誘導(dǎo)HO-1表達對慢性間歇性缺氧下INS-1細胞凋亡的影響

徐健 李小莉 李一祿 陳濟明

誘導(dǎo)HO-1表達對慢性間歇性缺氧下INS-1細胞凋亡的影響

徐健 李小莉 李一祿 陳濟明

目的 了解誘導(dǎo)HO-1表達對慢性間歇性缺氧下INS-1細胞凋亡的影響。方法 通過不同濃度CoPP作用于慢性間歇性缺氧下INS-1細胞，觀察胰島素水平、HO-1及Caspase-3水平，采用RT-PCR檢測HO-1、Caspase-3mRNA表達。結(jié)果 隨著CoPP濃度增高，胰島素、HO-1表達逐漸增高，而Caspase-3逐漸降低，而CoPP濃度達到40umol/L時作用最強(P<0.05)。結(jié)論 慢性間歇性缺氧下誘導(dǎo)INS-1細胞HO-1表達，抑制凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，在一定程度上對細胞起保護作用。

慢性間歇性缺氧；INS-1；HO-1；凋亡；Caspase-3

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(OSAHS)以睡眠中反復(fù)發(fā)作的呼吸暫?；蛏蠚獾拦Ｗ铻樘卣?，常常與打鼾、睡眠中斷、白天嗜睡和血氧飽和度降低相關(guān)[1]。研究證實，OSAHS引起的睡眠結(jié)構(gòu)紊亂和間歇性低氧，能誘發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，激活交感神經(jīng)系統(tǒng)，損傷血管內(nèi)皮功能[2-7]。研究還發(fā)現(xiàn)，OSAHS是獨立于肥胖的代謝綜合征的危險因素[8]。OSAHS與糖尿病之間關(guān)系越來越受到重視，但具體機制尚不完全清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)，胰島細胞凋亡在糖尿病發(fā)生發(fā)展是重要機制之一。HO-1系統(tǒng)是機體重要的內(nèi)源性保護系統(tǒng)，主要通過抗炎，抗氧化、抗凋亡等機制起作用[9-11]。我們探討在間歇性缺氧條件下通過CoPP誘導(dǎo)INS-1胰島細胞HO-1表達，對INS-1胰島細胞凋亡的影響。

資料與方法

一、實驗材料

胰島β細胞株INS-1(上海拜力生物科技有限公司)；牛血清白蛋白(Sigma)；細胞培養(yǎng)試劑、胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(均為Gibco)。CoPP(Sigma)。

二、方法

1 細胞培養(yǎng)：胰島INS-1 細胞株購買后，用含10%新生牛血清，2mmol/LL-谷氨酰胺，1mmol/L 丙酮酸鈉，50mmoL/L -巰基乙醇，1×105IU/L 青霉素和100mg/L 鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2及飽和濕度的恒溫箱中培養(yǎng)，每2-3d 傳代一次。

2 研究對象共分為六組： 將密度為1×105/mL的INS-1 細胞懸液接種至96 孔培養(yǎng)板，每組6個復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后，置于自制密閉倉中，暴露時以缺氧(1.5% O2)氣流洗脫細胞培養(yǎng)中氣體，繼而維持缺氧狀態(tài)時間(即IH 時段)，再以正常氧(21% O2)氣體洗脫缺氧氣體，而后再維持正常氧時間，周而復(fù)始形成循環(huán)。IH 暴露時間為12h，次數(shù)均為15次/h。細胞暴露的同時，分別加入不同濃度的CoPP(0、10、20、40、60、80)umol/L，12h后收集細胞及上清液進行相應(yīng)檢測。

3 細胞胰島素分泌檢測： 將細胞按5*104個/孔培養(yǎng)于24孔板, 暴露結(jié)束后，收集細胞上清液, 采用放射免疫分析法(試劑盒購于北京科美生物技術(shù)有限公司)測定胰島素水平。

4 RT-PCR檢測HO-1和Caspase-3 mRNA表達：采用TRIzol抽提細胞總RNA，按照標準抽提步驟進行RNA抽提；取樣品1ug，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用PCR設(shè)計和評估軟件Primer 3.0設(shè)計實時PCR引物。引物序列：HO-1上游引物：ACAGAAGAGGCTAAGACCG；下游引物：CAGGCATCTCCTTCCATT。Caspase-3上游引物：CATGGAAGCGAATCAATGGACT；下游引物：CTGTACCAGACCGAGATGTCA。取樣本總cDNA2μl、上下游引物各1mL，按照試劑盒說明書配制相應(yīng)反應(yīng)參數(shù)的反應(yīng)體系。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性2min；95℃變性1min，60℃退火20s，72℃延伸30s，共45個循環(huán)。運用數(shù)據(jù)分析軟件進行分析，采用2-△△Ct法計算，得到相對值。

三、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、誘導(dǎo)HO-1表達對INS-1胰島素分泌影響

研究發(fā)現(xiàn)隨著CoPP濃度增加，胰島素水平逐漸升高，當(dāng)CoPP達到40umol/L時，INS-1細胞胰島素水平最高(P<0.05)，以后隨著濃度增加胰島素水平逐漸下降。(見圖1)。

圖1 不同濃度CoPP對INS-1胰島素分泌影響

二、誘導(dǎo)HO-1表達對INS-1細胞HO-1mRNA的影響

研究發(fā)現(xiàn)隨著CoPP濃度增加，HO-1表達明顯升高，呈劑量依耐性，CoPP達到40umol/L時，HO-1表達達到頂峰(P<0.05)。而后隨著HO-1濃度增加，HO-1 mRNA表達未見繼續(xù)增高。(見圖2)。

圖2 不同濃度CoPP對INS-1細胞HO-1mRNA表達的影響

三、誘導(dǎo)HO-1表達對INS-1細胞Caspase-3 mRNA的影響

研究發(fā)現(xiàn)隨著CoPP濃度增加，Caspase-3 mRNA表達明顯降低。當(dāng)CoPP達到40umol/L時，能最大程度抑制Caspase-3 mRNA表達(P<0.05)。(見圖3)。

圖3 不同濃度CoPP對INS-1細胞Caspase-3 mRNA表達的影響

討 論

近年來，隨著研究深入發(fā)現(xiàn)OSAHS作為一種常見病，影響全身多個系統(tǒng)，目前認為是一種源頭性疾病，導(dǎo)致嚴重后果。研究發(fā)現(xiàn)，OSAHS與糖尿病、冠心病、高血壓、心律失常以及缺血性腦血管疾病存在內(nèi)在聯(lián)系[12-14]。多項研究表明，OSAHS與糖尿病存在明顯相關(guān)性。同時，隨著中國版OSAHS與糖尿病專家共識的發(fā)布，大家越來越關(guān)注此兩種疾病。

慢性間歇性缺氧是OSAHS主要的致病機制之一，而胰島素分泌不足和胰島細胞凋亡增加也是糖尿病重要的發(fā)病機制。研究發(fā)現(xiàn)，慢性間歇性缺氧可引起胰島素抵抗，加重大鼠胰島細胞凋亡[15]，因此，凋亡可能是OSAHS與糖尿病內(nèi)在關(guān)聯(lián)紐帶。同時，我們前期研究已證實，慢性間歇性缺氧能明顯抑制INS-1胰島素水平和誘導(dǎo)凋亡。

HO-1是血紅素降解途徑限速酶，具有抗炎、抗凋亡、抗增殖等多種生物學(xué)效應(yīng)。現(xiàn)有的證據(jù)顯示，誘導(dǎo)胰島HO-1表達，能對抗細胞因子介導(dǎo)的有害影響。鈷原卟啉(CoPP)，作為HO-1的底物，能增加HO-1的表達和活性。而有關(guān)HO-1與凋亡的研究中發(fā)現(xiàn)，HO-1可通過抑制Caspase-3表達起到抗凋亡作用[16]。Caspase-3是含半胱氨酸的天冬氨酸特異水解酶，在細胞凋亡早期及凋亡過程中起重要作用，是細胞凋亡的關(guān)鍵酶。在正常情況下以無活性的酶原形式存在于多種細胞胞質(zhì)中，多種刺激因素可激活Caspase-3，活化的Caspase-3又進一步切割不同的底物，引起蛋白級聯(lián)切割放大，最終使細胞凋亡[17]。

以往的研究表明，CoPP具有細胞保護作用，主要通過上調(diào)HO-1抑制凋亡相關(guān)蛋白capase-3表達[18]。Lundvig等人研究也發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)HO-1表達能抑制高劑量姜黃素誘導(dǎo)的角質(zhì)細胞凋亡[19]。本研究從體外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，CoPP能促進間歇性缺氧情況下INS-1細胞胰島素分泌，抑制凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達，對細胞起到保護作用，且隨濃度增加，在一定范圍內(nèi)作用越明顯，當(dāng)CoPP達到40umol/L時，其作用最明顯。過度誘導(dǎo)HO-1表達則會因誘導(dǎo)劑的過量而產(chǎn)生毒性作用，使HO-1的表達減少，損害臟器功能[20]。因此，誘導(dǎo)HO-1表達通過抑制Caspase-1減輕INS-1凋亡。

綜上所述，CoPP對間歇性缺氧影響下INS-1保護作用可能與誘導(dǎo)HO-1表達，抑制凋亡有關(guān)。

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Effect of induced HO-1 expression on INS-1 cells in chronic intermittent hypoxia

XUJian,LIXiao-li,LIYi-lu,CHENJi-ming
DepartmentofRespiratoryMedicine,ShenzhenNanshanDistrictPeople’sHospital,Shenzhen518052,China

Objective To understand the effect of HO-1 expression on the apoptosis of INS-1 cells induced by chronic intermittent hypoxia. Methods INS-1 cells were observed under different concentrations of CoPP in chronic intermittent hypoxia, and the levels of insulin were observed. It used RT-PCR to detect the expression of HO-1 and Caspase-3 mRNA. Results With the increase of CoPP concentration, the expression of insulin and HO-1 mRNA gradually increased, while Caspase-3 mRNA decreased. When the concentration of CoPP reached 40umol/L, the strongest effect was observed. Conclusion The induced expression of HO-1 in INS-1 cells can inhibit protein Caspase-3, and protected the cells at certain extent.

chronic intermittent hypoxia; INS-1; HO-1; apoptosis; Caspase-3

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.07.023

廣東省科技計劃項目(No 2013B021800048)

518000 廣東 深圳，深圳市南山區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科

2016-11-10]