利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜追蹤酸奶發(fā)酵過程中的酪蛋白磷酸肽

董 浩, 于 洋, 晏嘉澤, 靳 艷*

(1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室,國家色譜研究分析中心, 遼寧 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

研究論文

利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜追蹤酸奶發(fā)酵過程中的酪蛋白磷酸肽

董 浩1,2, 于 洋1, 晏嘉澤1, 靳 艷1*

(1. 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室,國家色譜研究分析中心, 遼寧 大連 116023; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

酪蛋白磷酸肽(CPPs)是酪蛋白被磷酸化的片段,具有促進礦物元素吸收、抗氧化、預(yù)防齲齒等多種生物功能。該文利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜研究牛奶經(jīng)嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdebrueckiisubsp.bulgaricus)發(fā)酵后CPPs的釋放規(guī)律。結(jié)果表明,在內(nèi)源性蛋白酶的作用下牛奶含內(nèi)源性CPPs,內(nèi)源性CPPs主要來源于高豐度酪蛋白αs1-CN和β-CN。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后,在乳酸菌蛋白酶的作用下更多酪蛋白的磷酸化位點暴露而產(chǎn)生大量CPPs,其中含SpSpSpEE特征結(jié)構(gòu)的CPPs也在酸奶中檢測到,CPPs的釋放與酪蛋白結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。研究結(jié)果表明,牛奶經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后釋放大量含特征結(jié)構(gòu)SpSpSpEE的CPPs,可提高結(jié)合礦物元素的能力,從而增強其促進人體健康的生物功能。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;酪蛋白磷酸肽;乳酸菌;酸奶

酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides, CPPs)是酪蛋白被磷酸化的片段。CPPs不僅具有抗氧化功能,CPPs上的磷酸根還可與鈣、鋅等離子結(jié)合,提高這些礦物元素在人體消化系統(tǒng)中的溶解性,因此CPPs具有促進人體所需礦物元素吸收的作用[1]。CPPs還可為牙釉質(zhì)補充礦物質(zhì),從而達到預(yù)防齲齒、保持口腔健康的目的[2,3], CPPs已在食品、口腔制品中得到應(yīng)用[4,5]。酸奶是傳統(tǒng)的健康食品,酸奶的制備過程就是肽的生成過程,乳蛋白在乳酸菌蛋白酶的作用下降解產(chǎn)生CPPs。研究乳酸菌發(fā)酵過程中CPPs的變化規(guī)律,對于制備富含CPPs的乳制品具有重要的意義。

生物質(zhì)譜技術(shù)的不斷進步和高效富集磷酸肽方法的發(fā)展,實現(xiàn)了蛋白質(zhì)磷酸化位點的高通量鑒定與篩選[6-8]。固定金屬離子親和色譜法(ion metal affinity chromatography, IMAC)是目前廣泛應(yīng)用的磷酸化肽段富集方法,其原理為帶正電的金屬離子與帶負電的磷酸根基團通過靜電相互作用結(jié)合[9]。固定化鈦離子親和色譜法(Ti4+-IMAC)在磷酸肽富集方面表現(xiàn)出高的特異性和富集靈敏度[10]。本文利用制備酸奶的常用菌株嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus,S.thermophilus)和保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdebrueckiisubsp.bulgaricus,Lb.bulgaricus)發(fā)酵牛奶,利用Ti4+-IMAC特異性富集牛奶及酸奶中的CPPs,高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析CPPs,研究在乳酸菌作用下CPPs的釋放規(guī)律,以期為制備富含CPPs的酸奶提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

納升級高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(nano-HPLC-MS/MS)由四元梯度泵、自動進樣器和LTQ線性離子阱質(zhì)譜/Orbitrap軌道肼回旋共振質(zhì)譜儀組成,購自美國Thermo Fisher公司。

乙腈(ACN,色譜純,美國Thermo Fisher公司);氨水(NH35H2O,質(zhì)量分數(shù)為25%; Merck公司);三氟乙酸(TFA,色譜純)、甲酸(FA,色譜純)、氯化鈉(NaCl,分析純)購自Sigma公司;硫酸鈦(Ti(SO4)2,北京國藥集團);脫脂奶粉(內(nèi)蒙古伊利集團);S.thermophilus(CICC6038)和Lb.bulgaricus(CICC6047)購自國家菌種保藏中心(CICC); C18AQ色譜填料(5 μm, 120×10-10m)購自日本DAISO Chemical公司;內(nèi)徑為75 μm和200 μm的石英毛細管購自美國Polymicro Technologies公司;實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制得。

1.2 乳酸菌發(fā)酵

將Lb.bulgaricus和S.thermophilus分別接種到42 ℃和45 ℃含質(zhì)量體積分數(shù)為12%的脫脂奶粉溶液中培養(yǎng)24 h,然后將相應(yīng)菌種轉(zhuǎn)接到新鮮的含質(zhì)量體積分數(shù)為12%的脫脂奶粉溶液中,在相同條件下培養(yǎng)24 h,再次重復(fù)以上操作使菌株恢復(fù)活力。將已活化的菌種按1∶1(v/v)接種到200 mL質(zhì)量體積分數(shù)為12%的脫脂奶粉溶液中,培養(yǎng)發(fā)酵12 h。每個樣品設(shè)置2個平行對照。對發(fā)酵前后的牛奶樣品發(fā)酵液進行取樣。

1.3 磷酸肽富集

采用本實驗室研制的Ti4+-IMAC單分散微球?qū)α姿犭倪M行富集[11]。首先,將Ti4+-IMAC單分散微球分散于含體積分數(shù)為80%的ACN和體積分數(shù)為6%的TFA混合溶液中,然后加入牛奶樣品發(fā)酵液?？刂芓i4+-IMAC微球與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為1∶10,室溫振蕩30 min后,以20 000 g的轉(zhuǎn)速離心3 min除去上清液;然后用含有200 mmol/L NaCl的體積分數(shù)為50%的ACN和體積分數(shù)為6%的TFA混合溶液洗滌小球,室溫振蕩30 min,以20 000 g的轉(zhuǎn)速離心3 min去上清,洗去非特異性吸附肽段;再用含體積分數(shù)為30%的ACN和體積分數(shù)為0.1%的TFA混合溶液洗滌兩次,以20 000 g的轉(zhuǎn)速離心3 min,去上清,達到除鹽的目的;最后用質(zhì)量分數(shù)為10%的氨水將結(jié)合在Ti4+-IMAC微球上的磷酸肽洗脫下來,以20 000 g的轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清,凍干后備用。

1.4 色譜條件

樣品上樣預(yù)柱為內(nèi)徑200 μm、長3 cm的C18填充毛細管柱,所需C18AQ填料粒徑為5 μm。分析柱為自制帶ESI噴針的毛細管柱(內(nèi)徑為75 μm),即先用丁烷氣體噴燈燒熔毛細管柱的一端后拉成內(nèi)徑小于3 μm的尖端,然后利用氣壓法將粒徑為3 μm的C18AQ填料填充到毛細管柱中,長度大約為12 cm。流動相A:體積分數(shù)為0.1%的甲酸水溶液;流動相B:體積分數(shù)為0.1%的甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序:0～2 min, 0～5%B; 2～95 min, 5%B～35%B; 95～100 min, 35%B～80%B; 100～108 min, 80%B; 108～120 min, 100%A。

1.5 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜采用正離子模式檢測,離子噴霧電壓為1.8 kV,離子傳輸加熱毛細管溫度為200 ℃,掃描范圍為m/z400～2 000,歸一化碰撞能量為35%。所有譜圖均在數(shù)據(jù)依賴模式(DDA)下進行采集,一級質(zhì)譜在Orbitrap檢測器中采集,二級質(zhì)譜在LTQ線性離子阱中采集。動態(tài)排除設(shè)置為:重復(fù)次數(shù)為2,重復(fù)持續(xù)時間為30 s,動態(tài)排除時間為90 s。每個樣品質(zhì)譜檢測兩次,篩選兩次鑒定結(jié)果中重復(fù)的CPPs作為鑒定結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)庫檢索和數(shù)據(jù)處理

首先,通過Proteome Discoverer (version 1.2.0)軟件將質(zhì)譜采集的RAW文件轉(zhuǎn)變?yōu)?mgf格式。然后通過Mascot (version 2.3.0)軟件進行數(shù)據(jù)庫檢索[12],所用的數(shù)據(jù)庫為牛源蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫,來自http://www.uniprot.org。檢索參數(shù)為:無酶酶切;可變修飾設(shè)定甲硫氨酸(Met)氧化修飾(+15.995 Da);絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化修飾(+79.966 Da);母離子質(zhì)量容忍度設(shè)為20 ppm(10-6);碎片離子質(zhì)量容忍度設(shè)為0.8 Da。導(dǎo)出肽篩選標(biāo)準:得分值大于20,鑒定結(jié)果的假陽性率小于1%。

2 結(jié)果與討論

2.1 牛奶及酸奶中鑒定到的磷酸化肽

由αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN組成的酪蛋白占牛奶總蛋白質(zhì)含量的80%。利用HPLC-MS/MS對牛奶進行分析,鑒定CPPs和磷酸化位點,結(jié)果見圖1。牛奶中鑒定到108個CPPs,其中源于αs1-CN的有30個、源于αs2-CN的有22個、源于β-CN的有43個、源于κ-CN的有13個。牛奶發(fā)酵前所鑒定到的CPPs,是酪蛋白在纖溶酶、組織蛋白酶等內(nèi)源性蛋白酶的作用產(chǎn)生的內(nèi)源性肽[13]。酪蛋白所產(chǎn)生的內(nèi)源性CPPs與其在乳蛋白中的含量密切相關(guān),酪蛋白中αs1-CN占34%、αs2-CN占8%、β-CN占25%、κ-CN占9%?？梢钥闯?豐度較高的αs1-CN和β-CN所產(chǎn)生的CPPs的數(shù)量也較多。

Lb.bulgaricus和S.thermophilus是常用來制備酸奶的菌種,發(fā)酵過程中酪蛋白在乳酸菌的蛋白酶作用下被降解而釋放出相對分子質(zhì)量不同的肽,關(guān)于Lb.bulgaricus和S.thermophilus的蛋白酶體系的研究已有很多文獻報道[14,15]。本研究對發(fā)酵后酸奶中的CPPs進行富集分析(見圖2),共鑒定到176個CPPs,其中源于αs1-CN的有58個、源于αs2-CN的有24個、源于β-CN的有61個、源于κ-CN的有33個。與牛奶中的內(nèi)源性CPPs相比,酸奶中所鑒定到的CPPs數(shù)量增多,其中高豐度酪蛋白αs1-CN和β-CN釋放CPPs的優(yōu)勢更加明顯。圖3是牛奶及酸奶中鑒定到的CPPs的維恩圖,可以看出,經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后只有22個CPPs與內(nèi)源性CPPs是相同的,其中有11個是來源于β-CN f(27～57)的區(qū)域。新產(chǎn)生的CPPs(154個)占絕大多數(shù),說明乳酸菌與牛奶內(nèi)源性蛋白酶的特異性有較大差別。發(fā)酵前后的CPPs結(jié)果表明,酸奶比牛奶擁有更加豐富多樣的CPPs。

無論內(nèi)源性蛋白酶降解還是乳酸菌蛋白酶體系降解,產(chǎn)生CPPs的區(qū)域均與酪蛋白的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。β-CN的結(jié)構(gòu)疏松,易與蛋白酶作用而被降解[16],而易被降解的結(jié)構(gòu)與其25%的高豐度使發(fā)酵前后β-CN所產(chǎn)生的CPPs的數(shù)量均最多。同樣,具有疏松結(jié)構(gòu)的αs1-CN的N末端(30～60)、κ-CN的C末端(107～169)[17]均是產(chǎn)生CPPs的主要區(qū)域。

圖 1 牛奶中的內(nèi)源性酪蛋白磷酸肽肽譜Fig. 1 Peptide spectra of endogenous casein phosphopeptides (CPPs) in milk

圖 2 發(fā)酵后的CPPs肽譜Fig. 2 Peptide spectra of CPPs after fermentation

圖 2 (續(xù))Fig. 2 (Continued)

圖 3 牛奶及經(jīng)保加利亞菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵制備的酸奶中所鑒定到CPPsFig. 3 CPPs identified in milk and yogurt fermented by Lactobacillus debrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus

2.2 牛奶及酸奶中所鑒定到的磷酸化位點

未經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的牛奶中共鑒定到30個磷酸化位點,包括20個絲氨酸磷酸化位點(S)和10個蘇氨酸磷酸化位點(T)。牛奶經(jīng)Lb.bulgaricus和S.thermophilus發(fā)酵后的酸奶中鑒定到37個磷酸化位點,包括27個絲氨酸磷酸化位點和10個蘇氨酸磷酸化位點。真核生物中,蛋白質(zhì)磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸的羥基上,酪氨酸磷酸化的機率遠遠小于前兩者,三者的豐度比一般認為是1 800∶200∶1[18]。目前酪蛋白中只鑒定到了絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化位點,本研究中鑒定到磷酸化位點共42個,包括29個絲氨酸磷酸化位點和13個蘇氨酸磷酸化位點,其中αs1-CN有12個、αs2-CN有15個、β-CN有8個、κ-CN有7個。一個磷酸化位點可產(chǎn)生多個CPPs,如圖2中αs1-CN磷酸化位點S115共產(chǎn)生9個CPPs。因此42個磷酸化位點數(shù)明顯少于牛奶和酸奶中鑒定到的262個CPPs。表1列出了牛奶及酸奶特有的磷酸化位點?？梢钥闯?經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵后的酸奶除了β-CN外,其余3個酪蛋白均暴露出更多新的磷酸化位點。由于β-CN的結(jié)構(gòu)疏松在內(nèi)源性蛋白酶的作用下就可使其磷酸化位點均被暴露,因此發(fā)酵前后磷酸化位點沒有變化。而其他3個酪蛋白則在乳酸菌蛋白酶的作用暴露出更多的磷酸化位點,因此發(fā)酵后產(chǎn)生更多的CPPs。

表 1 牛奶及酸奶中特有的磷酸化位點

-: not detected.

2.3 CPPs的特征區(qū)域SpSpSpEE

SpSpSpEE是CPPs的特征片段,SpSpSpEE與二價礦物離子形成可溶性有機磷酸鹽,促進多種礦物元素在人體內(nèi)的吸收,因此SpSpSpEE的含量與CPPs的功能特性直接相關(guān)[19]。表2是牛奶及酸奶中鑒定到的CPPs的構(gòu)成,牛奶中的108條內(nèi)源性CPPs絕大部分以單磷酸化形式(phosphorylation, P)存在,只有5個2P CPPs和2個3P CPPs,沒有鑒定到具有SpSpSpEE結(jié)構(gòu)的CPPs。經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵之后,大量酪蛋白被乳酸菌蛋白酶酶解,鑒定到的多磷酸化CPPs顯著增加。

表 2 牛奶及酸奶中鑒定到的CPPs

P: phosphorylation.

酸奶中鑒定到的2個5P CPPs為αs1-CN(61～83)和(62～84), 10個4P CPPs為αs1-CN(62～79)、αs2-CN(1～17)、αs2-CN(6～23)、β-CN(7～25)、β-CN(6～29)、β-CN(5～28)、β-CN(7～31)、β-CN(1～27)、β-CN(1～30)和β-CN(1～31)。以上5P和4P的CPPs均含SpSpSpEE,來自αs1-CN(61～84)、αs2-CN(1～23)和β-CN(1～31)。說明乳酸菌的蛋白酶系統(tǒng)可釋放內(nèi)源性蛋白酶無法降解的含有SpSpSpEE序列的CPPs。因此乳酸菌發(fā)酵制備酸奶可顯著提高含SpSpSpEE的CPPs,從而提高其結(jié)合礦物元素的能力。

3 結(jié)論

本文利用HPLC-MS/MS研究了牛奶內(nèi)源性及經(jīng)Lb.bulgaricus和S.thermophilus發(fā)酵后的酸奶中CPPs和磷酸化位點的變化。牛奶中存在大量內(nèi)源性的CPPs, CPPs數(shù)量與其母體蛋白質(zhì)的豐度密切相關(guān),在乳酸菌蛋白酶的作用下,大量的CPPs被釋放,母體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)直接影響CPPs的數(shù)量。乳酸菌發(fā)酵后使更多隱藏在酪蛋白中的磷酸化位點暴露,特別是隱藏在αs1-CN的絲氨酸磷酸化位點暴露最多。SpSpSpEE是CPPs的特征結(jié)構(gòu),內(nèi)源性蛋白酶無法產(chǎn)生含有SpSpSpEE的CPPs,乳酸菌蛋白酶促使含SpSpSpEE的CPPs被釋放。綜上所述,乳酸菌發(fā)酵可生成大量含SpSpSpEE的CPPs,從而提高CPPs促進礦物元素在人體吸收的功能。

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Financial Support by Key Laboratory of Separation Sciences for Analytical Chemistry, Chinese Academy of Sciences (No. KL-1602)

Tracking casein phosphopeptides during fermentationby high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

DONG Hao1,2, YU Yang1, YAN Jiaze1, JIN Yan1*

(1.KeyLaboratoryofSeparationScienceforAnalyticalChemistry,NationalChromatographicR&ACenter,DalianInstituteofChemicalPhysics,ChineseAcademyofSciences,Dalian116023,China;2.UniversityofChineseAcademyofSciences,Beijing100049,China)

Casein phosphopeptides (CPPs) are phosphorylated fragments of casein, which have a variety of biological functions such as promotion of mineral absorption, antioxidation and prevention of dental caries. This study investigated CPPs in milk and yogurt fermented byLb.bulgaricus(Lactobacillusdebrueckiisubsp.bulgaricus) andS.thermophilus(Streptococcusthermophilus) with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The results showed that milk contained endogenous CPPs, which were mainly derived from high abundance of caseinsαs1-CN andβ-CN, in the role of endogenous protease. After milk fermented withLb.bulgaricusandS.thermophilus, more CPPs and phosphorylation sites were released in the action of lactic acid bacteria proteases. The CPPs with the character of SpSpSpEE were identified in yogurt. The structure of caseins played an important role in CPPs releasing in the process of fermentation. In conclusion, fermentation by lactic acid bacteria is helpful to release CPPs containing SpSpSpEE, which can promote mineral absorption.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS); casein phosphopeptides (CPPs); lactic acid bacteria; yogurt

10.3724/SP.J.1123.2017.03012

2017-03-09

中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室開放基金(KL-1602).

O658

A

1000-8713(2017)06-0587-07

* 通訊聯(lián)系人.Tel:(0411)84379576,E-mail:yanjin@dicp.ac.cn.