巨噬細(xì)胞極化在白藜蘆醇抗大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用

宋 娟 李寶紅 郭雅玲 任廣宗 盧彥珍

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，山西 長(zhǎng)治 046000)

巨噬細(xì)胞極化在白藜蘆醇抗大鼠肝臟缺血再灌注損傷中的作用

宋 娟 李寶紅 郭雅玲1任廣宗1盧彥珍

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，山西 長(zhǎng)治 046000)

目的 探討巨噬細(xì)胞極化在白藜蘆醇(Res)抗肝臟缺血-再灌注損傷(HIRI)中的作用。方法 24只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、缺血-再灌注組(I/R組)、Res后處理組(Res組)，每組8只。建立急性HIRI模型，于再灌注6 h后收集動(dòng)物血液和肝臟標(biāo)本。檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(AKP)及炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β的濃度，采用Real-time PCR法檢測(cè)肝臟組織TNF-α及IL-10 mRNA的表達(dá)情況，采用流式細(xì)胞術(shù)分析肝臟M1、M2型巨噬細(xì)胞分布情況。結(jié)果 Res后處理可以降低肝臟功能學(xué)指標(biāo)ALT、AST、AKP的血清濃度；與I/R組比較，Res組IL-10和TGF-β含量升高，而IL-6和TNF-α含量降低，同時(shí)IL-10 mRNA表達(dá)量升高而TNF-α表達(dá)量下降；流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示Res后處理可以降低M1型巨噬細(xì)胞的比例，使巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化。結(jié)論 Res對(duì)HIRI的保護(hù)是通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮作用的。

白藜蘆醇；缺血-再灌注損傷；巨噬細(xì)胞極化；肝臟

肝臟缺血-再灌注損傷(HIRI)在臨床多見于肝臟移植、大面積肝葉切除、休克、循環(huán)衰竭等情況，發(fā)生過程中涉及多種復(fù)雜機(jī)制的相互作用，研究表明炎癥反應(yīng)是其中的重要因素之一〔1〕。肝臟巨噬細(xì)胞作為機(jī)體固有免疫反應(yīng)的重要組成部分，在免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用〔2〕。巨噬細(xì)胞激活后引起的過度炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是導(dǎo)致HIRI的重要原因之一〔3〕。白藜蘆醇(Res)是一種生物性很強(qiáng)的多酚類化合物，具有明顯的對(duì)抗炎癥反應(yīng)的作用〔4〕。已有實(shí)驗(yàn)證明，Res可以有效減輕肝臟、心臟、腦等部位的缺血-再灌注損傷〔5〕。Res是否通過影響巨噬細(xì)胞極化發(fā)揮抗HIRI的作用，目前不甚明了，本研究旨在探討Res對(duì)大鼠HIRI中巨噬細(xì)胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β試劑盒(北京群曉科苑生物技術(shù)有限公司)；Res(大賽璐藥物手性技術(shù)上海有限公司)；血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(AKP)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；引物合成(大連寶生物工程有限公司)；單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 動(dòng)物分組與模型建立 24只健康雄性SD大鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組(S組)、缺血-再灌注組(I/R組)、Res后處理組(Res組)，每組8只。動(dòng)物于術(shù)前12 h禁食，飲水自由，25%烏拉坦(4 ml/kg，腹腔注射)麻醉，取上腹部正中切口，建立70%肝缺血模型。S組僅做分離，充分暴露第一肝門，不做夾閉；I/R組阻斷第一肝門血流40 min后再灌注6 h；Res組在缺血40 min后經(jīng)舌靜脈注射Res 10 mg/kg，再灌注6 h，其余兩組給予同等用量的生理鹽水。6 h后處死動(dòng)物，留取血樣及組織標(biāo)本。

1.3 血清ALT、AST和AKP及炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β濃度測(cè)定 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，檢測(cè)ALT、AST、AKP及炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β的濃度。

1.4 肝臟組織中TNF-α、IL-10 mRNA表達(dá)量測(cè)定 采用實(shí)時(shí)定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)，取新鮮大鼠肝臟組織研磨后，Trizol試劑一步法提取總RNA，并進(jìn)一步測(cè)定樣本吸光度值以確定其純度及濃度。嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，方法參考文獻(xiàn)〔6〕，各樣本的mRNA含量以相應(yīng)樣本內(nèi)β-actin含量為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，目的基因mRNA表達(dá)水平采用相對(duì)定量法進(jìn)行計(jì)算，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCt計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。特異性引物：TNF-α：正義引物5'-GCCTGCTCTGATACACAAGATGGT-3'，反義引物5'-GAAGGCAGCGCTGCTAACG-3'；IL-10：正義引物5'-CTGCACGAGAGTGCGATCCAG-3'，反義引物5'-AGTGGTGTAGACAGCTCTGTTGG-3'；β-actin：正義引物5'-AGAGGCAAGTCCTGCGTGAC-3'；反義引物5'-CAATACTGATGACGTGCGCGT-3'。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝組織中M1、M2細(xì)胞比例 肝臟組織塊剪碎后經(jīng)尼龍網(wǎng)輕搓制成細(xì)胞懸液，經(jīng)洗滌、離心去上清后，重懸于30%Percoll中(PBS稀釋)，下層為70%Percoll，密度梯度離心，400 r/min，22 min，取交界層細(xì)胞分別用F4/80-APC和CD86-FITC標(biāo)記M1型細(xì)胞，以F4/80-APC和CD206-PE標(biāo)記M2型細(xì)胞，嚴(yán)格按照流式細(xì)胞儀操作程序上機(jī)檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清ALT、AST、AKP水平比較 與S組相比，I/R組血清ALT、AST、AKP水平明顯升高(P<0.01)；與I/R組相比，Res組血清ALT、AST、AKP明顯降低(P<0.01)。見表1。

2.2 Res對(duì)血清IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β分泌水平的影響 與S組相比，I/R組血清中促炎因子IL-6、TNF-α水平明顯增高，同時(shí)抗炎因子IL-10、TGF-β水平降低(P<0.01)；經(jīng)過Res后處理，Res組IL-6、TNF-α濃度較I/R組降低，同時(shí)IL-10、TGF-β濃度增高(P<0.01)。見表2。

表1 Res對(duì)大鼠HIRI后血清ALT、AST、AKP活性的影響

與S組比較：1)P<0.01；與I/R組比較：2)P<0.01

表2 Res后處理對(duì)血清IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β水平的影響

與S組比較：1)P<0.01,2)P<0.05；與I/R組比較：3)P<0.01

2.3 Res對(duì)大鼠肝臟組織中TNF-α、IL-10 mRNA表達(dá)情況的影響 與S組〔分別為(1.17±0.08)、(0.87±0.12)〕比較，I/R組肝組織中TNF-α(3.38±0.11)和IL-10 mRNA(1.62±0.21)的表達(dá)均增加(P<0.05)。而Res組與I/R組相比，TNF-α的mRNA表達(dá)減少(1.95±0.17，P<0.05)，IL-10 mRNA的表達(dá)增加(3.76±0.15，P<0.01)。

2.4 Res對(duì)HIRI中M1、M2型巨噬細(xì)胞分布情況的影響 與S組相比，I/R組M1型巨噬細(xì)胞相對(duì)含量增高，M2型相對(duì)含量下降(P<0.05)；而Res組與I/R組相比，M1型巨噬細(xì)胞相對(duì)含量明顯降低，而M2型增多(P<0.05)。見表3。

表3 Res對(duì)M1和M2型巨噬細(xì)胞在肝臟分布情況的影響

與S組比較：1)P<0.05；與I/R組比較：2)P<0.05

3 討 論

HIRI是指肝組織發(fā)生一段時(shí)間的缺血后恢復(fù)血液灌注，組織損傷非但沒有減輕反而加重的一種病理過程，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，有多種因素在損傷過程中相互作用，其中的一個(gè)關(guān)鍵性因素即大量炎癥因子的參與，缺血造成組織明顯缺氧，使細(xì)胞當(dāng)中ATP的生成量明顯減少，并進(jìn)而引發(fā)炎癥反應(yīng)，后期恢復(fù)血液灌流后，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加劇，導(dǎo)致組織損傷進(jìn)行性加重，因此削弱或抑制炎癥反應(yīng)是減輕HIRI的有效治療方法之一。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，具有分泌多種炎癥因子的功能，而肝臟作為機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞存量最多的臟器，在缺血-再灌注損傷發(fā)生早期即有大量巨噬細(xì)胞被激活，引發(fā)炎癥反應(yīng)，且在再灌注后情況加劇，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞大量壞死，肝功能障礙〔7〕。由于微環(huán)境中刺激因素的不同，可使巨噬細(xì)胞發(fā)生差異性的活化，稱為巨噬細(xì)胞的極化。極化后的巨噬細(xì)胞基本可分為兩種類型，M1型和M2型，分別以CD86+和CD206+等為表面標(biāo)志物。M1型分泌大量促炎因子如IL-6和TNF-α等，M2型則高表達(dá)IL-10和TGF-β等抗炎因子〔8，9〕；其中IL-10具有明顯有效的抑制促炎因子產(chǎn)生、對(duì)抗炎癥反應(yīng)的作用〔10〕。本實(shí)驗(yàn)表明說明缺血40 min再灌注6 h使肝臟功能明顯受損，而Res后處理能有效減輕肝臟的再灌注損傷。缺血-再灌注過程中M1型巨噬細(xì)胞極化增加，分泌促炎因子增多；而Res可以抑制M1型巨噬細(xì)胞的極化，同時(shí)促進(jìn)M1型向M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使促炎因子表達(dá)減少，抗炎因子表達(dá)增加。而且HIRI大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯，與ALT、AST、AKP變化趨勢(shì)相同。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)進(jìn)一步證明缺血40 min再灌注6 h誘發(fā)動(dòng)物肝臟發(fā)產(chǎn)生了明顯的炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化。

Res是一種易于獲得的天然植物雌激素，具有減輕炎癥、對(duì)抗氧化、抑制腫瘤生長(zhǎng)、抑制血小板黏附、聚集等多種功能，是具有明顯生物活性的植物抗毒素。研究表明，Res能有效緩解或減輕多個(gè)臟器、組織在缺血-再灌注過程中受到的損傷〔11〕，并且可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型分化發(fā)揮抗感染作用〔12〕。本實(shí)驗(yàn)說明Res在一定程度上減輕了肝臟組織受到的損傷，發(fā)揮了在缺血-再灌注過程中保護(hù)肝臟的作用。

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〔2016-12-15修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

山西省2013年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練資助項(xiàng)目(2013083)；長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院2016年校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(D2016001)；長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院科技啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(No.QDZ201520)

盧彥珍(1957-)，女，教授，主要從事缺血再灌注損傷及炎癥機(jī)制研究。

宋 娟(1980-)，女，講師，碩士，主要從事缺血再灌注損傷及炎癥機(jī)制研究。

R363

A

1005-9202(2017)10-2372-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.011

1 長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院2011級(jí)教改班