這3個蘭花品種的離體成花的誘導方案，并為蘭花離體成花提供理論和實踐啟示。

2 方法與材料

2.1 材料

本試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境園藝研究所實驗室完成，試驗材料采自該研究所種質(zhì)資源圃，建蘭'小桃紅'×紋瓣蘭(簡記為XTW，國蘭雜交種)無菌播種實生苗，密花石斛(D.densiflorum，產(chǎn)于廣西)無菌播種實生苗，春石斛蘭(D.spot，引自日本)側芽芽尖再生植株。其中，無菌播種培養(yǎng)基為：1/2 MS+NAA 0.3 mg·L-1；側芽誘導培養(yǎng)基：1/2 MS+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 4.0 mg·L-1；兩個培養(yǎng)基的附加物質(zhì)均為：卡拉膠7.0 g·L-1+蔗糖20 g·L-1+椰子乳100 ml·L-1+細菌學蛋白胨2.0 g·L-1，培養(yǎng)溫度為(26±1) ℃，培養(yǎng)環(huán)境空氣相對濕度為60%～80%。

2.2 方法

培養(yǎng)基中的共有組成物質(zhì)：6-BA 5.0 mg·L-1+蔗糖40 g·L-1+卡拉膠6 g·L-1。誘導的植物材料：建蘭'小桃紅'×紋瓣蘭(無菌播種苗，2個葉片的苗齡)、密花石斛(無菌播種苗，2～3個葉片的苗齡)和春石斛蘭側芽芽尖再生植株。培養(yǎng)條件：①恒溫：(25±1)℃；②變溫：8:00-20:00，(25±1)℃；20:00-次日8:00，(18±1)℃，光照：1 200～1 500 lx, 12 h·d-1,培養(yǎng)試驗在人工氣候培養(yǎng)箱中開展，在配制培養(yǎng)基時對 MS 基本培養(yǎng)基中的氮、磷和鎂的離子質(zhì)量濃度比例進行了調(diào)整，除MS和MS5外，其余的氮均為NO3--N，配置培養(yǎng)基的各類化合物均為分析純試劑，試驗設計見表1。

2.3 統(tǒng)計指標與分析

花芽誘導頻率(%)=分化花芽的植株數(shù)/所有植株數(shù)×100

營養(yǎng)芽誘導頻率(%)=分化營養(yǎng)芽的植株數(shù)/所有植株數(shù)×100

以長度大于0.5 cm的芽進行統(tǒng)計；花芽發(fā)育培養(yǎng)基為花芽誘導形成后轉接的不含激素的1/2 MS培養(yǎng)基。120 d 后對各處理的植株生長情況和花芽誘導情況進行統(tǒng)計[17]。

表1 不同氮、磷和鎂的比例培養(yǎng)基的配方設計 [17]

3 結果與分析

3.1 氮、磷、鎂離子濃度比例及溫度對建蘭雜交種(XTW)離體花芽與營養(yǎng)芽誘導的影響

3.1.1 氮、磷、鎂離子濃度比例及溫度對XTW離體花芽誘導的影響 在添加4.0 mg·L-16-BA的基礎上，僅調(diào)整MS培養(yǎng)基中氮、磷、鎂的比例或改變培養(yǎng)溫度對建蘭雜交種(XTW)無菌播種苗離體花芽沒有誘導效果。表2表明，各處理均沒有誘導XTW產(chǎn)生花芽，這表明影響XTW無菌播種苗離體花芽分化的主要因素可能不是外部供給的營養(yǎng)和溫度條件，XTW離體花芽分化可能與植物材料的成熟狀態(tài)等決定植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉變的因素有關[17]。單因素方差分析表明，培養(yǎng)溫度，H2PO4+、Mg2+、NO3-和NH4+濃度比例對XTW離體花芽誘導影響均不顯著(p>0.05)，說明本研究所設定離體花芽誘導條件對XTW是無效的，后續(xù)研究需要從其他因素水平探討其試管花誘導條件。

3.1.2 氮、磷、鎂離子濃度比例及溫度對XTW離體營養(yǎng)芽誘導的影響 表2表明，改變MS培養(yǎng)基中含氮、磷和鎂元素離子化合物濃度比例，對XTW無菌播種苗營養(yǎng)芽的誘導影響顯著(p<0.05)。在恒溫或變溫條件下，氮含量不變，增加磷含量可明顯提高XTW無菌播種苗的營養(yǎng)芽誘導頻率，如MS2與 MS3相比，在恒溫培養(yǎng)下，營養(yǎng)芽誘導頻率高于MS326.6%，在變溫培養(yǎng)下高于MS327.8%，但兩個處理的苗子生長狀況均不良。若氮含量降低，磷含量不變，也可明顯提高XTW無菌播種苗的營養(yǎng)芽誘導頻率，如MS4與MS2相比，當?shù)坑?/6 N降到1/12 N時，磷同為15P，無論在恒溫或變溫條件下，均是低氮的MS2營養(yǎng)芽誘導頻率高于MS4，但苗子的質(zhì)量MS4優(yōu)于MS2[17]。從六種不同的培養(yǎng)基處理XTW的營養(yǎng)芽誘導頻率上，MS5與MS6兩個處理效果要明顯優(yōu)于其他培養(yǎng)基配方，這可能是因為MS5中氮、磷量比例和銨態(tài)氮(NH4+-N)與硝態(tài)氮(NO3-N)比值的變化綜合作用的結果，MS5降低了磷，同時增加了鎂的緣故。從試驗中發(fā)現(xiàn)，大幅度地改變MS中氮和磷的含量，特別是增加磷的比例，如MS2、MS3，會影響培養(yǎng)材料的正常生長[17]。培養(yǎng)溫度對XTW離體營養(yǎng)芽誘導影響不顯著(p>0.05)，說明降低NO3-濃度同時增加H2PO4+濃度有助于提高XTW無菌播種實生苗營養(yǎng)芽的誘導頻率。

3.2 氮、磷、鎂離子濃度比例及溫度對密花石斛離體花芽和營養(yǎng)芽誘導的影響

3.2.1 氮、磷、鎂離子濃度比例及溫度對密花石斛離體花芽誘導的影響 表3表明，在添加4.0 mg·L-16-BA的基礎上，僅調(diào)整MS培養(yǎng)基中氮、磷和鎂的比例對密花石斛無菌播種苗離體花芽沒有誘導效果，但再結合適當?shù)淖儨?25±1)℃/(18±1)℃，白天/夜間)就會對密花石斛無菌播種苗離體花芽的誘導產(chǎn)生一定的效果。如，在變溫條件下，密花石斛在MS1(1/3N，9P)中，有2植株各從頂部誘導出1個花芽，發(fā)育為畸形的白花(圖1)；在MS4(1/6N，15P)中，降低N的含量、增加磷的含量和改變培養(yǎng)溫度，都不同程度上抑制了密花石斛的營養(yǎng)生長，促進了生殖生長，導致了個別植株的離體開花[17]。單因素方差分析表明，培養(yǎng)溫度、H2PO4+對密花石斛離體花芽誘導影響極顯著(p<0.01)； NO3-和NH4+濃度比例對密花石斛離體花芽誘導影響顯著(p<0.05)；Mg2+對密花石斛離體花芽誘導影響不顯著(p>0.05)。有1植株從頂部誘導出2個花芽，發(fā)育為正常的黃花(圖2)。調(diào)整MS培養(yǎng)基中氮、磷、鎂的比例或改變培養(yǎng)溫度，對密花石斛離體花芽的誘導均沒有效果，只有兩者結合在一起才能對密花石斛離體花芽的誘導產(chǎn)生作用。結合營養(yǎng)芽誘導和植株生長情況分析，降低氮和改變晝夜培養(yǎng)溫度有助于密花石斛試管花的誘導。

表2 氮、磷和鎂離子濃度及溫度對XTW試管花誘導的影響[17]

表3 氮、磷和鎂離子濃度及溫度對密花石斛試管花誘導的影響

圖1 密花石斛在MS1中、變溫培養(yǎng)100 d開花 圖2 密花石斛在MS4中、變溫培養(yǎng)100 d開花

3.2.2 氮、磷、鎂離子濃度比例及溫度對密花石斛離體營養(yǎng)芽誘導的影響 結合表3與單因素方差分析顯示，培養(yǎng)溫度對密花石斛離體營養(yǎng)芽誘導影響顯著(p<0.01)，H2PO4+、Mg2+、NO3-和NH4+濃度比例對密花石斛離體營養(yǎng)芽誘導影響不顯著(p>0.05)，表明恒溫培養(yǎng)有助于密花石斛營養(yǎng)芽的誘導。

3.3 氮、磷、鎂離子濃度比例及溫度對春石斛蘭離體花芽和營養(yǎng)芽誘導的影響

3.3.1 氮、磷、鎂離子濃度比例及溫度對春石斛離體花芽誘導的影響 表4表明，在添加4.0 mg·L-16-BA的基礎上，調(diào)整MS培養(yǎng)基中氮、磷和鎂的比例對春石斛蘭側芽芽尖組培苗離體花芽沒有誘導效果，結合適當?shù)淖儨貤l件(25±1)℃/(18±1)℃，白天/夜間)對春石斛蘭側芽芽尖組培苗離體花芽的誘導也無任何效果。單因素方差分析顯示，培養(yǎng)溫度，H2PO4+、Mg2+、NO3-和NH4+濃度比例對春石斛離體花芽誘導影響均不顯著(p>0.05)，表明本研究所設定離體花芽誘導條件對春石斛是無效的，后續(xù)研究需要從其他因素水平探討其試管花誘導條件。

3.3.2 氮、磷、鎂離子濃度比例及溫度對春石斛離體營養(yǎng)芽誘導的影響 從表4看出，調(diào)整MS培養(yǎng)基中氮、磷和鎂的比例或改變培養(yǎng)溫度或兩者的結合，對春石斛離體花芽的誘導均無效果。結合營養(yǎng)芽誘導和植株生長情況分析，降低氮的含量、增加磷的含量和變換培養(yǎng)溫度，均抑制了春石斛蘭組培苗的營養(yǎng)生長[17]。單因素方差分析表明，培養(yǎng)溫度對春石斛離體花芽誘導影響不顯著(p>0.05)，H2PO4+、Mg2+、NO3-和NH4+濃度比例對春石斛離體營養(yǎng)芽誘導影響顯著(p<0.05)。

表4 氮、磷和鎂離子濃度及溫度對春石斛蘭試管花誘導的影響

4 結論與討論

在本研究設定的因素水平下，在蔗糖40 g·L-1+卡拉膠6 g·L-1+ 6-BA 4.0 mg·L-1的基礎上，調(diào)整MS培養(yǎng)基中氮和磷的比例和改變培養(yǎng)溫度，或者兩者的結合均對建蘭雜交種(XTW)無菌播種苗和春石斛蘭側芽組培苗的離體花芽無誘導效果；對密花石斛無菌播種苗的離體花芽誘導效果為，在變溫條件下、在MS1(1/3 N，9P)中有2株誘導出1個花芽(6.6%)，發(fā)育為畸形的白花；在MS4(1/6N，15P)中，有1植株誘導出2個花芽(3.3%)，發(fā)育為正常的黃花，無菌播種苗不同株系間花色上出現(xiàn)的性狀分離現(xiàn)象說明播種的實生苗容易發(fā)生變異。結果分析表明，對密花石斛離體花芽誘導培養(yǎng)溫度和H2PO4+濃度影響極顯著，Mg2+濃度影響不顯著，NO3-與NH4+濃度對密花石斛離體花芽誘導影響顯著；培養(yǎng)溫度、H2PO4+濃度、Mg2+濃度及NO3-與NH4+濃度對XTW和日本春石斛的離體花芽誘導影響均不顯著。結合潘瑞熾等[18]、蘇勝舉等[19]、謝志剛[20]和陳達菊等[12]對氮、磷和鎂含量及其比例影響蘭花花芽分化研究結果，可以初步得出植物材料的生理成熟度是其花芽分化的一個非常重要因素結論。

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Effect of Ionic Concentration of N, P and Mg, and Culture Temperature on Three Varieties of OrchidsinvitroFlowering

ZHANG Xin-ping1,2, DING Qun-ying3, LI Hao4, ZHANG Fang-fang5,*,ZHU Gen-fa2

(1.TourismDepartmentofShaanxiVocational&TechnicalCollege,Xi’an,Shaanxi710100; 2.EnvironmentandHorticulturalResearchInstitute,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou,Guangdong510640; 3.Xi’anUniversityofArtsandScience,Xi’an710065; 4.Xi’anUniversityofTechnology,CollegeofArtsandDesign,Xi’an,Shaanxi710054; 5.GaolingBranchSchoolofShaanxiAgriculturalBroadcastingandTelevisionSchool,Gaoling,Shaanxi710200)

The study on theinvitroflowering of theDendrobiumspot,D.densiflorumandCymbidiumemsifolium) ‘XiaoTaoHong’×C.aloifolium(XTW) were implemented. The results showed : sucrous 40 g·L-1+carrageenan 6 g·L-1+4.0 mg·L-16-BA supplemented with low nitrogen(N) and high phosphrous(P) and variable temperature helps formulation ofinvitroorchids flowering . Under variable temperature[ (18±1)℃/(25±1)℃], night/day, two flower buds of two plants from theD.densiflorumwere induced, which opened malformation white flower under the treatment MS1(1/3N，9P), and two flower buds from a plant of theD.densiflorumwere induced and bloomed in yellow under the treatment MS4(1/6N，15P). No effect happened to XTW seedlings and the plantlets of theD.spotRightinvitro. The effect of culture temperature and the concentration proportion of H2PO4+、Mg2+、NO3-and NH4+on theinvitroflowering ofD.densiflorumwere significant, though not significant in the XTW andD.spot.

Orchid;invitroflowering；frequency of induced floral buds；frequency of induced vegetative buds

2016-11-11

國家十二五科技支撐計劃課題 (2015BAD07B06-2)；廣東省農(nóng)業(yè)攻關重點項目((2011A020102007))；西安市科技計劃項目(NC13054(4)，CXY1352WL11)。

張新平(1981-)，男, 陜西柞水人, 講師, 在讀博士， 研究方向：園林景觀與遙感監(jiān)測，E-mail：jhonxinping81@nwsuaf.edu.cn。

*通訊作者

S682.31

A

1001-2117(2017)02-0001-06