ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)公豬精液中常見(jiàn)細(xì)菌的體外抑制效果研究

謝景興，劉兆軍，魏 寧，侯震坤，楊公社，龐衛(wèi)軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712100）

ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)公豬精液中常見(jiàn)細(xì)菌的體外抑制效果研究

謝景興，劉兆軍，魏 寧，侯震坤，楊公社，龐衛(wèi)軍

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712100）

試驗(yàn)首先采用高通量測(cè)序法檢測(cè)常溫保存 1、3、5 d 關(guān)中黑豬精液細(xì)菌的種類(lèi)及所占比例，而后采用 16S rDNA 法初步鑒定精液中分離的部分細(xì)菌，并篩選出精液中常見(jiàn)細(xì)菌作為 ε-聚賴(lài)氨酸體外抑菌試驗(yàn)菌種，最后探究 0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32 g/L 的 ε-聚賴(lài)氨酸對(duì)精液中常見(jiàn)細(xì)菌的抑制作用。結(jié)果表明，在常溫保存過(guò)程中革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢(shì)菌群，且 0.04 g/L 的 ε-聚賴(lài)氨酸能有效抑制大腸桿菌、表皮葡萄球菌和魯菲不動(dòng)桿菌的生長(zhǎng)。因此，在常溫保存過(guò)程中添加 ε-聚賴(lài)氨酸能有效控制精液中常見(jiàn)細(xì)菌的生長(zhǎng)。

ε-聚賴(lài)氨酸；公豬精液；細(xì)菌

公豬精液主要受到動(dòng)物源和非動(dòng)物源的細(xì)菌污染，動(dòng)物源的細(xì)菌主要來(lái)自公豬的糞便、包皮積尿、呼吸道分泌物、生殖道、皮膚和毛發(fā)，而非動(dòng)物源的細(xì)菌主要來(lái)自污染水源、未滅菌的玻璃器皿、精液稀釋設(shè)備及采精、精液稀釋的工作人員等[1]。近年來(lái)在精液中分離到的細(xì)菌大約有 25 種左右，其中以腸桿菌科類(lèi)的細(xì)菌居多[1-2]。王健[3]發(fā)現(xiàn)公豬精液中主要的細(xì)菌有鹽單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬、葡萄球菌屬等。蘇澤智[4]研究發(fā)現(xiàn)精液中的細(xì)菌主要為大腸桿菌、葡萄球菌、變形桿菌等。金穗華等[5]從精液中分離鑒定出 7 種含量較多的細(xì)菌，主要為棒狀桿菌、金黃色葡萄球菌、不動(dòng)桿菌屬等。張家慶等[6]在廣西地區(qū)的公豬精液中主要分離到大腸桿菌、克雷伯菌、變形桿菌等。從上述研究結(jié)果可知細(xì)菌普遍存在于公豬精液中，且不動(dòng)桿菌屬、葡萄球菌、大腸桿菌在以上研究結(jié)果中出現(xiàn)頻率較大，說(shuō)明這幾種細(xì)菌在公豬精液中較常見(jiàn)，可優(yōu)先作為藥敏性試驗(yàn)菌種。

目前主要通過(guò)在精液中添加抗生素用以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，以延長(zhǎng)公豬精液的保存時(shí)間。然而，由于抗生素的不合理使用，致使部分細(xì)菌對(duì)常規(guī)抗生素產(chǎn)生耐藥性。如今，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題已成為世界各國(guó)不得不面對(duì)的公共衛(wèi)生問(wèn)題。而畜牧業(yè)是抗生素濫用的“重災(zāi)區(qū)”。為減少抗生素的使用，出現(xiàn)了很多新型抗菌物質(zhì)。目前，研究較多的是陽(yáng)離子天然的抗菌劑，如乳酸鏈球菌素、納他霉素等。但這些天然抗菌物質(zhì)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（G+） 和霉菌的抑制效果較好，而對(duì)革蘭氏陰性 菌（G-）的抑制效 果不太理想[7]。而污染公豬的細(xì)菌主要為 G-菌[8]。因此，應(yīng)選擇對(duì)于G-抑菌效果好的抗菌物質(zhì)。

ε-聚賴(lài)氨酸（ε-PL）是一種由 25～35 個(gè)相同賴(lài)氨酸殘基構(gòu)成的天然陽(yáng)離子抗菌肽，溶解性大，安全無(wú)害，對(duì) G+和 G-菌均有良好的抑制效果[9-10]。其抑菌機(jī)理是利用自身攜帶的正電荷結(jié)合到帶負(fù)電荷的菌體膜上，使菌體膜變成空洞狀，從而影響細(xì)菌正常的生命活動(dòng)以實(shí)現(xiàn)抑菌作用，當(dāng)該物質(zhì)進(jìn)入人體時(shí)能夠在相關(guān)酶的作用下，轉(zhuǎn)化為人體所必須的賴(lài)氨酸[11]。張偉娜[12]發(fā)現(xiàn) ε-PL 能有效抑制食品中常見(jiàn)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的生長(zhǎng)。李宇雄等[13]研究發(fā)現(xiàn)ε-PL 能有效抑制人體尿液中常見(jiàn)的細(xì)菌（金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌）的生長(zhǎng)，其最小抑菌濃度（MIC）為 0.04 g/L?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，本試驗(yàn)選擇從關(guān)中黑豬公豬精液中分離的幾種細(xì)菌和對(duì)公豬精子危害最大的大腸桿菌作為ε-PL 體外抑菌試驗(yàn)的菌種，探究不同濃度的 ε-PL對(duì)這幾種細(xì)菌的體外抑制效果，為 ε-PL 在關(guān)中黑豬精液常溫保存中的添加量提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 公豬精液 于 2016 年 9 月 1 日開(kāi)始采集來(lái)源于西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧生產(chǎn)實(shí)踐基地成年健康關(guān)中黑豬公豬的精液用于本試驗(yàn)。徒手采精法采精后，用 BTS 液（葡萄糖：37.15 g；檸檬酸鈉：6.00 g；EDTA：1.5 g；碳酸氫鈉：1.5 g；KCl：0.75 g） 稀釋精液，精液分裝，放入保溫箱后迅速帶回西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院脂肪沉積與肌肉發(fā)育實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試驗(yàn)菌種 魯菲不動(dòng)桿菌、表皮葡萄球菌從公豬稀釋精液中分離，大腸桿菌由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院消化道與乳腺生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。1.1.3 主要試劑 DP025，臺(tái)灣捷恩麥克的，細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒（BacteriaGenomicDNAPurification Kit,50r），PCR 擴(kuò)增試劑 Taq 酶，dNTPs（25mM each），DNAmaker（DL 2 000），ε-多聚賴(lài)氨酸（95%國(guó)產(chǎn)分析純）由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，草酸銨結(jié)晶紫染色液，由索萊寶生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 主要儀器 無(wú)菌操作臺(tái)，PCR 儀，離心機(jī)，CASA（精子計(jì)算機(jī)輔助分析儀），光學(xué)顯微鏡，37 ℃搖床培養(yǎng)箱，紫外分光光度計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同保存時(shí)間段精液中微生物的測(cè)定 將用BTS 稀釋后常溫保存 1、3、5 d 的關(guān)中黑豬公豬精液送北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。檢測(cè)不同保存時(shí)間段的關(guān)中黑豬公豬精液中的菌屬，及各個(gè)菌屬所占的比例。

1.2.2 精液中病原細(xì)菌的分離 在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，取 BTS 液稀釋的公豬精液 10 μL 均勻涂抹于固體培養(yǎng)基表面。放入 37 ℃培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng) 12 h后，挑取形態(tài)不同的單個(gè)菌落于 10mL 裝有液態(tài)培養(yǎng)基離心管中，將離心管放入 37℃搖床培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃搖床培養(yǎng) 24 h。

1.2.3 細(xì)菌的保種及革蘭氏染色

（1）保種。

在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)分別取 800 μL 菌液與 400 μL甘油于冷凍管內(nèi)均勻混合后，將冷凍管存放于-80 ℃冰箱內(nèi)保存以供需要時(shí)使用。

（2）革蘭氏染色。

按試劑盒使用說(shuō)明操作。

1.2.4 16S rDNA 的克隆及序列測(cè)定 將菌液提取染色體 DNA，用引物 AD007 和 AD008 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增體系 50 μL：上游引物 2 μL（10mmol），下游引 物 2 μL（10 mmol），模 版 1 μL（約 50 ng），2 ×Taq PCRMastermix 25 μL，超純水 20 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃，5min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72 ℃，90 s；重復(fù) 2～4步驟，進(jìn)行 29 個(gè)循環(huán)；72 ℃，10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，以引物 AD007 和AD008 進(jìn)行測(cè)序（表 1）。將測(cè)序所得序列輸入 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。選擇同源性高的細(xì)菌，使用 MEGA 7.0構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，初步鑒定該細(xì)菌的菌屬。

表1 引物序列

1.2.5 比濁法測(cè)定 ε-聚賴(lài)氨酸的最小抑菌濃度 取0.1 g ε-PL 溶解于 1mL 的無(wú)菌水中，然后從中分別吸取 0、1、2、4、8、16、32 μL 的 ε-PL 于 10mL 的離心管中，除添加 32 μL ε-PL 外的離心管其余的 6 個(gè)管均用無(wú)菌水稀釋至 32 μL。而后用液體 LB 培養(yǎng)基稀釋至 10mL，配制成含有 0、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32g/L ε-PL 的液體培養(yǎng)基。然后在每個(gè)離心管內(nèi)添加10 μL 的菌液，在 17 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 5 d 后，用紫外分光光度計(jì)在 620 nm 處測(cè)量其吸光值（OD620nm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 公豬精液常溫保存 1、3、5 d 后公豬精液中不同細(xì)菌所占比例

在常溫保存第1天精液中主要的細(xì)菌以葡萄球菌科占 24.13%、鏈球菌科占 13.39%、氣球菌科占11.84%等革蘭氏陽(yáng)性菌為主。而革蘭氏陰性菌中的腸桿菌科占 17.19%、鹽單胞菌科占 3.95%、擬桿菌占 4.71%。當(dāng)保存至第 3 天時(shí)，細(xì)菌所占的比例發(fā)生變化。在這個(gè)時(shí)間段 G-所占的比例升高，其中主要是腸桿菌科上升至 30.82%，而 G+所占的比例下降。當(dāng)保存至第 5 天時(shí)精液中絕大部分的細(xì)菌為 G-中的腸桿菌科細(xì)菌，比例達(dá)到 97.76%，而 G+僅占很少的一部分。說(shuō)明在 17 ℃常溫保存件下，革蘭氏陰性菌為優(yōu)勢(shì)菌群。

2.2 精液中分離細(xì)菌的初步鑒定

將測(cè)序所得序列輸入 NCBI比對(duì)，得到不同來(lái)源的已鑒定細(xì)菌的 16SrDNA 序列，其中各個(gè) 16SrDNA序列與測(cè)序所得的序列的一致性 （identity） 均在99%以上，而目前 16S rDNA 的堿基序列的相似性已成為劃分菌屬的標(biāo)準(zhǔn)，其中屬內(nèi)相似性應(yīng)大于95%。而后使用 MEGA 7.0 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，其同一分支上的置信度都在 70 以上，一般而言置信度值在70 以上較為可信[14]。本試驗(yàn)結(jié)果表明分離細(xì)菌樣本D 1.3 與魯菲不動(dòng)桿菌的序列一致性為 99%，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)后其聚于同一分支下且置信度為 100，顯微鏡檢細(xì)菌形狀為球狀或桿狀，革蘭氏染色呈紅色，綜上所述 D 1.3 初步鑒定為魯菲不動(dòng)桿菌。樣本 D 1.2與表皮葡萄球菌同聚一分支，且兩者的序列一致性為 99%，置信度為 99，顯微鏡檢細(xì)菌形狀為葡萄球狀，革蘭氏染色呈藍(lán)紫色。

2.3 ε-聚賴(lài)氨酸（ε-PL）的最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

OD620nm值越大說(shuō)明液體 LB 培養(yǎng)基中細(xì)菌數(shù)量越多，0.01 g/L ε-PL 對(duì)細(xì)菌幾乎沒(méi)有抑菌效果，各細(xì)菌在該濃度下的吸光值接近于或稍微高于未添加ε-PL 組。隨著 ε-PL 濃度的增大，大腸桿菌、表皮葡萄球菌在 ε-PL 的濃度為 0.02 g/L 時(shí) OD620nm急劇下降，說(shuō)明該濃度的 ε-PL 已經(jīng)起到抑菌效果，初步估計(jì) 0.02g/L ε-PL 為大腸桿菌和表皮葡萄球菌的最小抑菌濃度。而在該濃度下魯菲不動(dòng)桿菌的吸光值接近于對(duì)照組，說(shuō)明 0.02 g/L ε-PL 對(duì)該細(xì)菌沒(méi)有抑制效果。當(dāng)ε-PL 濃度為 0.04 g/L 時(shí)，OD620nm急劇下降，說(shuō)明該濃度對(duì)魯菲不動(dòng)桿菌已經(jīng)起到抑制效果。初步估計(jì)0.04 g/L 為魯菲不動(dòng)桿菌的最小抑菌濃度。

3 討論

本試驗(yàn)采用高通量測(cè)序法對(duì)不同常溫保存時(shí)間段關(guān)中黑豬精液細(xì)菌檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在常溫保存第1天，精液中的細(xì)菌主要為 G+菌，G-菌僅占較少的一部分。但隨著保存時(shí)間的增加精液中的細(xì)菌占有發(fā)生了很大的變化。保存至第5天時(shí)公豬精液中絕大部分細(xì)菌為腸桿菌科細(xì)菌 （97.76%），G+菌占極少部分。王健[3]研究發(fā)現(xiàn)在精液的常溫保存初期（1～2 d）細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，當(dāng)精液保存至第3天時(shí)細(xì)菌開(kāi)始呈指數(shù)的增長(zhǎng)。當(dāng)保存至第 5 天時(shí)，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的減少細(xì)菌的生長(zhǎng)速度放緩。因此，我們可以初步認(rèn)為在精液保存的第1天后的精液中的細(xì)菌接近于原精中的細(xì)菌含量。這與王健[3]對(duì)原精中細(xì)菌高通量測(cè)序結(jié)果有所區(qū)別，這可能是由于公豬飼養(yǎng)環(huán)境、采精過(guò)程和精液稀釋及常溫保存環(huán)境不一樣所導(dǎo)致的。因此，應(yīng)嚴(yán)格按采精程序采精，盡量避免在采精過(guò)程中引入細(xì)菌。而保存至第 5 天時(shí)，精液中的細(xì)菌主要為 G-中的腸桿菌科細(xì)菌，說(shuō)明這類(lèi)細(xì)菌在公豬精液常溫保存環(huán)境下為優(yōu)勢(shì)菌群，在選擇抗菌藥物時(shí)應(yīng)選擇對(duì) G-菌有抑制效果的藥物。

大腸桿菌利用自身的結(jié)構(gòu)特性結(jié)合到人精子膜的表面，損傷精子膜的表面從而降低精子活力和活率[15-16]。還有研究表明大腸桿菌還會(huì)黏附到精子的表面，損傷精子頂 體 和 質(zhì) 膜[17]。本 試 驗(yàn) 發(fā) 現(xiàn) ε-PL 在0.02 g/L 時(shí)就能夠有效抑制精液中常見(jiàn)的表皮葡萄球菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)，但在該濃度下對(duì)魯菲不動(dòng)桿菌的抑制效果不明顯，甚至有一定的促生長(zhǎng)作用。需添加到 0.04 g/L 的濃度時(shí)才能對(duì)這種細(xì)菌起到抑菌效果。張偉娜[12]研究發(fā)現(xiàn) ε-PL 是一種廣譜抑菌劑，該抗菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的抑制效果較好。這與本試驗(yàn)的結(jié)果相似。而最小抑菌濃度有所不同，這可能是由于 ε-PL 的生產(chǎn)廠家、純度以及細(xì)菌的菌種不同所導(dǎo)致的。

4 結(jié)論

當(dāng)關(guān)中黑豬精液保存至第1天時(shí)，精液中革蘭氏陽(yáng)性菌占較大的比例，隨著保存時(shí)間的增加，至第5天時(shí)革蘭氏陰性菌占絕大部分。因此在實(shí)踐生產(chǎn)中應(yīng)選擇對(duì)革蘭氏陰性菌抑制效果好的抗菌藥物用以精液的常溫保存。0.04 g/L 的 ε-PL 能夠有效抑制大腸桿菌、魯菲不動(dòng)桿菌和表皮葡萄球菌的生長(zhǎng)。

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（編輯：郭玉翠）

Inhibitory Effect of ε-polylysine on Common Bacteria of Boar Semen in Vitro

XIE Jingxing,LIU Zhaojun,WEINing,HOU Zhenkun,YANG Gongshe,PANGWeijun
(College of Animal Science and Technology,Northwest A&FUniversity,Xianyang 712100,China)

The experimentwas conducted to explore the inhibitory effect of ε-polylysine on common bacteria in semen and to provide new ideas for reducing the use of antibiotics in dilutions.First,the high-throughput sequencing method was used to detect the species and proportion of semen bacteria in the black boar at room temperature for 1,3,5 days.Then,16S rDNA method was used to identify some bacteria isolated from semen and the bacteria ε-polylysine in vitro,and finally explored 0 g/L,0.01 g/L,0.02 g/L,0.04 g/L,0.08 g/L,0.16 g/L, 0.32 g/L ε-polylysine inhibits common bacteria in semen.The results showed that Gram-negative bacteria were the dominant flora during the preservation of normal temperature,and 0.04 g/L ε-polylysine could inhibit the growth of Escherichia coli,Staphylococcus epidermidis and Acinetobacter lwoffi.Therefore,the addition of εpolylysine during the preservation of the room temperature can effectively control the growth of common bacteria in semen.

ε-polylysine;semen;bacteria

S828.3

A

1002-1957(2017)03-0051-03

2017-04-24 收稿，2017-05-08 修回

國(guó)家生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-36）；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站（基地）科技成果推廣項(xiàng)目（TGZX2015-18）

謝景興（1991-），男，福建龍巖人，在讀碩士研究生，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究工作.E-mail：xjx8513@nwsuaf.edu.cn通訊作者：龐衛(wèi)軍（1972-），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榧∪馍飳W(xué)與豬遺傳改良.E-mail：pwj1226@nwafu.edu.cn