黃芪AmPAL的生物信息學分析

范新鳳

(山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院, 山西 太谷 030801)

黃芪AmPAL的生物信息學分析

范新鳳

(山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院, 山西 太谷 030801)

[目的]為了研究黃芪苯丙氨酸解氨酶(AmPAL)基因序列的特點，[方法]本文通過生物學軟件對其生物學信息進行分析。[結(jié)果]結(jié)果顯示，AmPAL基因具有5’、3’UTR區(qū)，編碼一個分子量為78.05 kD、穩(wěn)定的親水性脂溶蛋白，此蛋白分布于細胞質(zhì)中，沒有發(fā)現(xiàn)其跨膜片段，含有較多的潛在蛋白翻譯后修飾位點。以歐芹為模板用PDB數(shù)據(jù)庫構(gòu)建其三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)此蛋白為四聚體蛋白，具有6個保守結(jié)構(gòu)域。[結(jié)論]這些參數(shù)為深入了解黃芪的AmPAL基因提供研究基礎(chǔ)。

黃芪； 苯丙氨酸解氨酶； 生物信息學

黃芪具有廣泛的藥理作用，每年供不應求，山西渾源生產(chǎn)的黃芪被認為是目前質(zhì)量最優(yōu)產(chǎn)品[1]，但是在人工栽培過程中由于土地不疏松，黏結(jié)土層氧氣缺少，濕氣大，或者因為一些真菌等使得黃芪易得根腐病，而且根的形態(tài)也易形成雞爪芪，嚴重影響著山西黃芪的栽培產(chǎn)量及質(zhì)量，這就需要提高黃芪抗逆境生存以及抗病的能力，既可以增產(chǎn)又可以減少預防治療黃芪根腐病的農(nóng)藥殘留，對黃芪生產(chǎn)以及質(zhì)量都有積極的作用。植物的正常生長發(fā)育離不開次生代謝，次生代謝既可以幫助植物提高其對環(huán)境的適應性，又可以提高其抗病蟲害的能力，根據(jù)文獻得知木質(zhì)素的形成致密堅硬的細胞壁，使得病原微生物不易入侵植物[2]，而植保素可抵抗病原微生物的入侵，現(xiàn)已知木質(zhì)素和植保素的含量與苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性呈正相關(guān)[3，4]，故分析PAL蛋白特點有利于調(diào)控PAL的表達，從而可提高植物抗病抗逆境的能力。本文將AmPAL結(jié)構(gòu)基因做生物學分析，以便利用分子生物學技術(shù)來研發(fā)表達高水平AmPAL的黃芪新品種而提高黃芪抗病抗逆境的能力。

1 材料與方法

1.1 氨基酸序列的獲取

黃芪苯丙氨酸解氨酶氨基酸序列(ABQ63094)來源于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ protein/148372341)數(shù)據(jù)庫。

1.2 AmPAL的生物學信息分析

參考表1所列軟件對AmPAL基因的核酸、蛋白的理化性質(zhì)、內(nèi)切酶位點、糖基化和磷酸化位點，三級結(jié)構(gòu)等進行預測。

表1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測的軟件和在線工具

1.3 PAL蛋白進化樹構(gòu)建

表2為從NCBI獲得19種植物PAL蛋白序列，以PAL序列作為分子指標進行遺傳聚類(鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，軟件MEGA6.0，Poisson，Correction，Bootstrap=1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 AmPAL基因的核酸分析

圖1為AmPAL基因mRNA編碼氨基酸序列，全長2 485 bp，根據(jù)Lasergene 7.1軟件分析發(fā)現(xiàn)AmPAL堿基組成A、G、T、C分別占 28.49%、23.10%、28.81%、19.60%。35-2 192區(qū)是ORF，ATG和TAG分別是起始和終止密碼子，5’UTR區(qū)34bp，3’UTR區(qū)293bp，分析AmPAL DNA有常見6堿基內(nèi)切酶位點。

2.2 AmPAL蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

表3所列為AmPAL的理化性質(zhì)預測結(jié)果，AmPAL基因能編碼氨基酸718個aa且分子量為78.05kD的蛋白質(zhì)，含量最多的是亮氨酸，高達10.7%，分子式為C3450H5502N950O1060S25，等電點5.77，帶負電氨基酸有81個，帶正電氨基酸有67個，摩爾消光系數(shù)為53 455，脂溶指數(shù)為92.26，不穩(wěn)定系數(shù)為32.40，總平均親水性為-0.167。

2.3 黃芪糖基化、磷酸化位點預測分析

圖2顯示經(jīng)NetOGlyc 4.0、1.0分別預測AmPAL中O、N-糖基化位點，結(jié)果表示在AmPAL氨基酸序列中共有7個O-糖基化位點(11、113、120、124、543、549、551)。預測共有7個N-糖基化位點(105、145、150、262、444、450、614)。

圖3顯示AmPAL磷酸化位點預測共有59個位點， Ser、Thr、Tyr分別有29、20、10個位點。

表2 從NCBI上獲得的19個物種PAL基因的蛋白質(zhì)序列信息

圖1 AmPAL核酸序列分析Fig.1 The analysis of nucleic acid sequence in AmPAL

Table 3 Predicted basic physicochemical properties of PAL protein in Astragalus membranaceus

蛋白的特性PropertiesPAL理化性質(zhì)預測結(jié)果physicochemicalpropertiesofPALprotein氨基酸總數(shù)(AminoAcids)718蛋白分子式(Formula)C3450H5502N950O1060S25蛋白分子量(Molecularweight)7805087等電點(TheoreticalpI)577帶負電荷氨基酸數(shù)目(Negativelychargedresidues)81帶正電荷氨基酸數(shù)目(Positivelychargedresidues)67氨基酸組成(Aminoacidcomposi?tion)最多的為Leu，107%摩爾消光系數(shù)(Extinctioncoeffi?cient)53455脂溶指數(shù)(Aliphaticindex)9226不穩(wěn)定系數(shù)(Instabilityindex)3240總平均親水性(Grandaverageofhy?dropathicity)-0167

圖2 N-糖基化位點預測Fig.2 N-glycosylation sites prediction

圖3 磷酸化位點預測Fig.3 Phosphorylation sites prediction

2.4 AmPAL蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

圖4顯示經(jīng)過NCBI的CDD(Conserved Domain Database)數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)AmPAL蛋白含有6個保守結(jié)構(gòu)域。

圖4 保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.4 The analysis of conservative structure domain

2.5 AmPAL蛋白高級結(jié)構(gòu)預測分析

圖5顯示經(jīng)過PredictProtein預測AmPAL二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)AmPAL二級結(jié)構(gòu)中含53.20%螺旋，4.87%直鏈和41.93%環(huán)。

圖5 AmPAL蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測Fig.5 Predicted the secondary structure of AmPAL protein

圖6顯示以歐芹為模板，用PDB數(shù)據(jù)庫對AmPAL三級結(jié)構(gòu)進行建模，從圖可見此蛋白有4個結(jié)構(gòu)域，2個配體。

圖6 AmPAL蛋白的三維結(jié)構(gòu)Fig.6 Predicted 3D structure of AmPAL protein

2.6 PAL基因分子系統(tǒng)進化樹分析

圖7顯示將所選擇的19種植物以PAL序列作為分子指標進行遺傳聚類，得到進化樹圖， 19種植物的PAL大概聚為2支，一類為豆目豆科植物，一類為其他科目，黃芪和豆科的植物明顯的聚為一類，但又不同，這與一般分類方法結(jié)果一致。

圖7 AmPAL和其他植物PAL的分子進化分析Fig.7 Molecular evolution analysis between AmPAL and PAL of other plant

3 討論

隨著中藥現(xiàn)代化事業(yè)的不斷發(fā)展，黃芪常年供不應求，野生黃芪面臨枯竭，人工栽培黃芪面積雖逐年增加，但庫存量遠不夠用，這就需要積極研發(fā)黃芪新品種，提高黃芪抗病抗逆境能力來滿足社會對黃芪的需求量。不少文獻證明PAL存在于所有綠色植物中，且證明PAL可提高植物抗病抗逆境能力，故研究AmPAL將有助于開發(fā)黃芪新品種。

本文分析結(jié)果得到AmPAL分子量為78.05 kD，比一般PAL蛋白(分子量為220～330 kD)小[11]，在黃芪中小分子氨基酸Leu含量最多，達到10.7%，Ala和Gly含量分別達到8.8%和8.2%，因此導致AmPAL分子量小。

黃酮類活性成分不僅能使植物茁壯生長，還具有廣泛的藥理作用，黃芪黃酮是除黃芪多糖和皂苷之外的另一類藥理成分，已被發(fā)現(xiàn)它也具有提高免疫力、保肝、抗炎等作用，在植物體內(nèi)，PAL可催化黃酮類物質(zhì)的生成，許多文獻報道黃酮成分含量隨著PAL活性而增減[12,13]，可見，AmPAL表達量與黃芪黃酮含量呈正比。本文通過對AmPAL蛋白的預測分析，發(fā)現(xiàn)此蛋白二級結(jié)構(gòu)主要由螺旋和環(huán)組成，且具有很多翻譯后修飾位點，為深入研究該蛋白的功能提供了理論基礎(chǔ)。

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(編輯：韓志強)

Bioinformatic analysis of AmPAL gene

Fan Xinfeng

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu030801,China)

[Objective]The characteristics of phenylalnine ammonia-lyase in Astragalus membranaceus (AmPAL) was analyzed. [Methods] Biological software was used to analyze biological information in this article. [Results] The results suggested that AmPAL had 5 ‘a(chǎn)nd 3’ UTR region, encoding a 78.05 kD and stable hydrophilic lipid soluble protein, AmPAL protein was mainly located in the extracellular matrix, it had no transmembrane motif. There were some post-translation modified sites in AmPAL. The 3D models of AmPAL protein were successfully constructed based on the template of Parsley, four polymers and six conserved domains were found in this protein. [Conclusion] These parameters provided guidance significance for a thorough understanding of AmPAL gene.

Astragalus membranaceus， PAL， Bioinformatics

2016-12-21

2017-02-24

范新鳳(1980-)，女(漢)，山西平遙人，博士，講師，研究方向：中藥加工技術(shù)

山西農(nóng)業(yè)大學創(chuàng)新基金(20142-11)

Q946.5

A

1671-8151(2017)05-0320-06