豬流行性腹瀉病毒M蛋白的原核表達

劉夢茜, 李春燕, 陳仕怡, 袁曉琴, 星 東, 王全溪

(福建農林大學動物科學學院，福建 福州 350002)

豬流行性腹瀉病毒M蛋白的原核表達

劉夢茜, 李春燕, 陳仕怡, 袁曉琴, 星 東, 王全溪

(福建農林大學動物科學學院，福建 福州 350002)

本試驗設計了M基因的特異性引物，擴增了M基因，成功構建了重組質粒，并轉化至EscherichiacoliBL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，優(yōu)化了異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達條件.結果表明，重組表達的融合蛋白Pet-32a-M大小約為43 ku，與預期大小相符.十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測表明，M蛋白為包涵體蛋白，且在IPTG濃度為0.8 mmol·L-1，溫度為37 ℃，誘導時間為8 h的條件下，蛋白表達效果最佳.蛋白免疫印跡檢測結果進一步顯示，重組蛋白Pet-32a-M在體外可以被成功表達.

豬流行性腹瀉病毒; M蛋白; 原核表達

豬流行性腹瀉是由流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染所引起的一種死亡率較高的腸道傳染性疾病，以食欲下降、嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床癥狀[1].臨床研究表明，豬流行性腹瀉對未斷奶仔豬的危害較大，其感染率可達100%[2-3]，給我國的養(yǎng)豬業(yè)及養(yǎng)殖戶帶來了很大影響.目前對豬流行性腹瀉無有效的藥物進行治療[4]，研制并應用基因工程疫苗是預防該病較為重要的途徑.

本試驗對分離到的PEDV毒株進行測序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行遺傳進化樹分析發(fā)現(xiàn)，該PEDV毒株為經典毒株，與經典毒株的同源性達到98%.PEDV屬冠狀病毒屬，有5個開放閱讀框(ORF)，編碼4種主要的結構蛋白.PEDV S蛋白是病毒粒子表面的纖突蛋白，主要參與病毒與宿主細胞的吸附和融合，并能誘導宿主產生中和抗體[5].但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，S蛋白在受到宿主免疫選擇的壓力下易發(fā)生變異，導致宿主范圍和毒力發(fā)生改變[6].相關文獻表明，2010年在我國已免疫豬群中爆發(fā)的豬流行性腹瀉是由變異的PEDV毒株引發(fā)的，且變異主要集中在S蛋白[7].因此，PEDV-S基因的變異可能是導致豬PEDV疫苗免疫效果不佳的原因.

M蛋白是PEDV另一主要結構蛋白，是冠狀病毒外膜最主要的成分,它的一級結構域對于病毒的裝配極為重要[8].M蛋白為跨膜蛋白，較為保守，能誘導宿主α-干擾素的表達，并能刺激機體產生相應的抗體[9]，在補體存在的條件下可中和病毒[10-11].因此，M蛋白可作為PEDV基因工程疫苗的候選抗原.但大量研究表明，M蛋白在體外較難表達，出現(xiàn)表達量低或不表達的情況.高慎陽等[12]對M蛋白的體外表達進行了嘗試，但僅表達出其膜外區(qū)；另外，吳凌等[13]構建了Pet-30a原核表達載體,并在不同的宿主細胞中反復嘗試誘導表達,但均未獲得成功.盡管在很多文獻中都有涉及M蛋白原核表達載體的構建，但在誘導表達的過程中缺乏細致的誘導條件的摸索，這可能會導致蛋白表達量低或不表達.可見，M蛋白體外的高度表達還存在一定的問題，為提高M蛋白的體外表達，本試驗研究能夠有效穩(wěn)定表達PEDV M蛋白的方法和體系，并通過優(yōu)化條件提高M蛋白的表達量.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及表達載體 PEDV FJ-Fuzhou毒株由本實驗室分離并保存；表達載體為Pet-32a(+)(Promega北京生物技術有限公司)；DH-5α和EscherichiacoliBL21(DE3)感受態(tài)細胞購自Promega北京生物技術有限公司.

1.1.2 試劑與儀器 病毒RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒購自普洛麥格北京生物技術有限公司；BamHⅠ和SalⅠ快切限制酶、高純度質粒小提中量試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒購自博士德生物技術有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、蛋白分子質量標準(10～120 ku)和超級ECL發(fā)光試劑盒購自賽默飛世爾科技公司.

主要儀器有DL777型PCR儀(北京東林生物技術公司)、DYY16D電泳儀(北京六一生物技術有限公司)、Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司).

1.2 病毒RNA的提取

將本實驗室保存的病毒液進行病毒RNA的提取，置冰箱(-80 ℃)保存.

1.3 引物設計與合成

參照NCBI數(shù)據(jù)庫中已上傳的PEDV M蛋白基因序列(KX253991.1)，采用DNAStar軟件設計特異性引物(酶切位點為標有下劃線的堿基序列)：上游引物——CGGGATCCATGTCTAACGGTTCTATTCC(BamHⅠ)；下游引物——GCGTCGACTTAGACTAAATGAAGCACT(SalⅠ).將加有酶切位點的引物送至合成，擴增697 bp的M蛋白基因片段.

1.4 目的基因的PCR擴增

將低溫保存的病毒RNA反轉錄成cDNA，再經PCR反應擴增獲得目的基因片段.經瓊脂糖凝膠電泳后，將697 bp的目的基因片段條帶膠回收純化.

1.5 重組表達質粒的構建與鑒定

純化的目的片段產物和Pet-32a質粒分別經BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后于4 ℃連接，轉化至DH-5α感受態(tài)細胞中，并進行涂板(加有氨芐的LB培養(yǎng)板)，第2天挑取陽性菌落進行PCR鑒定，并提取質粒進行雙酶切鑒定，將鑒定為陽性的質粒送至測序.

1.6 重組質粒在E.coliBL21(DE3)中的誘導表達

將Pet-32a-M重組質粒轉化至E.coliBL21(DE3)中，挑取轉化后過夜培養(yǎng)的白色單克隆菌落接種于1 mL的加有氨芐的液體LB培養(yǎng)基中擴大菌量，并用分光光度計檢測菌液濃度.當D600 nm=1.0時，取出等量的兩份菌液，一份加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG蛋白誘導劑進行處理，另一份則取等量的PBS作為對照，同時設置E.coliBL21(DE3)空白菌誘導組和轉入Pet-32a(+)的空載體菌誘導組作為對照.將4組菌液置于相同的誘導條件下進行蛋白誘導，并進行SDS-PAGE檢測.

1.7 Pet-32a-M蛋白誘導表達體系的優(yōu)化

1.7.1 IPTG最佳誘導濃度的優(yōu)化 保存的陽性克隆菌復蘇后，按照1∶100的比例接種于加有氨芐的LB培養(yǎng)基，置250 r·min-1、37 ℃的搖床中，分別加入不同梯度終濃度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mmol·L-1)的誘導劑IPTG進行誘導，各組誘導時間和溫度保持一致，并進行SDS-PAGE檢測，最終確定最佳的誘導濃度.

1.7.2 IPTG最佳誘導時間的優(yōu)化 在確定的最佳誘導濃度下，其他培養(yǎng)條件不變，分別在不同誘導時間點(0、2、4、6、8和10 h)取樣進行蛋白變性，接著各取20 μL蛋白樣品進行SDS-PAGE檢測，確定最佳的誘導時間.

1.7.3 IPTG最佳誘導溫度的優(yōu)化 在確定的最佳誘導濃度和時間下對菌液進行誘導，并分別置于不同梯度的溫度(25、28、31、34、37和40 ℃)下進行誘導表達，蛋白變性后，取20 μL蛋白樣品進行SDS-PAGE檢測，以確定最佳的誘導溫度.

1.8 重組M蛋白的蛋白免疫印跡檢測

變性的重組蛋白32a-M經SDS-PAGE分離后，采用轉印槽進行免疫印跡，隨后采用一抗和二抗進行免疫雜交，并用ECL顯色液進行曝光.

2 結果與分析

2.1 PEDV-M基因的PCR擴增結果

M：DNA分子質量標準;1：M基因擴增產物.圖1 M基因的PCR擴增電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplified M gene

將PEDV FJ-Fuzhou毒株的基因組作為模板，以M基因的上、下游引物為擴增引物進行PCR擴增.PCR擴增片段經瓊脂糖凝膠電泳，得到一條大小約為697 bp的特異性條帶(圖1)，與預期的片段大小相符.表明該引物對PEDV FJ-Fuzhou毒株M基因片段的擴增具有特異性，并得到PEDV FJ-Fuzhou毒株M基因序列.

2.2 重組表達質粒的鑒定結果

挑選白色單克隆菌為模板，分別用M基因上、下游引物，M基因上游引物和T7下游引物，目的基因下游引物和T7上游引物，T7上、下游引物對陽性克隆菌落進行PCR鑒定.結果(圖2)顯示，分別在697、805、1 272和1 380 bp處得到相應的目的條帶.PCR鑒定后，提取重組質粒進行酶切鑒定.結果(圖3)顯示，轉入目的片段的重組質粒相對于空質粒的位置較高，且雙酶切后分離出大小約為697 bp的片段，與預期片段的大小一致.鑒定結果表明，PEDV M蛋白已成功克隆至Pet-32a載體中.測序結果進一步表明，重組質粒(Pet-32a-M)成功構建，無移碼錯誤.

M:2 000 bp DNA分子質量標準;1：M基因上、下游引物的擴增產物;2:M基因上游引物、T7下游引物的擴增產物;3:M基因下游引物、T7上游引物的擴增產物；4:M基因上、下游引物的擴增產物.圖2 PCR鑒定電泳圖Fig.2 Identification of M gene via electrophoretogram

圖3 PCR酶切鑒定電泳圖Fig.3 Electrophoresis identification of pET-32a-M by restriction enzyme digestion

2.3 誘導的Pet-32a-M蛋白的SDS-PAGE檢測結果

由Pet-32a(+)表達載體圖譜可見，載體自身可表達多個標簽多肽蛋白，整個融合多肽大小約為20 ku.通過DNAMAN軟件分析可知，M蛋白的預測分子質量約為23.6 ku，因此，重組質粒誘導表達出的預期目的蛋白大小約為43.6 ku.取誘導后的重組質粒菌離心，分別取上清和沉淀變性，SDS-PAGE檢測結果(圖4A)顯示，在沉淀中出現(xiàn)與預期大小相同的蛋白，而在空質粒菌和上清中未出現(xiàn)，表明該蛋白為包涵體蛋白.接著取Pet-32a-M重組質粒菌沉淀，在IPTG誘導的條件下，可明顯表達出大小約為43 ku的特異性條帶，同樣條件誘導下的空白菌和Pet-32a空載體菌均未出現(xiàn)該特異性條帶(圖4B).同時對比未誘導的Pet-32a-M重組質粒菌和誘導后的Pet-32a-M重組質粒菌，可見誘導后的重組菌出現(xiàn)的特異性條帶的亮度明顯大于未誘導的重組菌.此外，Pet-32a(+)空載體菌誘導組與空白菌相比，可見一條大小約為20 ku的條帶，這也與預期的空載體標簽蛋白大小相符.

A：可溶性的重組質粒表達產物(M:蛋白質分子質量標準；1：空白誘導組；2:上清；3:沉淀);B：IPTG誘導的重組質粒表達產物(M：蛋白質分子質量標準；1：空白誘導組；2：空載體菌誘導組；3:重組質粒菌未誘導組；4:重組質粒菌誘導組).圖4 E.coli BL21(DE3)中重組菌誘導表達的SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein expressed in E.coli BL21 (DE3)

2.4 32a-M誘導表達條件的優(yōu)化

2.4.1 IPTG最佳誘導濃度的優(yōu)化 在37 ℃下，用不同濃度的IPTG進行誘導，SDS-PAGE檢測結果(圖5)顯示：IPTG終濃度為0～0.6 mmol·L-1時，蛋白條帶較暗且變化不大；IPTG終濃度為0.8～1.5 mmol·L-1時，蛋白條帶的亮度有所增大，且在0.8 mmol·L-1時最亮.可見，Pet-32a-M重組質粒菌在IPTG終濃度為0.8 mmol·L-1時的表達量最大.

M:蛋白質分子質量標準；1～8：IPTG濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5 mmol·L-1時誘導的重組質粒菌組；9：空白誘導組.圖5 重組蛋白誘導濃度優(yōu)化的SDS-PAGE電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of the induced recombinant protein under the optimum IPTG concentration by SDS-PAGE

2.4.2 IPTG最佳誘導時間的優(yōu)化 在IPTG終濃度為1.0 mmol·L-1，溫度為37 ℃的條件下，檢測Pet-32a-M重組質粒菌在0、2、4、6、8和10 h的表達情況.SDS-PAGE檢測結果(圖6)顯示：誘導0和2 h時，蛋白條帶較暗；誘導4 h時，蛋白條帶的亮度明顯增強，且在4～8 h時亮度逐漸遞增，在8 h時達到最亮.可見，在IPTG終濃度為1.0 mmol·L-1，溫度為37 ℃的條件下，Pet-32a-M重組質粒菌在誘導8 h時的表達量最大.

2.4.3 IPTG最佳誘導溫度的優(yōu)化 在IPTG終濃度為0.8 mmol·L-1，誘導8 h的條件下，檢測Pet-32a-M重組質粒菌在25、28、31、34、37和40 ℃下的表達情況.SDS-PAGE檢測結果(圖7)顯示，37 ℃下誘導的蛋白條帶最亮.可見，37 ℃為最適誘導溫度.

2.5 32a-M蛋白的蛋白免疫印跡檢測結果

為驗證Pet-32a-M重組質粒菌誘導后是否是預期的目的蛋白并驗證該蛋白是否具有活性，分別以His·Tag標簽蛋白的抗體和PEDV陽性血清作為一抗，對誘導變性后的蛋白進行蛋白免疫印跡檢測.結果顯示，以His·Tag標簽蛋白抗體作為一抗的重組質粒菌組和空質粒菌組分別在43和20 ku左右的位置出現(xiàn)了特異性條帶，而空白菌組未出現(xiàn)任何條帶(圖8A)，該結果可進一步證明Pet-32a-M蛋白在體外成功表達.采用PEDV陽性血清作為一抗的蛋白免疫印跡檢測結果(圖8B)表明，PEDV M蛋白的體外表達具有一定的抗原活性.

M:蛋白質分子質量標準；1：空白誘導組；2～7：分別為誘導0、2、4、6、8和10 h時的重組質粒菌組.圖6 重組蛋白誘導時間優(yōu)化的SDS-PAGE電泳圖Fig.6 Electrophoretogram of the induced recombinant protein under the optimum expression time by SDS-PAGE

M:蛋白質分子質量標準；1：空白誘導組；2～7：分別在25、28、31、34、37和40 ℃下誘導的重組質粒菌組.圖7 重組蛋白誘導溫度優(yōu)化的SDS-PAGE電泳圖Fig.7 Electrophoretogram of the induced recombinant protein under the optimum temperature by SDS-PAGE

A:以His·Tag抗體為一抗(1：空質粒菌組;2：重組質粒菌組;3：空白菌組);B:以PEDV血清為一抗(1：陽性血清組;2：陰性血清組).圖8 蛋白免疫印跡檢測電泳圖Fig.8 Electrophoretogram of the recombinant Pet-32a-M by Western blot

3 討論

研究表明，冠狀病毒M蛋白表達較為困難，且不穩(wěn)定，少部分動物(如豬、犬等)的M蛋白得到表達，但表達結果不理想，或表達不穩(wěn)定[14-15].張志榜[16]、Gao et al[17]通過將M蛋白基因設計為不同大小的片段并結合融合蛋白進行原核表達的方法，能夠穩(wěn)定地將各個片段穩(wěn)定表達，但只有膜外區(qū)獲得了高度表達，且沒能表達出M蛋白全序列.有研究表明：M蛋白具有抑菌作用，能使細胞膜破裂，導致細胞凋亡，因此在表達過程中很難實現(xiàn)大量表達，且表達不穩(wěn)定[18-19]；當?shù)鞍诐舛冗_到一定量時，會對菌體產生一定的抑制作用，即對宿主產生毒性作用[20].但鄭芳園等[21]研究表明，通過對M蛋白的親水區(qū)進行原核表達并不會在表達過程中出現(xiàn)抑菌或導致細菌死亡現(xiàn)象的發(fā)生.目前對于M蛋白是如何作用于細胞的機制尚不是很清楚，因此，為提高M蛋白體外的表達量，本試驗對誘導條件進行了優(yōu)化，并明確了M蛋白表達的最佳誘導條件.優(yōu)化結果表明，Pet-32a-M重組質粒菌在37 ℃，IPTG終濃度為0.8 mmol·L-1，誘導時間為8 h的條件下誘導，蛋白的表達量最高.

豬流行性腹瀉是一種高度接觸性腸道傳染病，不同種群和不同年齡階段的豬均易感，但對不同年齡階段豬的致死率有所差異，其中對仔豬的致死率最高.對豬的腹瀉病檢測顯示，流行性腹瀉病例占46%，其中，混合感染的病例占31%[22]，這表明流行性腹瀉在我國腹瀉性疾病中占主要地位.自20世紀80年代開始，PEDV在我國各地開始蔓延，并使用相應的二聯(lián)苗和弱毒苗進行免疫預防.近年來，PEDV疫苗的免疫效果漸漸不理想，經典疫苗株CV777弱毒疫苗對變異株引起的流行性腹瀉的免疫效果不佳.通過對PEDV疫苗毒株的全基因組序列與我國臨床毒株的同源性比較發(fā)現(xiàn)，兩者存在較大的差異[23]；對變異毒株進行序列分析發(fā)現(xiàn)，S基因是PEDV變異最大的區(qū)域[24].變異株中S基因的突變或缺失都會使毒株之間的免疫原性存在較大的差異，導致疫苗免疫效果不佳.研究表明，M蛋白較為保守，是病毒刺激機體產生免疫保護的重要結構蛋白；同時，M蛋白能誘導宿主α-干擾素的表達，并能夠刺激機體產生相應的抗體，是作為PEDV基因工程疫苗較為理想的候選蛋白.因此，M蛋白體外的成功表達對該蛋白功能的探索以及基因工程疫苗的研發(fā)都具有重要的意義.

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(責任編輯:施曉棠)

Prokaryotic expression of porcine epidemic diarrhea virus M protein

LIU Mengxi, LI Chunyan, CHEN Shiyi, YUAN Xiaoqin, XING Dong, WANG Quanxi

(College of Animal Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To increase the expression level of M protein which is a candidate antigen for porcine epidemic diarrhea virus, specific primer forMgene was designed and amplified. The positive recombinant plasmid was identified and transformed intoEscherichiacoliBL21 (DE3) competent cell, and followed by being induced by isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG). Then the inducible expression system was optimized in terms of IPTG concentration, expression time and temperature. Results showed that the recombinant protein was successfully expressed, with the molecular weight being about 43 ku. SDS-Polyacrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE) analysis indicated that M protein is an inclusion body protein. The optimal induction conditions were to add 0.8 mmol·L-1IPTG and be induced at 37 ℃ for 6 h. In addition, Western-blot contfirmed that the recombinant plasmid Pet-32a-M was transformed intoE.coliBL21 (DE3) competent cell and successfully expressedinvitro.

porcine epidemic diarrhea virus; membrane protein; procaryotic expression

2016-10-24

2016-12-31

福建農林大學科學發(fā)展基金資助項目(KF2015094).

劉夢茜(1993-)，女，碩士.研究方向：動物傳染病.Email:1241658150@qq.com.通訊作者王全溪(1978-)，男，副教授.研究方向：宿主與病原互作.Email:wqx608@126.com.

S852.65+1

A

1671-5470(2017)03-0299-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.03.011