用于測(cè)定黑茶中鉛的熒光增強(qiáng)化學(xué)傳感器

龍立平，孟維，王姣亮，謝丹，賀國(guó)文，肖谷清

湖南城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 益陽(yáng) 413049

用于測(cè)定黑茶中鉛的熒光增強(qiáng)化學(xué)傳感器

龍立平，孟維，王姣亮，謝丹，賀國(guó)文，肖谷清

湖南城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖南 益陽(yáng) 413049

鉛(Ⅱ)對(duì)固定在增塑的聚氯乙烯（PVC）敏感膜中的紅霉素A有可逆熒光增強(qiáng)作用，據(jù)此研制了測(cè)定鉛（Ⅱ）的熒光化學(xué)傳感器。該傳感膜的組成為：50.0 mg PVC、100.0 mg鄰苯二甲酸二異辛酯和2.94 mg紅霉素A。該傳感器在pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液中，測(cè)定鉛（Ⅱ）的動(dòng)力學(xué)范圍為4.00～6.00 mmol·L-1，檢出限為0.10 μmol·L-1，響應(yīng)時(shí)間小于50 s。該傳感器具有良好的重現(xiàn)性、可逆性和選擇性，除Cr2O72-和MnO4-外，常見(jiàn)陰離子和陽(yáng)離子不干擾測(cè)定。該傳感器應(yīng)用于黑茶水樣中鉛（Ⅱ）含量的測(cè)定，結(jié)果與GB 5009.12—2010法一致。

光化學(xué)傳感器；熒光增強(qiáng)；鉛(Ⅱ)；紅霉素A

黑茶是中國(guó)六大茶類(lèi)之一，更是西北少數(shù)民族不可缺少的日常飲品。由于茶園土壤、水質(zhì)及汽車(chē)尾氣等多種原因?qū)е虏枞~中含有一定量的鉛。飲茶成為人體攝入鉛的途徑之一。鉛是人體非必需的一種累積性極強(qiáng)的有害元素，被列為茶葉衛(wèi)生檢驗(yàn)項(xiàng)目之一。茶葉國(guó)家進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[1]中鉛含量小于2 mg·kg-1。因此，在茶葉生產(chǎn)、銷(xiāo)售過(guò)程中建立靈敏的鉛含量檢測(cè)方法具有重要意義。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定食品中鉛的測(cè)定方法通常采用原子光譜法、高效液相色譜法和二硫腙比色法等[2]，但這些方法具有樣品用量大、預(yù)處理復(fù)雜、檢測(cè)慢、檢測(cè)價(jià)格高、穩(wěn)定性差及不能在線(xiàn)檢測(cè)等不足。熒光傳感器具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單和可在線(xiàn)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[3]，本課題組已開(kāi)發(fā)出卟啉類(lèi)鉛離子熒光探針[4]，但多是基于熒光熄滅，鮮有熒光增強(qiáng)的報(bào)道[5]。紅霉素A是一個(gè)含14元環(huán)內(nèi)酯的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，目前研究工作大多集中在合成、測(cè)定含量及其藥理功能方面[6]，還未有運(yùn)用紅霉素A作熒光探針的報(bào)道。本文將紅霉素A制成PVC敏感膜，研究了該敏感膜與鉛的反應(yīng)并制成了測(cè)定鉛的光化學(xué)傳感器。該傳感器用于黑茶粉末及其浸取液中鉛含量的測(cè)定，測(cè)得鉛的回收率為96.4%～108.5%。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

F-4600型熒光光度計(jì)（日本日立公司）、FC104電子天平（上海精密儀器有限公司）、PHS-3C精密pH計(jì)（江蘇江分電分析儀器有限公司）。

紅霉素A（標(biāo)準(zhǔn)品，歐洲進(jìn)口）、高密度聚四氟乙烯（PVC，湖南株洲）、鄰苯二甲酸二異辛酯（DIOP）、四氫呋喃（THF）和黑茶（大梅龍泉散茶，湖南城市學(xué)院黑茶研發(fā)科技有限公司）等。0.5 mol的Tris溶于1 000 mL水中，然后用0.5 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH制成緩沖溶液。

1.00 ×10-2mol·L-1Pb2+標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取高純鉛棒，刮去表面氧化層，削成小片狀，稱(chēng)取1.0360 g，置于150 mL燒杯中，加入50 mL 6 mol·L-1的HNO3溶解后，移入500 mL容量瓶中，配成1.00×10-2mol·L-1的儲(chǔ)備液，于棕色瓶中低溫保存，使用時(shí)用pH=8.0的Tris/HCl緩沖液稀釋配成不同濃度的Pb2+工作液。

實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水，其余試劑和溶劑均為分析純且無(wú)熒光，使用前未經(jīng)其他純化處理，使用時(shí)用pH=8.0的Tris/HCl緩沖液稀釋配成。實(shí)驗(yàn)溫度為（20±1）℃。

1.2 敏感膜制備

取50.0 mg PVC、100.0 mg DIOP和2.94 mg（2.0 μmol）的紅霉素A溶于2.0 mL新蒸THF中，配成制膜液。將直徑為35 mm的潔凈石英玻片放在自制的制膜裝置上，取0.2 mL制膜液旋轉(zhuǎn)制膜，制得1層厚度約4.0 μm的PVC膜[7]，放置1 min后即可使用，所制得的膜不用時(shí)置于陰處干燥保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將1片附有敏感膜的石英玻片和1塊大小相同深色PVC板裝入一自制流通測(cè)量池中[8]，連接蠕動(dòng)泵，再將測(cè)量池以特定位置固定于樣品室，選擇激發(fā)/發(fā)射狹縫寬度為5.0 nm/10 nm，最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為358 nm/409 nm，事先泵入pH=8.0的Tris/HCl緩沖溶液浸泡敏感膜，直至熒光強(qiáng)度穩(wěn)定不變，再注入樣品溶液測(cè)定敏感膜熒光強(qiáng)度。完成1次樣品測(cè)量后，泵入緩沖溶液沖洗敏感膜，直至熒光信號(hào)恢復(fù)到穩(wěn)定的最小值后再進(jìn)行另一樣品測(cè)定。

1.4 樣品制備

黑茶浸取樣液1#的制備：準(zhǔn)稱(chēng)黑茶樣品10.0 g（每個(gè)樣品平行稱(chēng)取5份）置于燒杯中，加入50 mL新煮的沸水，浸泡5 min后用傾瀉法濾出，濾液移至250 mL容量瓶中。再向燒杯中加入50 mL沸水，按上述同樣方法重復(fù)4次，濾液全移至250 mL容量瓶中，用水定容。

黑茶粉末樣液2#的制備：按國(guó)標(biāo)方法[2]進(jìn)行樣品處理。準(zhǔn)確稱(chēng)取已粉碎的黑茶樣品10.0 g（每個(gè)樣品平行稱(chēng)取5份）于250 mL凱氏定氮瓶中，加入15 mL硝酸，加熱，待作用緩和后冷卻，沿瓶壁加入5 mL硫酸，再加熱，緩緩加硝酸至有機(jī)質(zhì)完全分解。所得溶液為淺黃色，冷卻。加30 mL水煮沸，除去殘余硝酸至產(chǎn)生白煙為止。冷卻后的溶液移入250 mL容量瓶中。取與消化試樣相同量的硝酸和硫酸，按同樣方法做空白實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅霉素A對(duì)Pb2+識(shí)別的競(jìng)爭(zhēng)性實(shí)驗(yàn)

向含紅霉素A的敏感膜中分別加入濃度為1.00×10-2mol·L-1的各金屬離子的硝酸鹽后，測(cè)定其在409 nm處的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖1。從圖中可以看出，加入Pb2+后，敏感膜的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了3倍，而其他金屬離子的加入對(duì)敏感膜的熒光強(qiáng)度影響不大。同樣，加入含K+為1.00×10-2mol·L-1的NO3-、AC-鹽后，敏感膜的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，由此說(shuō)明紅霉素A敏感膜可作為潛在的Pb2+傳感器。

2.2 敏感膜對(duì)Pb2+的熒光響應(yīng)與測(cè)量原理

紅霉素A為大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，結(jié)構(gòu)中富含電子，具有弱的熒光，可以提供電子與Pb2+形成絡(luò)合物。圖2為敏感膜與不同濃度的Pb2+接觸后的熒光發(fā)射光譜。從圖中可以看出，隨著Pb2+濃度增加，敏感膜中紅霉素A的熒光強(qiáng)度增大，且峰形和峰位均無(wú)變化。由此可見(jiàn)，Pb2+與紅霉素A間的結(jié)合是非共價(jià)鍵結(jié)合[9]。

將紅霉素A固定于增塑的PVC膜中，Pb2+能分別從水相進(jìn)入膜相，并與膜相中的紅霉素A生成配合物，按照與文獻(xiàn)[10]相似的方法，則下式成立：

α為膜相中游離的紅霉素A濃度與其總濃度之比，同時(shí)α亦可用檢測(cè)到的熒光信號(hào)的熒光強(qiáng)度表示：

式（1）中cA、[Pb2+] 分別為紅霉素A在膜中的總濃度及Pb2+在水相中的總濃度，m、n為Pb2+與膜相中紅霉素A的絡(luò)合比，當(dāng)m、n一定時(shí)，溶液中待測(cè)[Pb2+]與α有確定的函數(shù)關(guān)系；式（2）中F0、Fs分別為敏感膜中紅霉素A全部以游離態(tài)存在和以配合物形式存在時(shí)的熒光強(qiáng)度。式（1）、（2）可作為本文研制熒光光化學(xué)傳感器測(cè)量Pb2+的定量依據(jù)。

圖2 PVC敏感膜與不同濃度的Pb2+溶液接觸后的熒光發(fā)射光譜（λex=358 nm）Fig. 2 Fluorescence emission spectra of sensitive PVC membrane contacted with different concentration of Pb2+(λex=358 nm)

根據(jù)式（1）擬合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到紅霉素A與不同濃度的Pb2+接觸的熒光響應(yīng)值α與的關(guān)系如圖3所示。由圖可知，當(dāng)配合比為m∶n=2∶1時(shí)，實(shí)驗(yàn)點(diǎn)能很好地與理論曲線(xiàn)擬合，所得平衡常數(shù)K=7.0×108，這也進(jìn)一步從實(shí)驗(yàn)證明Pb2+與紅霉素A之間的組成比為2∶1，此曲線(xiàn)（a）可作為測(cè)定Pb2+濃度的校準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1 敏感膜組成的選擇

敏感膜中紅霉素A的濃度影響敏感膜對(duì)Pb2+的熒光響應(yīng)。圖4為紅霉素A不同濃度的敏感膜對(duì)測(cè)定Pb2+的熒光響應(yīng)情況。設(shè)F0為敏感膜與空白緩沖溶液接觸時(shí)的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)為不同濃度的紅霉素A敏感膜作用于10.00 μmol·L-1的Pb2+溶液時(shí)的熒光強(qiáng)度。從圖中可知，當(dāng)敏感膜中紅霉素A濃度增加時(shí)，F(xiàn)/F0隨之增加。但當(dāng)紅霉素A濃度高于2.0 μmol·L-1時(shí)，其F/F0反而降低。故本實(shí)驗(yàn)中紅霉素A最佳濃度選擇為2.0 μmol·L-1，即1.92%。

2.3.2 pH的影響

因?yàn)榧t霉素在酸性和堿性條件下都容易發(fā)生降解[11]。紅霉素A在膜相溶液中存在游離分子態(tài)和離子態(tài)的解離平衡。當(dāng)pH＜7時(shí)，主要以離子態(tài)形式存在，隨著pH值升高，膜相溶液中主要以游離分子態(tài)形式存在。圖5表示pH對(duì)相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。從圖中可知，在pH 6.8～8.9范圍內(nèi)，相對(duì)熒光強(qiáng)度F/F0穩(wěn)定且較大，故可選用pH=8.0為最佳pH條件。

2.3.3 敏感膜響應(yīng)特性

圖3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合圖Fig. 3 Plots of lgc vsa fitted Eq. (1) exp. data line

圖4 紅霉素A用量的影響Fig. 4 The dosage effects of erythromycin A on fluorescence intensity

圖5 pH對(duì)配合物相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig. 5 Effects of pH on fluorescence intensity on complex

圖6為最佳敏感膜分別交替測(cè)定空白緩沖溶液、20.00 μmol·L-1Pb2+溶液和30.00 μmol·L-1Pb2+溶液的熒光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的變化關(guān)系圖。從圖中可以看出，當(dāng)Pb2+濃度為20.00 μmol·L-1時(shí)，熒光強(qiáng)度平均為1208.2±8.96（n=5）；當(dāng)Pb2+濃度為30.00 μmol·L-1時(shí)，為1876.9±7.39（n=5）；pH=8.0的Tris/HCl空白緩沖溶液的熒光強(qiáng)度平均為815.6±3.95（n=6），表明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性和可逆性。由圖中還可以看出，濃度由高到低或從低到高響應(yīng)時(shí)間t95（即熒光強(qiáng)度信號(hào)變化95%所需的時(shí)間）均小于50 s。

用最佳敏感膜測(cè)定濃度為20.00 μmol·L-1的Pb2+溶液，每30 min測(cè)定1次熒光強(qiáng)度，共進(jìn)行10 h，所測(cè)得平均熒光強(qiáng)度為1207.2±10.57（n=21）。該敏感膜不用時(shí)干放保存，15 d后測(cè)上述同一溶液，測(cè)得平均熒光強(qiáng)度為1201.3±11.22（n=21）。由此表明，該敏感膜在一定時(shí)間內(nèi)測(cè)試Pb2+溶液具有較好的穩(wěn)定性。

圖6 PVC敏感膜交替測(cè)定不同濃度Pb2+溶液的熒光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的響應(yīng)Fig. 6 The time course response of fluorescence intensity of PVC membrane to different concentration of Pb2+solutions

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、靈敏度和選擇性

圖3內(nèi)插圖即為傳感器定量測(cè)定Pb2+的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，其線(xiàn)性方程為：

α=－2.584lgc－0.694，r=0.9956

其中c為Pb2+的濃度，r為相關(guān)系數(shù)。根據(jù)0.05≤(1?α)≤0.95[12]，其測(cè)定Pb2+的動(dòng)力學(xué)范圍為4.00～6.00 mmol·L-1，根據(jù)3S0/K（S0為空白測(cè)定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差，K為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率），檢出限為0.10 μmol·L-1。

按1.3實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定10.00 μmol·L-1Pb2+中不加或加單個(gè)常見(jiàn)的共存離子實(shí)驗(yàn)，并以熒光強(qiáng)度變化的相對(duì)誤差±5%來(lái)評(píng)價(jià)對(duì)Pb2+測(cè)定的影響?？稍试S的共存物質(zhì)倍率為：Na+、K+、NH4+，1 000倍；Cd2+、Co2+、Cu2+、Mg2+、 Ba2+，500倍；Ni2+、Fe2+，100倍；Cr3+，10倍；Al3+，1.0倍；Fe3+、Mn7+、Cr6+，0.01倍。但在茶葉等食品中Mn7+和Cr6+濃度極小。如當(dāng)有大量Fe3+干擾時(shí)，可加入檸檬酸掩蔽Fe3+再進(jìn)行樣品測(cè)定。

3 樣品分析及回收率測(cè)定

按1.3實(shí)驗(yàn)方法取上述1.4樣品制備的樣品，用pH=8.0的Tris/HCl緩沖液稀釋配成后分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度并進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量，結(jié)果見(jiàn)表1。由表中可知，該方法與GB 5009.12—2010（AAS法）測(cè)定的結(jié)果無(wú)顯著差異，測(cè)得Pb2+的回收率為96.4%～108.5%。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果（n=5）Table 1 Determination results of the samples (n=5)

4 結(jié)論

紅霉素A是一類(lèi)抗生素，在醫(yī)用臨床領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，本研究用紅霉素A的微弱熒光作為熒光探針，在分析檢測(cè)中擴(kuò)展了它的應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)紅霉素A在PVC膜相中與Pb2+反應(yīng)，通過(guò)非共價(jià)鍵合作用生成2∶1的絡(luò)合物，該絡(luò)合物能顯著增強(qiáng)其熒光。據(jù)此，用以檢測(cè)溶液中Pb2+的含量，具有較高的靈敏度和良好的選擇性，同時(shí)，所制光傳感器還可以實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)檢測(cè)。黑茶因其原料與其他茶類(lèi)相比較粗老，故其鉛含量是產(chǎn)品生產(chǎn)檢測(cè)中的一個(gè)重要指標(biāo)。本方法樣品處理簡(jiǎn)單，為茶葉企業(yè)在茶葉加工生產(chǎn)中鉛的監(jiān)控提供了在線(xiàn)監(jiān)測(cè)的可能。

[1] 國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì). SN/T 2056—2008 進(jìn)出口茶葉中鉛、砷、鎘、銅、鐵含量的測(cè)定 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[S]. 2008.

[2] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB 5009. 12—2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中鉛含量的測(cè)定[S]. 2010.

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A Sensing PVC Membrane Based on Fluorescence Enhancement of Erythromycin A for Lead (Ⅱ) Detection in FU Tea

LONG Liping, MENG Wei, WANG Jiaoliang, XIE Dan, HE Guowen, XIAO Guqing
College of Chemistry & Environmental Engineering, Hunan City University, Yiyang 413049, China

An optical chemical sensing membrane based on reversible fluorescence enhancement of Erythromycin A immobilized in a plasticized poly (vinyl chloride) (PVC) membrane for Lead (Ⅱ) detection was developed. The membrane of the sensor consists of 50 mg of PVC, 100 mg of Di (2-ethylhexyl) phthalate and 2.94 mg of Erythromycin A. The maximum response of the sensing membrane to Lead (Ⅱ) was obtained in Tris/HCl buffer solution ( pH 8.0). Under optimal conditions, the proposed sensor responded linearly to Lead (Ⅱ) in the range of 4.00-6.00 mmol/L and had a detection limit of 0.10 μmol·L-1. The response time of the sensor was less than 50 s. In addition to the high reproducibility and reversibility of the fluorescence signal, the sensor also exhibited good selectivity. Except for Cr2O72-and MnO4-, it was not interfered by other common metal ions and anions. It was applied for the determination of Lead(Ⅱ) in a sample of FU Tea, which offered a satisfactory result.

optical chemical sensor, fluorescence enhancement, lead(Ⅱ), erythromycin A

TS272.5+4；P618.42

A

1000-369X(2017)03-273-07

2017-01-09

：2017-03-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21545003、21502048），湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2015JJ2023、13JJ3117），湖南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃資助項(xiàng)目（湘教通〔2014〕207號(hào)），湖南省黑茶金花重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（湘科規(guī)財(cái)〔2016〕8號(hào)）

龍立平，男，教授，主要從事光化學(xué)傳感器的研制與應(yīng)用研究，E-mail：llping401@163.com