百令膠囊影響糖尿病腎病大鼠Caveolin-1蛋白表達(dá)機(jī)制探討

韓 坤，鄭亞萍

漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校生理教研室(河南 漯河 462002)

百令膠囊影響糖尿病腎病大鼠Caveolin-1蛋白表達(dá)機(jī)制探討

韓 坤，鄭亞萍

漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校生理教研室(河南 漯河 462002)

目的 探討百令膠囊影響糖尿病腎病大鼠Caveolin-1蛋白表達(dá)機(jī)制。方法 30只SD大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10) 、模型組(n=20)，模型組給予高脂飲食，喂養(yǎng)8周后，模型組大鼠應(yīng)用鏈脲佐菌素(STZ)按40 mg/kg腹腔注射，對(duì)照組給予等體積枸櫞酸鈉；72 h測(cè)定兩組大鼠隨機(jī)血糖、體質(zhì)量及24 h尿蛋白定量，將成模的 16只大鼠隨機(jī)平分成2組：糖尿病腎病模型對(duì)照組(DN組，n=8)、百令膠囊組(n=8)，DN組及正常對(duì)照組均給予等量蒸餾水灌胃，百令膠囊組給予百令膠囊(2.5 g/kg·d-1)灌胃，4周后測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖、24 h尿蛋白定量及Caveolin-1蛋白表達(dá)量。結(jié)果 DN組Caveolin-1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組升高了(112.8±2.76)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而百令膠囊組較對(duì)照組升高了(61.2±4.31)%，較DN組下降了(51.6±3.48)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 百令膠囊可能通過(guò)調(diào)節(jié)Caveolin-1蛋白表達(dá)發(fā)揮對(duì)糖尿病腎病腎臟損傷的保護(hù)作用。

糖尿病腎病;一氧化氮合酶;百令膠囊; Caveoline-1

在中國(guó)，糖尿病患病率呈逐年上升趨勢(shì)[1]，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷提高，糖尿病的急性并發(fā)癥死亡率大大下降，但糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)做為糖尿病的慢性并發(fā)癥，其發(fā)生率卻明顯增高，并嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，遺傳、代謝、血流動(dòng)力學(xué)等多種因素參與其中。其中，一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthases, eNOS)調(diào)控血管通透性以及緊張度[2]，對(duì)糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用。Caveolin-1是一種整合膜蛋白, 可溶性Caveolin-1主要存在于胞漿、線粒體以及分泌小泡。Caveolin-1多種存在形式的特性提示了它生物功能的多樣性，在多條細(xì)胞傳導(dǎo)信號(hào)中起重要作用[3]。eNOS對(duì)一氧化氮(NO)的調(diào)控主要通過(guò)結(jié)合Caveolin-1的CSD區(qū)域，并受其直接調(diào)節(jié)從而起負(fù)調(diào)控作用[4]。Caveolin-1 在DN中的報(bào)道較少。臨床上百令膠囊在DN的治療中效果明顯，本實(shí)驗(yàn)主要研究Caveolin-1在DN中的作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 30只成年SD大鼠(2月齡，體質(zhì)量180～250 g)雄性，SPF級(jí)，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)：SCXK豫2015-0011，合格證號(hào)：0008146)。于本實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房分籠飼養(yǎng)，室溫18～25 ℃，濕度40%～60%,白/夜12 h，自由飲食水。

1.2 主要儀器及試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自美國(guó)sigma 公司，百令膠囊購(gòu)自杭州中美華東制藥有限公司，血糖測(cè)定儀購(gòu)自強(qiáng)生公司，尿微量白蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。兔Caveolin-1受體-抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；小鼠Beta-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)sigma公司，Blottinggradegoat Anti-Rabbit IgG(H+L)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，Blottinggrade Affinity Purifiedgoat Anti-Mouse IgG(H+L) 購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和動(dòng)物模型制作：30只SD大鼠，給予普通飼料喂養(yǎng) 1 周，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10) 、模型組(n=20)，對(duì)照組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組給予高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)8周后，禁食12 h，模型組大鼠應(yīng)用STZ按40 mg/kg單次腹腔注射(STZ溶解在0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中，配制成pH4.5液體使用)，對(duì)照組給予等體積0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射；觀察72 h，接下來(lái)連續(xù)3 d測(cè)定兩組大鼠隨機(jī)血糖、體質(zhì)量，留取24 h 尿液測(cè)定尿量，并檢測(cè)24 h尿蛋白定量，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L；24 h尿量>原尿量150%；尿蛋白排泄>30 mg/24 h，則提示2型糖尿病腎病模型造模成功。模型組共有16只大鼠造模成功。

1.3.2 將造模成功的16只糖尿病腎病大鼠隨機(jī)平分成2組：糖尿病腎病模型對(duì)照組(DN組，n=8)、百令膠囊組(n=8)，DN組及正常對(duì)照組均給予等量蒸餾水灌胃，百令膠囊組給予百令膠囊(2.5 g/kg·d-1)灌胃，4周后測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組大鼠血糖及24 h尿蛋白定量，然后處死各組大鼠，取腎臟組織并提取蛋白，利用蛋白質(zhì)印跡法(western-blot)檢測(cè)Caveolin-1蛋白在各組中的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 造模后兩組基本數(shù)據(jù)比較 造模后，模型組大鼠體質(zhì)量較前下降，隨機(jī)血糖、24 h尿量、24 h尿蛋白均顯著升高(P<0.05)，模型構(gòu)建成功，見(jiàn)表1。

表1 造模后兩組基本數(shù)據(jù)比較±s)

注：VS對(duì)照組，*：P<0.05

2.2 對(duì)照組、DN組、百令膠囊組血糖和24 h尿蛋白定量比較 與對(duì)照組比較，DN組、百令膠囊組隨機(jī)血糖、24 h尿蛋白量均明顯增加(P<0.05)；較DN組，百令膠囊組隨機(jī)血糖無(wú)明顯差異，24 h尿蛋白量下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組、DN組、百令膠囊組血糖、24h尿蛋白定量比較

注：VS對(duì)照組，*P<0.05；VS DN組，▲P<0.05

2.3 對(duì)照組、DN組、百令膠囊組Caveolin-1蛋白表達(dá)量變化 DN組Caveolin-1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組升高了(112.8±2.76)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而百令膠囊組較對(duì)照組升高了(61.2±4.31)%，較DN組下降了(51.6±3.48)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

注：VS對(duì)照組，*P<0.05；VS DN組，▲P<0.05 圖1 對(duì)照組、DN組、百令膠囊組Caveolin-1蛋白表達(dá)量變化

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病的常見(jiàn)慢性并發(fā)癥之一，隨著病情進(jìn)展，多數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)蛋白尿，嚴(yán)重時(shí)會(huì)因?yàn)槟I衰竭而危及患者生命。

eNOS調(diào)控血管通透性以及緊張度[5]，在糖尿病腎病中的發(fā)生發(fā)展中有重大意義[6]。 它對(duì)NO的調(diào)控主要通過(guò)結(jié)合Caveolin-1的CSD區(qū)域，并受其直接調(diào)節(jié)從而起負(fù)調(diào)控作用。Caveolin-1的CSD可以和eNOS結(jié)合抑制NOS活性[7]； Akt誘導(dǎo)的eNOS磷酸化或者Ca2+/calmodulin的提高[8]可以使該抑制作用被阻斷。在敲除Caveolin-1基因小鼠的研究表明，導(dǎo)致乙酰膽堿誘導(dǎo)性的血管舒張功能隨著NOS的基礎(chǔ)水平提高而加強(qiáng)，血管收縮功能因?qū)Ζ?-腎上腺素的反應(yīng)而降低[9]，血管通透性隨之增加，而eNOS的抑制劑L-NAME則可以發(fā)揮相反的作用。在Drab和Razanil的研究中，利用Caveolin-1基因敲除的小鼠[10]，通過(guò)離體大動(dòng)脈血管收縮緊張度測(cè)量，發(fā)現(xiàn)在Caveolin-1的缺乏時(shí)，eNOS活性水平及血管彈性均降低，這一現(xiàn)象在動(dòng)脈血管也已經(jīng)被證實(shí)。該項(xiàng)研究進(jìn)一步表明Caveolin-1在NO信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。因此，Caveolin-1可能在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：DN組Caveolin-1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組升高了(112.8±2.76)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Caveolin-1參與糖尿病腎病發(fā)病，與上述Caveolin-1可能在糖尿病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用的結(jié)論基本符合。在本實(shí)驗(yàn)中，DN組Caveolin-1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組升高，糖尿病腎病作為一種常見(jiàn)的糖尿病微小血管并發(fā)癥，其引起的糖尿病血管病變，可能與其誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞上Caveolin-1的表達(dá)有關(guān)[11]。多項(xiàng)研究證實(shí)，Caveolin-1改善缺血部位的血液供應(yīng)可能通過(guò)激活 Akt 信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)Akt/NO的生成而介導(dǎo)血管生成，本實(shí)驗(yàn)中DN組Caveolin-1蛋白表達(dá)量的升高提示在該過(guò)程中Caveolin-1發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用，與以往的研究中Caveolin-1多發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用的結(jié)論不一致，考慮Caveolin-1參與眾多的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其負(fù)性調(diào)控作用并非在所有的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑適用[12]，同時(shí)，Caveolin-1 在血管形成中的具體功能本身仍存在爭(zhēng)議，有研究推測(cè)在高血糖狀況下，Caveolin-1的促進(jìn)缺血組織中的血管形成的作用只有在Caveolin-1表達(dá)水平達(dá)到一定程度才能發(fā)揮，其詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究[13]。

在糖尿病腎病的治療過(guò)程中，控制尿蛋白和降糖要同時(shí)進(jìn)行[14]。百令膠囊是采用生物工程方法分離的冬蟲(chóng)夏草菌種經(jīng)低溫發(fā)酵精心研制而成的純中藥制劑，臨床研究提示百令膠囊在抑制腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化、延緩慢性腎衰竭進(jìn)展等多種腎臟疾病的治療中起重要作用[15]，但是有關(guān)百令膠囊在DN治療中的詳細(xì)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)在糖尿病腎病大鼠成功造模的基礎(chǔ)上，觀察百令膠囊對(duì)DN大鼠血糖、蛋白尿的影響及Caveolin-1蛋白表達(dá)量的變化。研究結(jié)果表明：百令膠囊組較DN組隨機(jī)血糖無(wú)明顯差異，24 h尿蛋白量下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Caveolin-1蛋白表達(dá)量百令膠囊組較對(duì)照組升高了(61.2±4.31)%，較DN組下降了(51.6±3.48)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明百令膠囊降低尿蛋白、改善腎功能有可能通過(guò)對(duì)Caveolin-1蛋白表達(dá)量的調(diào)控發(fā)揮作用。

綜上，本研究提示百令膠囊可能通過(guò)調(diào)節(jié)Caveolin-1蛋白表達(dá)，從而對(duì)DN腎臟損傷起到一定的保護(hù)性作用，為臨床治療DN提供出新的理論依據(jù)，其治療DN的具體機(jī)制及Caveolin-1蛋白在其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用尚有待于進(jìn)一步研究。

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責(zé)任編輯：牟冬生

Effect of Bailing Capsule on Caveolin -1 Protein Expression of Diabetic Nephropathy Rats

Han Kun，Zheng Yaping

(TheDepartmentofPhysiology，LuoheMedicalColloge,Luohe462002,China)

Objective To investigate the effect of Bailing capsule on caveolin-1 protein expression of diabetic nephropathy rats. Methods 30 SD rats were randomly divided into control group (n=10) and model group (n=20).The model group was injected Streptozotocin (40 mg/kg) into abdominal cavity after 8 weeks'high-fat diet and the control group was given same dosage of sodium citrate. After 72 hours, the random blood glucose, weight and 24-hour urine protein were detected. The 16 model rats were randomly divided into diabetic nephropathy group(DN group, n=8)and Bailing capsule group(n=8). The DN group and control group were given the same amount of distilled water, and the bailing capsule group was given Bailing Capsule (2.5 g/kg·d-1). After 4 weeks, the random blood glucose, 24-hour urine protein and Caveolin-1 protein expression were observed. Results Compared with the control group, the Caveolin-1 protein expression of the DN group was up by (112.8±2.76) % and that of the Bailing capsule group was up by (61.2±4.31) %. Compared with the DN group, the Caveolin-1 protein expression of the Bailing capsule group decreased by 51.6±3.48%.The difference was statistically significant(P<0.05).Conclusion The Bailing capsule may protect the renal injury of diabetic nephropathy by adjusting the Caveolin-1 protein expression.

diabetic nephropathy;endothelial nitric oxide synthases;bailing capsule;caveolin-1

韓坤，男，碩士，講師，主要研究方向：神經(jīng)生理和內(nèi)分泌學(xué)。

R285

A

1008-8164(2017)02-0021-03

2017-03-31