木麻黃青枯病菌的分離及強(qiáng)致病菌株的篩選

許秀玉，徐 斌，甘先華，仲崇祿，張華新

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院國(guó)家林業(yè)局鹽堿地研究中心， 北京 100091；2. 廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520；3. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所， 廣東 廣州 510520)

木麻黃青枯病菌的分離及強(qiáng)致病菌株的篩選

許秀玉1,2，徐 斌2，甘先華2，仲崇祿3，張華新1*

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院國(guó)家林業(yè)局鹽堿地研究中心， 北京 100091；2. 廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省林業(yè)科學(xué)研究院，廣東 廣州 510520；3. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所， 廣東 廣州 510520)

[目的]篩選出強(qiáng)致病菌株用于木麻黃抗病育種研究工作。[方法] 在廣東沿海木麻黃青枯病發(fā)病區(qū)采集病根，開展病原菌兩種不同分離方法的比較研究，對(duì)分離出的31個(gè)病株進(jìn)行16s rRNA測(cè)序鑒定及致病性測(cè)定。[結(jié)果] 采用稀釋分離法及根系溢出法在TTC培養(yǎng)基上共分離出了31個(gè)病原菌株，根系溢出法操作簡(jiǎn)便，雜菌含量低，分離率在60%左右，可作為常規(guī)稀釋分離法的補(bǔ)充。31個(gè)菌株進(jìn)行分子鑒定，只有22個(gè)菌株擴(kuò)增出了特異性條帶，經(jīng)測(cè)序比對(duì)確定這22個(gè)菌株為青枯菌。青枯菌株致病性測(cè)定結(jié)果顯示菌株致病性在無性系間、菌株間及菌株與無性系間的交互作用均具有極顯著差異(P<0.01)，不同接種方法間菌株致病性相關(guān)系數(shù)值較小，介于0.496 6 ～ 0.731 0之間，即室內(nèi)水培接種與小苗盆栽接種不存在密切的直線相關(guān)關(guān)系。[結(jié)論] 綜合選擇在不同無性系及不同接種方法中均具有較強(qiáng)致病性的GL-2、H、M、TC-1、F、Q菌株作為下一步木麻黃種質(zhì)資源抗性鑒定及抗病育種研究試驗(yàn)菌株。

木麻黃；青枯菌；分離；分子鑒定；菌株篩選

植物細(xì)菌性青枯病由青枯勞爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的毀滅性土傳病害，是世界范圍內(nèi)傳播廣泛、危害嚴(yán)重、最難防治的細(xì)菌性重大病害之一[1]。該病原菌菌系復(fù)雜，寄主范圍廣，可危害農(nóng)作物、果樹、林木、花卉、藥材、牧草、雜草等54個(gè)科的450余種植物[2]。

近二十年來，木麻黃已成為廣東沿海地區(qū)不可替代的當(dāng)家樹種，生產(chǎn)上利用木麻黃A13及A8無性系大面積造林，使得林分遺傳多樣性單一，防護(hù)林帶退化，林木生長(zhǎng)衰退，木麻黃青枯病迅速擴(kuò)展蔓延，嚴(yán)重威脅整個(gè)沿海防護(hù)林體系。抗病育種目前被認(rèn)為是防治木麻黃青枯病的根本途徑[3]。 我國(guó)木麻黃青枯病抗病育種研究基礎(chǔ)薄弱，在抗源、抗性遺傳規(guī)律、雜交育種、分子標(biāo)記及基因工程等方面研究技術(shù)幾乎都是空白，相關(guān)研究工作集中在上世紀(jì)末，如接種方法及接種條件的研究[4-5]，木麻黃不同樹種或種源的青枯病抗病能力評(píng)價(jià)[6-8]，抗病優(yōu)良品系的篩選[4,9-11]等。由于青枯菌能與植物、環(huán)境相互作用，協(xié)同進(jìn)化產(chǎn)生變異[12]，原來選育出的A8、A13、501等一批抗病無性系隨著時(shí)間推移抗病性大大降低，強(qiáng)致病性菌株也逐漸失去其致病性。因此，目前要開展木麻黃抗病育種研究工作，首先要分離、獲得有效的強(qiáng)致病性菌株。

長(zhǎng)期以來，木麻黃青枯菌株的鑒定及毒性鑒別采用的是簡(jiǎn)單的TTC培養(yǎng)基法[4-5,8-9,13]，即利用TTC培養(yǎng)基特異性區(qū)分青枯菌和其他細(xì)菌，并根據(jù)菌落生長(zhǎng)形態(tài)來判斷其致病性的強(qiáng)弱[14]。研究表明，青枯菌致病性嚴(yán)重分化，菌株間存在著顯著的致病性差異，且在木麻黃—青枯菌的病理系統(tǒng)中，同時(shí)存在水平抗性與垂直抗性[13,15]，因此利用TTC培養(yǎng)基傳統(tǒng)肉眼觀察判斷毒性菌株的方法可靠性較差，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)有必要對(duì)其致病性進(jìn)行檢測(cè)。目前16S rRNA 基因檢測(cè)技術(shù)已成為病原細(xì)菌檢測(cè)和鑒定的重要方法[16-20]，但在木麻黃青枯菌檢測(cè)鑒定中尚未見類似報(bào)道。本研究將16S rRNA 基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于木麻黃青枯菌株的篩選，將根系溢出法用于木麻黃青枯菌的分離，利用水培接種及盆栽接種對(duì)分離出的菌株進(jìn)行致病性測(cè)定，篩選出有效的強(qiáng)致病菌株用于進(jìn)一步木麻黃選育試驗(yàn)，為相關(guān)領(lǐng)域科研人員篩選木麻黃強(qiáng)致病青枯菌株提供參考。

1 材料與方法

1.1 病害標(biāo)本采集

選擇廣東電白、吳川、湛江南三島、湛江東海島及徐聞等有代表性的木麻黃新發(fā)病區(qū)林分，采樣時(shí)選擇田間自然發(fā)病的新發(fā)病植株，挖取木質(zhì)部呈水漬狀或半透明狀根系2～3段，每段10 ～ 20 cm，封口袋封裝，記錄采集時(shí)間、地點(diǎn)，帶回試驗(yàn)室分離病菌。具體病害標(biāo)本采集地點(diǎn)見表1。

表1 菌株編號(hào)與來源

1.2 病原菌不同分離方法的比較

采用兩種分離方法。稀釋分離法參考朱圣杰[21]并加以改進(jìn)：取3cm長(zhǎng)病根，洗凈，75%的酒精浸泡30 s，無菌水沖洗3次，在超凈工作臺(tái)上剝?nèi)ネ馄?，切除兩端，最后將其橫切成3～5份，放入含有5～10 mL無菌水的培養(yǎng)皿內(nèi)30 min，用移植環(huán)蘸取菌液劃線培養(yǎng)于TTC培養(yǎng)基上。根系溢出法：取3～6 cm長(zhǎng)的木麻黃病根，洗凈，兩端切成平整的新鮮斷面，然后把其中一端浸泡于無菌水中，12 ～ 24 h后，在病根的另一端斷面會(huì)流出乳白色的菌膿。用接種針挑取菌膿劃線培養(yǎng)于TTC培養(yǎng)基上。

設(shè)計(jì)雙因素試驗(yàn)，先將病根按無性系分類，再同一無性系不同地點(diǎn)的病根隨機(jī)混合并分別采用2種方法分離病菌，試驗(yàn)重復(fù)3次，每段病根做不少于3個(gè)平板，于30℃下恒溫培養(yǎng) 48 h。分離率(%)=分離出典型菌落的病根數(shù)/參試總病根數(shù)×100。

1.3 病原菌16s rRNA測(cè)序鑒定

青枯菌在TTC培養(yǎng)基上的典型特征為菌落呈不規(guī)則圓形，略隆起，中心部位粉紅色，周圍有白色暈圈，不透明，具有流動(dòng)性的。選擇具有典型菌落特征的菌株進(jìn)行16s rRNA測(cè)序鑒定。

利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽取試劑盒進(jìn)行待測(cè)病菌基因組DNA的提取，試劑盒購買自生工生物工程(上海)股份有限公司。根據(jù) Seal 等[22]結(jié)果設(shè)計(jì)引物，以 16s rRNA 為靶基因的青枯菌特異性引物序列 OL I1：(5’GGGGGTAGCTTGCTACCTG-CC3’)和 Y2：(5’CCCACTGCTGCCTCCCGTAGGA-GT3’)進(jìn)行擴(kuò)增。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考王勝坤等[23]的方法。以DL Marker2000為標(biāo)準(zhǔn)分子量，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄結(jié)果。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將獲得的序列經(jīng)BLAST與GenBank的核酸序列庫中已知青枯菌16S rRNA序列進(jìn)行同源性比較，以判斷所分離得到的菌株是否為青枯菌。

1.4 青枯病菌致病性測(cè)定

1.4.1 參試無性系及菌株培養(yǎng) 選擇抗性不同的木麻黃K18、A14無性系木質(zhì)化褐梗枝條作為莖段水培接種測(cè)定材料。選擇6個(gè)月齡期、60～70 cm高、根系發(fā)達(dá)、生長(zhǎng)一致的木麻黃K18、A14無性系營(yíng)養(yǎng)袋苗為小苗盆栽接種試驗(yàn)苗木。所有參試材料均為不帶菌健康苗木。

選擇經(jīng)測(cè)序鑒定的22個(gè)青枯菌菌株作為測(cè)定菌株。各菌株在TTC固體培養(yǎng)基上活化48 h，再擴(kuò)大培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)36 h。培養(yǎng)液于5 000 r·min-1離心15 min收集菌體，用無菌水配成濃度3×108cfu·mL-1(平板計(jì)數(shù)法)菌懸液用于莖段水培接種，2.7×109cfu·mL-1(平板計(jì)數(shù)法)的菌懸液用于小苗盆栽接種。

1.4.2 室內(nèi)水培接種法及病情調(diào)查 設(shè)計(jì)2個(gè)無性系、22個(gè)菌株的雙因素交叉試驗(yàn)。采用恒溫水培法接種[13]。將木質(zhì)化褐梗枝條剪成15～20 cm的莖段，每個(gè)莖段含有8～10個(gè)小枝。每個(gè)處理將3～4段褐梗莖段浸入盛有200 ml細(xì)菌懸浮液的玻璃瓶?jī)?nèi)，每瓶含有20～30個(gè)小枝。每個(gè)處理重復(fù)3次，無菌水作對(duì)照，置于溫度30℃，相對(duì)濕度80%，光照時(shí)間16 h，強(qiáng)度為8 000 Lux 的人工氣候箱中培養(yǎng)，連續(xù)調(diào)查5 d，每天觀察記錄植株發(fā)病情況，第5天數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

抗性水平的劃分方法參考相對(duì)病害強(qiáng)度(RDI)[5]及Yamazaki[24]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將侵染后的木麻黃小枝分為4個(gè)等級(jí)(0級(jí)，分枝無癥狀；1級(jí)，分枝萎蔫下垂，保持綠色；2級(jí)，分枝枯黃、萎蔫下垂；3級(jí)，小枝干枯死亡)進(jìn)行病情分級(jí)，計(jì)算病情指數(shù)。病情指數(shù)=(∑(各級(jí)病級(jí)分枝數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值)/(調(diào)查總分枝數(shù)×發(fā)病最高級(jí)數(shù)值))×100。

1.4.3 小苗盆栽接種法及病情調(diào)查 設(shè)計(jì)2個(gè)無性系、22個(gè)菌株的雙因素交叉試驗(yàn)。參考移栽浸根法[25]進(jìn)行青枯菌致病性檢測(cè)。抖落苗木土壤，洗凈根部，除去基部黃化葉片，剪去1/3根系，浸入配制好的細(xì)菌懸浮液中，30～31℃保濕浸根培養(yǎng)30 min后種植于裝有草木灰與黃心土(體積比為1:2)的塑料盆中。草木灰與黃心土提前3 d裝好，消毒，攪拌均勻。每個(gè)處理一盆，每盆種植25～30株，重復(fù)3次，無菌水作對(duì)照。種植后每天澆水保持盆內(nèi)濕潤(rùn)，晝夜溫度為28～35℃，相對(duì)濕度80%以上。每天觀察記錄植株發(fā)病情況，第9天數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

以株為單位調(diào)查，記錄無病植株數(shù)與死亡植株數(shù)，計(jì)算死亡率。死亡率(%)= 死亡植株數(shù) / 總株數(shù)×100。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，采用SAS V8.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，相關(guān)分析及Duncan多重比較檢驗(yàn)不同平均值間的差異等。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種分離方法的比較分析

采用稀釋分離法及根系溢出法均能較好地從木麻黃根系分離出青枯病菌。稀釋分離法分離率較高，90%以上的病根可以分離出青枯菌典型菌落，根系溢出法只有60%左右的病根溢出菌膿并分離出典型菌落(表2)。但根系溢出法直接從溢出的菌膿上挑菌劃線培養(yǎng)，操作更加簡(jiǎn)便，雜菌含量低，通常不需要二次分離即可獲得較純的菌株。方差分析表明，無性系及無性系與分離方法的交互作用對(duì)分離率影響不顯著，分離率的高低主要是由分離方法不同引起的(表3)。

表2 兩種分離方法的比較

表3 不同分離方法方差分析

注：**示0.01極顯著水平。

本試驗(yàn)利用兩種分離方法共分離出了31個(gè)在TTC培養(yǎng)基上具有典型菌落特征的病原菌菌株。分離獲得的31個(gè)菌株具體情況見表1。

2.2 病原菌16s rRNA測(cè)序鑒定

以 OLI1/Y2 為特異性引物擴(kuò)增 16S rRNA 基因序列，分離出的31個(gè)菌株有22個(gè)可在2 h內(nèi)擴(kuò)增出280 bp左右的目標(biāo)條帶，且無雜帶出現(xiàn)，電泳結(jié)果如圖1。對(duì)這22個(gè)病原菌作進(jìn)一步測(cè)序鑒定，而A、C、E、G、J、L、T、W、AC等9個(gè)菌株未擴(kuò)增出特異性條帶，為陰性，不再做進(jìn)一步測(cè)序鑒定。

圖1 部分菌株16S rRNA序列擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Amplified electrophoresis detection results for 16S rRNA sequence of some strains

將22個(gè)菌株16S rRNA正反向測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接后與 GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫的基因序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明：B、D、F、H、I、K、M、N、O、P、Q、R、S、U、V、X、Y、Z、AB、AD、GL-2及TC-1菌株與數(shù)據(jù)庫中Ralstonia solanacearum 菌株(登錄號(hào)為CP012943.1、CP012939.1)16S rRNA的同源性高達(dá)100%，結(jié)合菌落培養(yǎng)特征，確認(rèn)這些致病菌為青枯菌(R. solanacearum)。利用稀釋分離法與根系溢出法分離出的同一個(gè)菌株在形態(tài)，特異性條帶及同源性比較中沒有差異。其中M菌株16S rRNA與GenBank中一種青枯菌16S rRNA序列的比較見圖2。

2.3 菌株致病性測(cè)定

2.3.1 室內(nèi)水培接種 由表4可見，參試菌株對(duì)K18、A14無性系褐化莖段均具有致病性，病情指數(shù)在20.0 ～ 94.4之間。22個(gè)菌株接種K18莖段后致病性差異極顯著(P<0.01)，利用 Duncan法進(jìn)行多重比較，將菌株致病性分成若干等級(jí)，AD、Y菌株致病性最強(qiáng)，病情指數(shù)分別為94.4和90.3；致病性最弱的菌株是N、R和U，病情指數(shù)分別為41.9、43.6、45.4。22個(gè)菌株接種A14莖段后致病性差異極顯著(P<0.01)，利用 Duncan法進(jìn)行多重比較，TC-1、GL-2、D菌株致病性最強(qiáng)，病情指數(shù)分別為65.6、64.1和61.2；致病性最弱的菌株是I、O、S及V，病情指數(shù)低于25。雖然在不同無性系中菌株的致病性強(qiáng)弱排列次序有一定差別，如V、Y、Z菌株在A14無性系中致病性等級(jí)下降，TC-1、Q、D、AB菌株在A14無性系中致病性等級(jí)提高，但兩次測(cè)定結(jié)果也指示出一定的規(guī)律性，菌株AD、Y、GL-2、H、M、TC-1、F、Q、D在兩個(gè)無性系中致病性均較強(qiáng)，而菌株N、I、U、S、O、R致病性較弱。

雙因素方差分析結(jié)果表明：無性系、菌株及無性系×菌系的F檢驗(yàn)都是極顯著的(P<0.01)，說明莖段水培接種中不同菌株和不同無性系對(duì)木麻黃的發(fā)病程度有極顯著影響，菌株與無性系的交互作用對(duì)病情指數(shù)也存在極顯著影響(表5)。

圖2 M-16S rRNA序列與GenBank中一種青枯菌16S rRNA序列的比較Fig.2 Comparison of rRNA sequence of M-16S and one of the Ralstonia solanacearum in GenBank

菌株Strain莖段水培接種WaterplantinginoculationK18病情指數(shù)Diseaseindexa=0.01A14病情指數(shù)Diseaseindexa=0.01小苗盆栽接種PottinginoculationK18死亡率mortality/%a=0.01A14死亡率mortality/%a=0.01B66.2±9.7bcd45.9±11.0abcd56.0±16.9de33.9±15.1bcdefgD64.1±20.6bcd61.2±14.8ab4.9±2.2ijk0.0±0.0hF83.2±5.6abc49.6±8.6abcd90.4±8.6ab56.2±14.2abcH80.6±12.4abc59.3±14.7abc93.3±6.1a65.2±19.2abI50.1±19.7cd20.0±5.2f0.0±0.0k0.0±0.0hK51.4±17.0cd41.2±9.2bcde26.0±5.2fgh47.6±8.2abcdefM83.7±7.6abc56.1±3.8abc84.8±6.1abc69.2±19.6aN41.9±8.2d32.9±3.5def1.9±3.2jk0.0±0.0hO58.5±10.7cd21.2±2.4ef6.5±3.0hijk0.0±0.0hP62.9±10.8cd40.9±4.1bcdef24.2±10.7ghi23.9±13.9defgQ70.6±3.6bcd56.2±7.7abc89.2±4.5abc49.7±15.4abcdeR43.6±12.5d41.5±12.0bcde19.3±6.4ghi38.7±26.0abcdefgS56.9±24.7cd21.1±4.9ef0.0±0.0k0.0±0.0hU45.4±2.6d30.8±2.7def25.4±4.1fgh16.0±4.0gV78.7±18.7abc22.2±7.1ef41.8±31.0efg18.8±14.0fgX67.7±3.5bcd44.1±8.2abcd64.6±19.3cde31.1±10.2cdefgY90.3±11.7ab49.0±14.5abcd40.8±9.3efg21.5±7.1efgZ72.8±19.5bcd37.5±8.7cdef13.5±5.1hij18.9±8.2efgAB60.6±19.3cd51.6±18.3abcd74.1±15.7bcd20.1±13.0efgAD94.4±9.6a56.3±11.3abc54.1±10.3def32.0±8.2cdefgGL-281.4±9.6abc64.1±14.2a92.2±3.4ab54.5±15.8abcdTC-172.0±19.2bcd65.6±13.5a89.8±5.8ab59.7±29.1abc

注：所標(biāo)字母相同表示差異不顯著。

2.3.2 小苗盆栽接種 由表4可見， 22個(gè)菌株接種K18小苗后致病性差異極顯著(P<0.01)，死亡率在4.9% ～ 93.3%之間，利用 Duncan法進(jìn)行多重比較，將菌株致病性分成若干等級(jí)，H、F、GL-2菌株致病性最強(qiáng)，造成小苗死亡率90%以上；菌株I、S對(duì)K18無性系無致病性，接種2 d后出現(xiàn)輕微萎蔫癥狀，這主要是由于傷根移栽引起的正常生理現(xiàn)象，培養(yǎng)4 d后植株恢復(fù)生長(zhǎng)，葉色健康濃綠。22個(gè)菌株接種A14小苗后致病性差異極顯著(P<0.01)，利用 Duncan法進(jìn)行多重比較，將菌株致病性分成若干等級(jí)，H、M菌株致病性最強(qiáng)，造成小苗死亡率分別為65.2%、69.2%；菌株D、I、N、O、S對(duì)A14無性系無致病性。綜合比較分析GL-2、H、M、TC-1、F、Q、AB、X、B在兩個(gè)無性系中致病性均較強(qiáng)，而菌株N、I、S、O、D、U、P致病性較弱。

雙因素方差分析結(jié)果表明，菌株致病性在無性系間、菌株間及菌株與無性系間的交互作用均具有極顯著差異(P<0.01)，表明小苗盆栽接種中不同無性系、不同菌株及菌株與無性系的交互作用對(duì)菌株致病性具有極顯著的影響(表5)。

表5 菌株致病性方差分析

注：**示0.01極顯著水平；*示0.05顯著水平。

2.3.3 不同接種方法對(duì)菌株致病性的影響 研究發(fā)現(xiàn)N、I、S、O、D菌株對(duì)A14、 K18無性系小苗無致病性或弱致病性(死亡率0% ～ 6.5%)，但這些菌株卻能使兩個(gè)無性系褐化莖段迅速致病，病情指數(shù)在20.0 ～ 64.1之間(表4)。莖段水培接種與小苗盆栽接種相關(guān)分析結(jié)表明(表6)，不同接種方法之間相關(guān)系數(shù)值較小，介于0.496 6 ～ 0.754 0之間，表明不同接種方法間菌株致病性線性相關(guān)程度為中度相關(guān)，即不存在密切的直線相關(guān)關(guān)系，在莖段水培接種表現(xiàn)強(qiáng)致病性的菌株在小苗盆栽接種中不一定表現(xiàn)出強(qiáng)致病性，反之亦然。

表6 不同接種方法菌株致病性相關(guān)分析

注：A：K18無性系莖段水培接種；B：A14無性系莖段水培接種；C：K18無性系小苗盆栽接種；D：A14無性系小苗盆栽接種。*：顯著相關(guān)；**：極顯著相關(guān)。

經(jīng)比較分析，綜合選擇在不同無性系及不同接種方法中均具有較強(qiáng)致病性的GL-2、H、M、TC-1、F、Q菌株作為下一步木麻黃種質(zhì)資源抗性鑒定及抗病育種研究試驗(yàn)菌株。

3 討論

(1)不同方法分離出的同一菌株在形態(tài)、鑒定及致病性等方面沒有差異。與傳統(tǒng)稀釋分離法相比，采用根系溢出法也能較好地分離出青枯菌菌株，大大減少實(shí)驗(yàn)操作，簡(jiǎn)便快速，雜菌含量少，但分離成功率略低，主要原因可能是部分木麻黃根系組織材質(zhì)致密，不利于菌膿的溢出，二是植株感病時(shí)間太短而沒有足夠的菌膿流出。

(2)R. solanacearum 的核糖體基因序列(即 16S rRNA 間隔區(qū))具有高度保守性和特異性，在同一物種的相似度可高達(dá) 98%[22, 26-27]，已成為病原細(xì)菌檢測(cè)和鑒定的常用方法[28]，本研究首次將這種技術(shù)應(yīng)用于木麻黃青枯菌的檢測(cè)鑒定，利用TTC培養(yǎng)基法[29]分離出的31個(gè)病株有22個(gè)病株擴(kuò)增出了特異性條帶，經(jīng)測(cè)序比對(duì)確定這22個(gè)菌株為青枯菌，青枯菌檢出率約為71% 。

(3)莖段水培接種試驗(yàn)時(shí)，將侵染小枝癥狀分為無癥狀、分枝萎蔫下垂但保持綠色、分枝枯黃并萎蔫下垂、干枯死亡4個(gè)等級(jí)，這種病情分級(jí)方法考慮到了感病植株的發(fā)病進(jìn)程，比王軍[5]簡(jiǎn)單將小枝分級(jí)為萎蔫與正常2個(gè)等級(jí)更科學(xué)合理，結(jié)論更準(zhǔn)確可靠。小苗盆栽接種試驗(yàn)時(shí)，由于傷過根，前3天小苗會(huì)有不同程度的萎蔫下垂甚至基部小枝枯黃脫落，4天后未侵染的苗木逐漸恢復(fù)生長(zhǎng)，受侵染的小苗則逐漸枯萎死亡。由于小枝萎蔫下垂與脫落伴隨著未侵染的苗木較長(zhǎng)的時(shí)間，作者認(rèn)為小苗盆栽試驗(yàn)以最終苗木死亡率作為測(cè)定指標(biāo)比王軍[12]用萎蔫下垂小枝數(shù)的病情判定方法可靠、準(zhǔn)確。

(4)小苗盆栽接種試驗(yàn)中，D、I、N、O、S菌株對(duì)A14、K18無性系小苗無致病性或弱致病性(死亡率0% ～ 6.5%)，但這些菌株卻能使兩個(gè)無性系褐化莖段迅速致病，病情指數(shù)在20.0～ 64.1之間，表明這些菌株不易通過根系侵染植株，但卻能直接侵入莖干維管束組織使植株迅速致病。這是可能由于青枯菌從莖段侵入時(shí)，可直接粘附于維管束組織橫斷面，隨著小枝的蒸騰作用快速侵入莖段維管束組織，大量繁殖并迅速擴(kuò)散至整個(gè)植株，迅速引起病害[30]；而從根部侵入時(shí)，致病性弱的青枯病菌則被幼根細(xì)胞周圍的濃密物質(zhì)所包圍，而阻止病菌的活動(dòng)，從而抑制病菌在根部增殖[31]，Vasse[32]研究也發(fā)現(xiàn)致病菌能侵入到根部?jī)?nèi)皮層和維管束中，非致病菌能侵入到內(nèi)皮層，但在維管束中未發(fā)現(xiàn)病菌。從本次試驗(yàn)看，能通過莖段侵染而不易通過根系侵染的菌株占了參試菌株的23%。木麻黃青枯菌的這種侵染特性部分解釋了廣東省木麻黃青枯病大爆發(fā)經(jīng)常發(fā)生在臺(tái)風(fēng)過后的現(xiàn)象。臺(tái)風(fēng)過后，一方面根系受到傷害，部分菌株可通過根系侵染植株；另一方面大量小枝或莖干折斷、破裂，莖干維管束組織暴露出來，那些不易通過根系侵染的菌株在風(fēng)雨作用下侵入莖干維管束組織使林木迅速發(fā)病，引起沿海木麻黃青枯病大爆發(fā)。這些不易通過木麻黃根系侵染的菌株與容易通過根系侵染的菌株在生理及致病機(jī)理上的差異還有待進(jìn)一步研究。

(5)木麻黃青枯菌菌株的致病性在不同無性系間、不同菌株間存在極顯著差異，而且菌株與無性系之間也存在著極顯著的交互作用，即二者的交互作用對(duì)寄主的發(fā)病程度有直接影響，此結(jié)論與王軍[13]提出的木麻黃對(duì)青枯菌存在水平與垂直抗性及王勝坤[33]在桉樹青枯菌致病性測(cè)定結(jié)果相一致，因此在田間生產(chǎn)中運(yùn)用單一或少數(shù)幾個(gè)木麻黃無性系大面積推廣造林具有較高的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)選用多個(gè)抗病無性系，有效控制青枯病的發(fā)生。相關(guān)分析表明，莖段水培接種與小苗盆栽接種試驗(yàn)結(jié)果不存在密切的直線關(guān)系，即莖段水培接種試驗(yàn)中表現(xiàn)出強(qiáng)致病性的菌株在小苗盆栽接種試驗(yàn)中其致病性有可能會(huì)降低，反之亦然。因此，木麻黃青枯病致病菌株篩選時(shí)，應(yīng)開展菌株、無性系、接種方法的交叉接種試驗(yàn)，綜合選擇。

4 結(jié)論

通過稀釋分離法及根系溢出法對(duì)分離出的31個(gè)病株進(jìn)行16s rRNA測(cè)序鑒定，經(jīng)測(cè)序比對(duì)其中22個(gè)菌株為青枯菌。青枯菌株致病性測(cè)定結(jié)果顯示菌株致病性在無性系間、菌株間及菌株與無性系間的交互作用均具有極顯著差異，不同接種方法間菌株致病性不存在密切的直線相關(guān)關(guān)系。綜合比較分析，選擇在不同無性系、不同接種方法中都具有較強(qiáng)致病性的GL-2、H、M、TC-1、F、Q等菌株作為下一步木麻黃種質(zhì)資源抗性鑒定及抗病育種試驗(yàn)菌株。

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(責(zé)任編輯：崔 貝)

Isolation of Pathogen ofCasuarinaBacterial Wilt and Screening of High Pathogenic Strains

XU Xiu-yu1,2, XU Bin2, GANG Xian-hua2, ZHONG Chong-lu3, ZHANG Hua-xin1

(1. Research Centre on Saline and Alkali Lands of State Forestry Administration, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2. Guangdong Provincial Key Laboratory of Silviculture, Protection and Utilization, Guangdong Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China; 3. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China)

[Objective] To screen high pathogenic strains for studies on germplasm resources resistance identification and resistance breeding ofCasuarina. [Method] TheCasuarinaroots were collected from heavily infected areas in western Guangdong Province. Two methods, dilution isolation and root overflow, were used in strains isolation.Ralstoniasolanacearumstrains were identified by 16S rRNA sequencing and the pathogenicity of these strains were measured. [Result] 31 strains were isolated. The method of root overflow is simple to operate and the isolation rate was about 60%, thus was supplementary to regular dilution method. Only 22 strains were amplified from the 31 strains by using 16S rRNA sequencing, and the amplified strains were identified asR.solanacearum. The results of pathogenicity measurement showed that the pathogenicity of different strains was significantly different (p<0.01), and the correlation coefficients between two different inoculation approaches (water planting and potting) were significant but relatively low (0.496 6 ～ 0.731 0), suggesting that the two approaches were independent. [Conclusion] Six strains were selected for next-step study.

Casuarina；Ralstoniasolanacearum；isolation；molecular identification；strain screening

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.03.007

2016-07-14

廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2014KJCX017和2013KJCX018-03)

許秀玉，教授級(jí)高級(jí)工程師，博士研究生，從事林木遺傳育種及森林生態(tài)研究。E-mail：81250908@163.com
* 通訊作者:張華新，研究員，博士生導(dǎo)師，從事植物抗逆育種研究。E-mail：18611572609@163.com

S432.4+2

A

1001-1498(2017)03-0409-08