生防菌PFMP-5對蔬菜根結(jié)線蟲的毒殺效果及其鑒定

丁磊，徐玉梅，王建明

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

生防菌PFMP-5對蔬菜根結(jié)線蟲的毒殺效果及其鑒定

丁磊，徐玉梅，王建明

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

[目的]對蔬菜根結(jié)線蟲病進(jìn)行生物防治是綠色、安全無污染的有效途徑，為獲得對根結(jié)線蟲有明顯拮抗作用的生防細(xì)菌，[方法]采用土壤平板梯度稀釋法對根結(jié)線蟲有良好防效的細(xì)菌菌株P(guān)FMP-5。并通過形態(tài)特征觀察、生理生化測定以及16S rDNA序列分析并確定該菌株的分類地位；[結(jié)果]結(jié)果表明：PFMP-5菌株為沙雷氏菌屬嗜線蟲沙雷氏菌Serratianematodlphila。生防細(xì)菌PFMP-5對根結(jié)線蟲有明顯的抑制作用，該菌150倍液在48小時(shí)后對根結(jié)線蟲的抑制率仍在45%以上。[結(jié)論]PFM-5是一株極具開發(fā)潛力的生防菌株。

生物防治； 根結(jié)線蟲； 鑒定； 毒殺效果

根結(jié)線蟲(Meloidogyne)是一類世界性分布的植物病原線蟲，全球每年因根結(jié)線蟲造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)1000億美元[1]，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，僅蔬菜上每年因根結(jié)線蟲病造成的損失就超過50億元，受害嚴(yán)重的保護(hù)地甚至毀棚或絕收[2～5]。根結(jié)線蟲病害因其發(fā)病初期癥狀很難辨別，一旦地上葉片呈現(xiàn)癥狀時(shí)就已經(jīng)病入膏肓。再加上根結(jié)線蟲寄生性強(qiáng)、寄主范圍廣、繁育周期短和繁殖頻率高等原因都給其防治加了難度[6,7]。

目前生產(chǎn)上常用化學(xué)防治結(jié)合農(nóng)業(yè)防治進(jìn)行根結(jié)線蟲的防治，但是農(nóng)業(yè)防治收效慢，適應(yīng)于大面積推廣。而常用的殺線蟲劑因其高毒性、高殘留、破壞土壤結(jié)構(gòu)等原因而逐漸被禁限用。隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，可替代使用的生物殺線劑現(xiàn)在已被逐漸引入到根結(jié)線蟲的防治中[8～10]，尤其對于生產(chǎn)有機(jī)綠色無公害的餐桌蔬菜而言更是具有廣闊的應(yīng)用前景。但是目前登記的生防產(chǎn)品僅有厚孢輪枝菌、淡紫擬青霉和阿維菌素，可供選擇的藥劑單一，無輪換藥劑選擇，而且長期使用單一殺線蟲劑會(huì)導(dǎo)致不同程度的抗藥性。

本課題組在前期研究根結(jié)線蟲生防菌熒光假單胞菌過程中，在其代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)一株能產(chǎn)紅色色素的菌株P(guān)FMP-5，經(jīng)初步測試其對根結(jié)線蟲有較好的防治效果，為了進(jìn)一步探究PFMP-5生物學(xué)特性及其在根結(jié)線蟲生防中的作用機(jī)理，本研究對菌株P(guān)FMP-5對根結(jié)線蟲的室內(nèi)毒殺效果測定，并采用形態(tài)特征、生理生化特性以及分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對其進(jìn)行鑒定，為其后續(xù)對其進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

生防菌PFMP-5是從根結(jié)線蟲生防菌熒光假單胞菌X-20菌株代謝產(chǎn)物分離獲得的，將PFMP-5菌株置于裝有NA液體培養(yǎng)基的150 ml三角瓶中培養(yǎng)，恒溫28 ℃，轉(zhuǎn)速180 r·min-1，連續(xù)培養(yǎng)48 h，即獲得其發(fā)酵液。采用血球計(jì)數(shù)器測得其濃度約為5.3×108cfu·ml-1。

1.2 供試線蟲

在山西省晉中市太谷縣郝村和范村發(fā)生根結(jié)線蟲病的蔬菜大棚內(nèi)，采集甜瓜植株根部的根結(jié)及其根圍0～15 cm土層的土壤，裝入自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室。分離時(shí)采用淺盤法對根部和土樣中的根結(jié)線蟲的二齡幼蟲備用[11]。

1.3 生防菌PFMP-5對根結(jié)線蟲的室內(nèi)毒殺效果測定

吸取2 ml生防菌PFMP-5發(fā)酵液置于貝氏小皿中，挑入根結(jié)線蟲二齡幼蟲30頭，放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，在12 h、24 h和48 h后在體視鏡下觀察二齡幼蟲的死活，以蒸餾水作為對照組，每組處理重復(fù)3次，以校正死亡率判斷生防菌對根結(jié)線蟲的毒殺效果。

校正死亡率=(處理某時(shí)刻線蟲死亡率-對照某時(shí)刻死亡率)/(1-對照某時(shí)刻死亡率)×100%

1.4 生防菌PFMP-5的鑒定方法

1.4.1 形態(tài)學(xué)特征

用劃線法將生防菌PFMP-5在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～24 h后，觀察其在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征并進(jìn)行拍照；參考方中達(dá)等[12]方法對其進(jìn)行芽孢染色、鞭毛染色和革蘭氏染色，觀察染色結(jié)果并拍照記錄。

1.4.2 生理生化特性測定

生理生化主要測定：明膠液化、賴氨酸脫羧酶、VP(二乙酰)反應(yīng)、水解淀粉、蔗糖產(chǎn)酸、氧化酶、麥芽糖利用、精氨酸雙水解酶、生長4 ℃、生長42 ℃、葡萄糖利用和果糖利用，具體方法參考方中達(dá)等[12]。

1.4.3 分子生物學(xué)鑒定

本試驗(yàn)采用細(xì)菌通用引物對7F/1540R和27F/1492R對該菌的16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系為：10×Taq buffer 2.5μL，d NTPs (2.5 mmol·L-1) 1 μL，模板DNA(20 mg·L-1)0.5 μL，PCR引物各0.5 μL，Taq plus DNA polymerase 0.2 μL，加雙蒸水補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸10 min，PCR產(chǎn)物保存于4 ℃冰箱備用。PCR產(chǎn)物與PMD19-T 載體(TaKaRa)連接，酶切鑒定正確后，送上海生工有限公司測序。測序結(jié)果通過在線分析(http://www.ncbi.nlm. nih.gov)，與 GenBank中的16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析，并用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌PFMP-5對根結(jié)線蟲的室內(nèi)毒殺效果測定

不同濃度的生防菌PFMP-5發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的室內(nèi)毒殺效果如表1所示，原液、稀釋5倍和稀釋10倍的發(fā)酵液殺線蟲率逐漸下降，12 h殺線率依次為100%、82.14%±2.38%和60.71%±2.38%。48 h的不同濃度發(fā)酵液殺線蟲率仍為逐漸下降，相較于對應(yīng)濃度的24h殺線蟲率都有所上升，對根結(jié)線蟲的毒殺效果依次為100%、90.12%±1.64%和62.96%±2.47%。將生防細(xì)菌PFMP-5發(fā)酵液進(jìn)一步稀釋到20倍、50倍、100倍、150倍、200倍，并進(jìn)行殺線蟲能力測試，結(jié)果顯示，隨著生防細(xì)菌PFMP-5發(fā)酵液濃度的降低，其殺線蟲率也有所下降，但直到稀釋液濃度達(dá)到150倍時(shí)，48 h后根結(jié)線蟲校正死亡率仍可達(dá)到40%以上。

2.2 根結(jié)線蟲生防菌PFMP-5形態(tài)學(xué)特征

將生防細(xì)菌PFMP-5在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～24 h觀察其菌落形態(tài)特征，并對其進(jìn)行芽孢染色、鞭毛染色和革蘭氏染色，結(jié)果表明，生防細(xì)菌PFMP-5在NA固體培養(yǎng)基上單菌落呈紅色圓形，周邊整齊，表面隆起(如圖1)；菌體呈不透明白色且非?；钴S，移動(dòng)速度快(如圖2)；該菌革蘭氏染色結(jié)果為陰性(如圖3)。鞭毛染色結(jié)果顯示其有1～2條單極生鞭毛或周身鞭毛(如圖4)。芽孢染色結(jié)果顯示其無芽孢(如圖5所示，菌體為紅色)。

表1 不同濃度PFMP-5發(fā)酵液對根結(jié)線蟲的毒殺效果

Table 1 Toxic effects of PFMP-5 in different concentration on root-knot nematodes

濃度Concen?tration12h24h48h原液10000%±000%10000%±000%10000%±000%稀釋5X8214%±238%9012%±164%9877%±164%稀釋10X6071%±238%6296%±247%8395%±165%稀釋20X5357%±238%6296%±247%7778%±247%稀釋50X4524%±159%6790%±329%7531%±165%稀釋100X4286%±238%5556%±000%6173%±164%稀釋150X1548%±159%2099%±164%4568%±165%稀釋200X357%±238%988%±164%3704%±000%

圖1 生防細(xì)菌PFMP-5菌落形態(tài)Fig.1 The morphous of strain PFMP-5

圖2 生防細(xì)菌PFMP-5單個(gè)菌株形態(tài)Fig.2 The morphous of single PFMP-5

圖3 生防細(xì)菌PFMP-5菌株革蘭氏染色結(jié)果Fig.3 The gram strain result of PFMP-5

圖4 生防細(xì)菌PFMP-5菌株鞭毛染色結(jié)果Fig.4 The staining result of strain PFMP-5

圖5 生防細(xì)菌PFMP-5菌株芽孢染色結(jié)果Fig.5 The spore straining result of PFMP-5

2.3 生防菌PFMP-5的生理生化特性

生防菌PFMP-5的部分生理生化特性如表2所示，其測定結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)中的結(jié)果完全吻合。

表2 生防細(xì)菌PFMP-5部分生理生化特性

Table 2 TabBiochemical and physiological characteristics of strain PFMP-5

生理生化特征Characterisitics菌株P(guān)FMP?5StrainPFMP?5嗜線蟲沙雷氏菌[13]Serratianematodlphila明膠液化[13]++賴氨酸脫羧酶[13]--VP(二乙酰)反應(yīng)[13]++水解淀粉[13]--蔗糖產(chǎn)酸[13]++氧化酶[14]--麥芽糖利用[13]++精氨酸雙水解酶[15]--生長4℃--葡萄糖利用[16]++果糖利用++

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性

2.4 根結(jié)線蟲生防菌PFMP-5的分子生物學(xué)

生防細(xì)菌PFMP-5 16S rDNA PCR擴(kuò)增與測序結(jié)果如圖5所示，生防細(xì)菌PFMP-5經(jīng)過16S rDNA通用引物擴(kuò)增后，獲得長度約序列總長1 477 bp目的基因片段。

圖5 生防菌PFMP-5 16S rDNA PCR 凝膠電泳擴(kuò)增圖Fig.5 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification for PFMP-5

將菌株P(guān)FMP-5所測的16S rDNA序列與其他細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對，結(jié)果如圖6顯示，PFMP-5與嗜線蟲沙雷氏菌(Serratianematodlphila)相似度最高，同源性為65%。

圖6 PFMP-5系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain PFMP-5

2.5 根結(jié)線蟲生防菌PFMP-5的綜合鑒定結(jié)果

通過對PFMP-5菌株形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA等多項(xiàng)指標(biāo)分析，確定分離菌株P(guān)FMP-5為嗜線蟲沙雷氏菌(Serratianematodlphila)。

3 結(jié)論與討論

經(jīng)過對該細(xì)菌的形態(tài)、生理生化特性及分子鑒定，確定該細(xì)菌為嗜線蟲沙雷氏菌(Serratianematodlphila)，隸屬于變形菌門(Proteobacteria)，γ-變形菌綱(γ-proteobacteria)，腸桿菌目(Enterobacteriales)，腸桿菌科(Enterobacteriaceae)沙雷氏菌屬(Serratia)，為革蘭氏陰性菌。同時(shí)也證明了嗜線蟲沙雷氏菌對蔬菜根結(jié)線蟲有良好的抑制殺滅作用。

此外，沙雷氏菌在醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)、紡織染料方面具有廣闊的應(yīng)用前景和巨大研發(fā)價(jià)值，但是有關(guān)沙雷氏菌防治植物病害的報(bào)道仍然較少，尤其是沙雷氏菌的次生代謝產(chǎn)物靈菌紅素，雖然其對于生產(chǎn)生活方面的作用和意義還不是徹底明了，但現(xiàn)在它已被發(fā)現(xiàn)具有多種生物活性作用，能抗癌，抗微生物，抗瘧疾，抗霉，免疫抑制的作用[17,18]。其中抗癌方面，因?yàn)槠渚哂邪┙M織的高針對性和對正常細(xì)胞則表現(xiàn)的低毒害作用，而成為一種非常有潛力的抗癌物質(zhì)[19]。但要將其應(yīng)用到植物根結(jié)線蟲的防治中還需要進(jìn)一步的探索和實(shí)踐。

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(編輯：張貴森)

Toxic effect and identification of biocontrol potential bacterium PFMP-5 on root knot nematodes

Ding Lei， Xu Yumei， Wang Jianming

(CollegeofAgronomy，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

[Objective]Biological agents had become a safe, rapid, and environmentally friendly approach to control root-knot nematodes. In order to get biocontrol bacteria with obvious antagonistic effects to root-knot nematodes, [Methods]our research adopted pour plate method and nematicidal bacterial fermentation method, got a bacterial strain PFMP-5 which had excellent preventing effects to root-knot nematodes in the end. [Results]Through morphological observation, physiological and biochemical test and 16S rDNA sequence analysis, strain PFMP-5 was identified to beSerratianematodlphila.After 48 hours, the inhibition rate of root knot nematode was still above 45%. [Conclusion]The strain PFMP-5 had a wide prospect for its significant inhibitory effect on root-knot nematodes.

Biocontrol， PFMP-5， Root-knot nematodes， Identification

2016-12-22

2017-01-16

丁磊(1991-)，男(漢)，山西隰縣人，碩士，研究方向：線蟲分類及綜合治理

*通信作者：王建明，教授，博士生導(dǎo)師，Tel:0354-6289739; E-mail:jm.w@sohu.com.

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20120311019-3)；山西省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(201601D202072)

S432.4

A

1671-8151(2017)05-0330-05