大蒜素對糖尿病腎病大鼠GLUT1/PKC途徑的調(diào)控作用

欒海艷 韓玉澤 關(guān) 政 葉之慧 張雪松 楊利敏

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

大蒜素對糖尿病腎病大鼠GLUT1/PKC途徑的調(diào)控作用

欒海艷 韓玉澤 關(guān) 政 葉之慧1張雪松2楊利敏3

(佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 探討大蒜素對糖尿病腎病(DN)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)1/PKC途徑是否具有調(diào)控作用。方法 采用高脂高糖飲食加尾靜脈注射 STZ建造DN模型，所有大鼠分為正常對照組、糖尿病(DM)對照組、大蒜素低、中、高劑量組。實驗結(jié)束后檢測大鼠空腹血糖(FPG)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、24 h尿白蛋白(UAE)和腎組織中 CollagenⅠ、GLUT1、PKC的表達(dá)。結(jié)果 與正常對照組相比，DM對照組FPG、BUN、Scr、UAE、CollagenⅠ、GLUT1水平和 PKC的表達(dá)均顯著增高(P<0.01)，而大蒜素的中、低劑量組 BUN、Scr、UAE和 GLUT1均顯著降低(P<0.01)，高劑量組的 Scr已達(dá)正常水平(P>0.05)；高劑量組 CollagenⅠ的表達(dá)顯著降低(P<0.01)；低、中、高劑量組 PKC的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，且具有劑量依賴性。結(jié)論 大蒜素可能通過 GLUT1/PKC途徑來減緩和抑制DN的發(fā)生和發(fā)展。

大蒜素；糖尿病腎病；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)1；PKC

糖尿病腎病(DN)是臨床最常見、也是最嚴(yán)重的糖尿病(DM)慢性并發(fā)癥之一，并且是終末期腎病(ESRD)的最主要致病原因，也是導(dǎo)致DM患者最主要的死亡原因之一。本文主要研究不同劑量大蒜素對DN腎組織中 CollagenⅠ、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLUT)1和 PKC表達(dá)的影響，以期證實大蒜素對DN具有調(diào)控的作用及此作用是否通過 GLUT1/PKC途徑實現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 對象及分組 選取60只純系 Wistar大鼠(全部購于佳木斯大學(xué)實驗動物中心)，體重180～220 g，雌雄不拘。預(yù)飼養(yǎng)所有大鼠1 w后，將其隨機(jī)分為兩組：10只作為正常對照組，給予正常飲食喂養(yǎng)；另外50只給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)4 w后禁食16 h，尾靜脈一次性注射2%鏈脲佐菌素(STZ)25 mg/kg，再繼續(xù)給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)4 w，然后測定所有造模大鼠的空腹血糖(FPG)和尿糖，以FPG≥16.8 mmol/L、尿糖(～)為判定DN大鼠模型是否成功的標(biāo)準(zhǔn)。再將造模成功大鼠分為DM對照組、大蒜素高、中、低劑量組，每組10只，繼續(xù)給予高脂高糖飲食至實驗結(jié)束。正常對照組仍繼續(xù)給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。

1.2 給藥方案 從第9周起大蒜素低、中、高劑量組分別給予大蒜素注射液腹腔注射20、40、60 mg·kg-1·d-1；正常對照組和DM對照組同時給予等量生理鹽水腹腔注射，整個藥物干預(yù)持續(xù)時間為12 w。

1.3 留取標(biāo)本及檢測指標(biāo) 實驗結(jié)束后，用生物代謝籠收集所有大鼠24 h尿液；乙醚麻醉后，內(nèi)眥靜脈取血；大鼠處死后，取雙腎置于-80℃冰箱保存。采用全自動生化儀檢測大鼠的FPG、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)和24 h尿白蛋白排泄率(UAE)等生化指標(biāo)；Western印跡技術(shù)檢測腎組織中CollagenⅠ、GLUT1、PKC的蛋白表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參，用quantity one軟件進(jìn)行條帶光密度值分析，所有結(jié)果均為目的蛋白與β-actin光密度分值的比值。

1.4 試劑 大蒜素注射液(江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司，5 ml∶60 mg，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H32025639)；STZ(Sigma公司)；FPG、Scr、BUN和尿蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所)；CollagenⅠ、GLUT1、PKC和 β-actin抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠生化指標(biāo)比較 與正常對照組相比，DM對照組FPG水平顯著增加(P<0.01)，給予大蒜素后，F(xiàn)PG隨著藥物劑量的增加有所下降，但均未達(dá)正常水平(P<0.01)。與正常對照組相比，DM對照組BUN、Scr和UAE水平均顯著增高(P<0.01)，給予大蒜素后，均隨著藥物劑量的增加而降低，且中、高劑量組BUN、Scr和UAE水平均顯著降低(P<0.01)，其中高劑量組Scr更是已達(dá)到正常水平(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠腎臟CollagenⅠ、GLUT1和PKC蛋白表達(dá)比較 與正常對照組相比，DM對照組腎組織中的CollagenⅠ、GLUT1和PKC的表達(dá)均顯著升高(均P<0.01)，給予大蒜素后，3種蛋白的表達(dá)量均隨著藥物劑量的增加而降低，其中大蒜素高劑量組的CollagenⅠ的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，大蒜素中、高劑量組的GLUT1的蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.01)，低、中、高劑量組的PKC的蛋白表達(dá)也顯著降低(P<0.01)，見表2，圖1。

表1 各組大鼠生化指標(biāo)比較

與DM對照組比較:1)P<0.01；與正常對照組比較:2)P<0.01；下表同

表2 各組腎組織中CollagenⅠ、GLUT1和PKC的表達(dá)

1：正常對照組，2：DM對照組，3：大蒜素低劑量組，4：大蒜素中劑量組，5：大蒜素高劑量組圖1 各組大鼠腎臟Collagen Ⅰ、GLUT1和PKC蛋白的表達(dá)

3 討 論

作為大蒜的主要生物活性成分，大蒜素是一種揮發(fā)性油狀物，由大蒜的球形鱗莖提取而得?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大蒜素有多種生物學(xué)活性和功能，如抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降血脂、提高機(jī)體免疫力等〔1～4〕。近年來研究表明，大蒜素具有抑制成纖維細(xì)胞的增殖，抑制促纖維化因子的分泌及減少細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成作用。另有文獻(xiàn)〔5〕報道，大蒜素能夠抑制和改善由高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化和凋亡的作用，但其調(diào)控機(jī)制目前尚不完全明了。

GLUT1在生物體內(nèi)分布范圍十分廣泛，在胚胎和成年的組織細(xì)胞中均有表達(dá)和分布，能維持組織細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下對葡萄糖的攝入。GLUT1在腎組織中，主要分布在腎小球至腎小管的各個部位，其功能狀態(tài)的正常與否與DM細(xì)胞內(nèi)的糖代謝紊亂及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)強度也與腎臟病變程度相關(guān)，呈局灶節(jié)段性增強〔5〕，是決定DM時腎臟是否被累及的重要因素之一。采用糖攝入動力學(xué)、Northern雜交、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)等測定方法也已證實GLUT1是腎小球系膜細(xì)胞攝取葡萄糖的主要轉(zhuǎn)運蛋白，其表達(dá)量會隨著細(xì)胞外糖濃度升高而增加，其功能狀態(tài)是腎小球系膜細(xì)胞葡萄糖攝取的關(guān)鍵〔6〕。即使將經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染后的腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)在正常的糖濃度培養(yǎng)液中，系膜細(xì)胞仍然出現(xiàn)了肥大、細(xì)胞內(nèi)糖代謝的增加及ECM合成增多等一系列病理性變化，這說明DM腎小球硬化以及腎小球系膜細(xì)胞合成過多ECM的進(jìn)展是由于GLUT1的活性或表達(dá)增多引起葡萄糖攝取增多所致，從而提示GLUT1是DN發(fā)病因素中獨立于高血糖外的重要危險因素。此外，在高糖狀態(tài)或GLUT1表達(dá)增多時，二酯酰甘油(DAG)的產(chǎn)生也隨之增多，進(jìn)而激活其下游的PKC〔7〕，使其表達(dá)也增多；而PKC又可通過增加c-fos和c-jun的表達(dá)來進(jìn)一步激活活性蛋白(AP)-1的轉(zhuǎn)錄〔8〕，進(jìn)而增加層黏蛋白和纖連蛋白的產(chǎn)物導(dǎo)致腎組織中ECM的堆積。本研究結(jié)果說明大蒜素可能通過GLUT1/PKC途徑來減緩和抑制DN的發(fā)生和發(fā)展，且這種作用具有劑量依賴性，隨著大蒜素濃度的增高而加強。

1 張海嘯，史載祥，賈海忠，等.大蒜素對NIH3T3細(xì)胞增殖及膠原合成的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007;27(5)：431-4.

2 張海嘯，賈海忠，李 格，等.大蒜素對壓力負(fù)荷大鼠心肌纖維化的影響〔J〕.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2008;14(2)：149-51.

3 張殿新，任雨笙，劉 兵，等.大蒜素對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用〔J〕.中華心血管雜志，2005;15(s1)：2136-8.

4 朱蘭香，陳衛(wèi)昌，劉世增，等.大蒜素對實驗性大鼠肝纖維化的作用研究〔J〕.中華消化雜志，2003;7(23)：441-3.

5 劉志紅，張婷婷.腎組織中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白與糖尿病腎病的關(guān)系〔J〕.腎臟病與透析腎移植雜志，1999;8(3)：206-9.

6 Heilig CW，Liu Y，England RL，etal.D-glucose stimulates mesangial cell GLUT1 expression and basal and IGF-I-sensitive glucose uptake in rat mesangial cells：implications for diabetic nephropathy〔J〕.Diabetes，1997;46(6)：1030-9.

7 Ayo SH，Radnik R，Garoni JA，etal.High glucose increases diacylglycerol mass and activates protein kinase C in mesangial cell cultures〔J〕.Am J Physiol，1991;261(4 Pt 2)：F571-7.

8 Studer RK，Craven PA，DeRubertis FR.Role for protein kinase C in the mediation of increased fibronectin accumulation by mesangial cells grown in high-glucose medium〔J〕.Diabetes，1993;42(1)：118-26.

〔2016-12-09修回〕

(編輯 滕欣航)

國家自然科學(xué)基金項目(31571087,31200839)；黑龍江省教育廳項目(12541823)；佳木斯大學(xué)青年基金項目(Sq2013-018)

楊利敏(1973-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)生理及神經(jīng)內(nèi)分泌研究。

欒海艷(1979-)，女，博士，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥機(jī)制的研究。

R692.6

A

1005-9202(2017)10-2347-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.003

1 佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院 2 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院

3 大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院