經微導管大腦中動脈血栓栓塞制備猴局灶性腦缺血模型＊

桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院放射科(廣西 桂林 541001)

鄧燕賢 周智鵬 邱維加徐軍紅 張輝陽 廖國宇曾陽東 成 戈

經微導管大腦中動脈血栓栓塞制備猴局灶性腦缺血模型＊

桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院放射科(廣西 桂林 541001)

鄧燕賢 周智鵬 邱維加徐軍紅 張輝陽 廖國宇曾陽東 成 戈

目的 研究介入微導管插管法制備猴局灶性腦缺血模型技術以及影像學表現(xiàn)。方法 雄性廣西獼猴10只，將1.7F微導管插管至大腦中動脈M1段注入自體血栓20cm(直徑1mm)，大腦中動脈正側位造影確認栓塞成功，栓塞后2小時MRI擴散加權序列掃描再次確認腦梗死，并計算ADC值。栓塞后24小時，MRI掃描結束后處死動物取腦組織行H E染色觀察病理改變。結果 動物大腦中動脈栓塞后收縮壓較栓塞前升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。10只動物大腦中動脈共插管12次，其中兩只動物頸內動脈迂曲插管不成功，將導管換至對側大腦中動脈插管成功，動物插管成功率為100%(10/10)，血管插管成功率為83.3%(10/12)。麻醉和手術期間動物死亡率為0，術后24小時以內死亡1只，死亡率10%(1/10)。栓塞后2小時以及24小時病灶ADC值降低，核心區(qū)ADC值降低較邊緣區(qū)明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，對側大腦正常區(qū)ADC值在栓塞前后差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，栓塞后2小時病灶在DWI圖像上信號升高，24小時明顯升高。24小時后腦組織HE染色顯示腦梗死灶邊界清楚，梗死灶內腦組織液化、壞死，高倍鏡下顯示細胞壞死如篩網狀，細胞核碎裂和溶解。結論 介入微導管超選擇插管技術能制備穩(wěn)定的猴局灶性腦缺血模型。

介入；微導管；腦缺血模型

缺血性腦卒中嚴重威脅著人類的健康，具有高發(fā)生率、高死亡率、高致殘率的特點，正逐步成為人類疾病死亡中的首要因素。由于神經細胞對缺血和缺氧耐受性差，腦缺血后的治療一直是臨床很棘手的問題，治療的原則是盡早恢復血供，使腦組織得到糖和氧等營養(yǎng)物質，減少缺血再灌注損傷和凋亡的發(fā)生[1]。腦缺血模型的建立有利于腦缺血疾病的研究和相關治療藥物的開發(fā)，本文選擇廣西獼猴作為實驗對象，經微導管插管到大腦中動脈，注射猴自體血栓栓塞大腦中動脈分支制備腦缺血模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物雄性廣西獼猴10只(桂林永福動物實驗養(yǎng)殖基地)，體重6～8公斤，年齡4～8歲。術前24小時禁食，適量食水。復合麻醉劑(氯胺酮1ml+安定1ml+東莨菪堿1ml)肌肉注射，術前CT平掃，排除顱內病變。

1.2 自體血栓制備取自身靜脈血5ml，肝素抗凝，高速離心取上層血清加入血漿凝固酶，注入內徑為1mm的硬膜外麻醉管(河南新鄉(xiāng)市駝人醫(yī)療器械公司)，制成自體血栓。

1.3 大腦中動脈插管心電、呼吸和血壓監(jiān)護下，微量泵靜脈注射異丙酚維持動物麻醉狀態(tài)。在GE Innova 3100血管造影機上，猴右側腹股溝區(qū)常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，切開皮膚，暴露股動脈，股動脈穿刺置入4F導管鞘，經導管鞘引入4F多功能導管，超選擇至頸內動脈起始部，行腦血管正側位造影，對比劑總量2.5ml，速度1ml/s。經4F導管引入1.7F微導管，在0.014inch神經微導絲引導下插管至大腦中動脈M1段，行大腦中動脈正側位造影，總量1.8ml，速度0.6ml/ s(所有導絲、導管均為美國強生Cordis公司產品)。

1.4 大腦中動脈部分栓塞自微導管注入制備好的血栓20cm，再次行大腦中動脈正側位造影確認栓塞成功。

1.5 MRI西門子公司Verio 3.0T MRI，栓塞后2小時MRI 和DWI序列軸位掃描掃描確認栓塞表現(xiàn)，并根據DWI(b=0，b=1000)計算ADC值，MRI掃描參數(shù)見表1。

1.6 病理檢查栓塞后24小時，MRI掃描結束后處死動物取腦組織行常規(guī)HE染色觀察病理改變。

1.7 統(tǒng)計學方法所有數(shù)據利用SPSS 18軟件包對數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。兩兩比較的數(shù)據符合方差齊性檢驗，均采用t檢驗，三組比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學差異，P＞0.05為差異無統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 栓塞前、后生理指標監(jiān)測栓塞前后監(jiān)測血壓、心率、體溫和動脈血氣分析。栓塞后動物的收縮壓較栓塞前高，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.2 大腦中動脈栓塞栓塞前、后DSA顯示大腦中動脈部分分支栓塞，栓塞后大腦中動脈血流減慢，對比劑反流至眼動脈致其顯影，見圖1-4。

2.3 大腦中動脈插管成功率和手術死亡率10只動物大腦中動脈共插管12次，其中兩只動物頸內動脈迂曲插管不成功，將導管換至對側大腦中動脈插管成功，動物插管成功率為100%(10/10)，血管插管成功率為83.3%(10/12)。麻醉和手術期間動物死亡率為0，術后24小時以內死亡一只，死亡率10%(1/10)。

2.4 栓塞前后ADC值變化栓塞后2小時以及24小時病灶ADC值明顯降低，核心區(qū)ADC值降低較邊緣區(qū)更加明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，對側大腦正常區(qū)ADC值在栓塞前后差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，栓塞后2小時病灶在DWI圖像上信號升高，24小時明顯升高，見表3，圖5-10。

2.5 24小時后腦組織病理改變見圖11-13。

3 討 論

3.1 猴腦缺血模型的制備常見的大腦中動脈缺血模型建立方法有：動脈結扎、靜脈損傷、經頸動脈異物栓塞以及血栓栓塞等[2-6]。但是大多數(shù)的研究都是采用嚼齒類動物模型，和人體之間存在著較大的差異，而且嚼齒類動物個體較小，生存能力和人不同，因此，雖然很多治療藥物和方法在基于嚼齒類動物的腦缺血實驗中有效，但是很難進一步在臨床應用。本研究采用和人類親緣關系較近的獼猴作為實驗動物，由于猴的體重和腦體積都較大，通過不同栓塞部位和劑量的控制，可以成功復制腦缺血模型。我們的課題小組從2007年以來，陸續(xù)報道了猴腦缺血模型的制備及相關研究[7-10]，本研究的報道是在綜合以往猴腦缺血模型制備經驗上的進一步改進和深化研究。

3.2 插管技術、成功率和動物死亡率分析股動脈穿刺置入導管鞘是介入手術的第一步，也是大腦中動脈插管手術成功必要前提。人的股動脈穿刺并發(fā)癥發(fā)生率約為2%～10%[11-12]。猴的股動脈比較細小，猴腹股溝區(qū)皮膚與人相比，相對堅韌而厚，猴股動脈在體表往往不易觸及，以前的研究中，首次穿刺的失敗率較高，并且一旦穿刺失敗損傷了血管，再次穿刺成功率幾乎為零。為了保證插管成功率，本研究采用了切開分離股動脈周圍組織，暴露股動脈，直視下穿刺股動脈的技術，股動脈穿刺成功率達到100%。猴的頸內動脈迂曲，尤其是頸內動脈顱骨段，迂曲程度遠遠超過人的頸內動脈，插管過程中將4F導管盡量插到頸內動脈的遠端，為微導管提供更好的支撐。采用1.7F微導管，采用合適的導絲、導管技術，均能插管至大腦中動脈M1段，插管過程中動作盡量輕柔，減少對血管的刺激和損傷，本研究兩支血管插管不成功的原因都是頸內動脈和大腦中動脈起始段血管痙攣，導致導絲和導管無法進入，為避免人為損傷影響實驗結果，重新進行對側大腦中動脈插管成功。由于我們小組不斷改進麻醉和插管技術，本研究動物麻醉和手術死亡率為零，有1例在術后24小時死亡，分析其主要原因是栓塞范圍過大所致。栓塞后動物收縮壓明顯增高，和文獻的報道一致，舒張壓、二氧化碳分壓有所升高，氧分壓下降，但是差異無統(tǒng)計學意義，可能和本組實驗動物數(shù)量較少有關。

表1 MRI掃描參數(shù)

表2 生理指標監(jiān)測

表3 栓塞前后ADC值（×10-4mm2/s）變化

圖1、3 栓塞前大腦中動脈側位和正位造影，各分支顯示清楚，血流狀況良好。圖2、4 栓塞后大腦中動脈側位和正位造影，顯示大腦中動脈部分栓塞，分支減少，未栓塞分支顯影淺淡，細小分支顯示不全，可見對比劑反流使眼動脈顯影。圖5 栓塞前DWI；圖6 栓塞后2hDWI，右側顳葉區(qū)可見稍高信號缺血灶（箭頭）；圖7 栓塞后24hDWI，右側顳葉區(qū)缺血灶范圍擴大，信號進一步增高（箭頭）；圖8 栓塞前ADC圖；圖9 栓塞后2h ADC圖，右側顳葉區(qū)可見稍低信號缺血灶（箭頭）；圖10 栓塞后24h ADC圖，右側顳葉區(qū)缺血范圍擴大，信號進一步降低（箭頭）。HE染色：腦實質內見梗死區(qū)邊界清楚(圖11 HEX100)。梗死灶內腦組織液化、壞死(圖12 HEX200)。高倍鏡下顯示梗死區(qū)細胞壞死如篩網狀，細胞核碎裂和溶解(圖13 HEX400)。

3.3 腦缺血范圍和梗死體積的影像學監(jiān)測術后監(jiān)測采用MRI擴散加權成像(Diffusion Weighted Imaging，DWI)監(jiān)測，同時測量表觀彌散系數(shù)(ApparentDiffusion Coefficient, ADC)的值進行對比。DWI 是活體測量水分子運動的有效手段，水分子在活體內的擴散與組織的空間結構以及周圍大分子物質的分布有關。急性缺血后，腦組織內的神經元細胞在缺血后數(shù)分鐘開始，鈉-鉀離子泵失活，使得細胞外水分子向細胞內滲透，導致細胞內水分子增多，發(fā)生細胞毒性水腫；此時缺血區(qū)組織內水分子擴散受阻，導致DWI信號增高，ADC值下降[13-15]。隨著缺血時間延長，血管內皮細胞受損導致毛細血管通透性增加，缺血組織出現(xiàn)血管源性水腫，此時T2WI信號逐漸增高，因此DWI對腦梗死的檢出早于常規(guī)MR序列。本研究結果顯示，所有的動物在栓塞后2小時，均能在DWI圖像上顯示梗死灶，相應區(qū)域ADC值降低，栓塞后24小時，梗死灶進一步擴大，顯示更清楚，2小時和24小時ADC值之間差異有統(tǒng)計學意義，表明腦缺血后缺血區(qū)腦組織水分子擴散進一步受限。DWI可以作為猴腦缺血模型監(jiān)測的首選影像學檢查。術后24小時病理染色進一步明確梗死灶的存在，可以觀察和研究梗死區(qū)的病理改變，并且進一步驗證DWI診斷的結果。

靈長類動物猴在直立行走、行為、運動、感覺以及腦血管的解剖結構和功能等方面與人類非常的相似，基于靈長類動物的藥物實驗研究有其他低等動物無法比擬的優(yōu)勢。利用介入插管的方法減少了手術損傷，猴自體血栓栓塞更接近臨床血栓栓塞性腦梗塞的發(fā)病原因，術后利用腦血管造影和核磁共振掃描監(jiān)測腦梗死后的血流情況、梗死范圍以及治療后的轉歸，使得該動物模型非常接近于臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展和診療過程。本研究的結果將進一步完善猴腦缺血模型的藥物治療實驗方法，為臨床腦缺血治療提供了更多的基礎研究證據。

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(本文編輯: 汪兵)

Application of Interventional Microcatheter in Monkey Middle Cerebral Artery Embolism Model*

DENG Yan-xian, ZHOU Zhi-peng, QIU Wei-jia, et al．, Department of Radiology, Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541001, Guangxi Province, China

Objective To study the application of interventional micro-catheter intubation for the preparation of monkey focal cerebral ischemia model． Methods Ten male Monkeys were anesthetized, the 1．7F micro-catheter were intubated into the middle cerebral artery． Twenty cm (1 mm diameter) autologous thrombus was injected into the middle cerebral artery (MCA)． The embolization was confirmed by digital subtraction angiography (DSA)． Diffusion Weighted sequence were performed to confirm the occurrence of cerebral infarction, and calculate the ADC value． The brain tissues were examined by routine HE staining after 24 hours of the embolization,． Results After monkey MCA occlusion, the systolic blood was higher (P＜0．05)． 10 animals were intubated 12 times, the success rate of the intubation in monkey was 100% (10/10)．The success rate of intubation in artery was 83．3% (10/12)． The mortality rate during the anesthesia and surgery was 0%． One monkey died in 24 hours, the mortality rate in 24 hours was 10% (1/10)． ADC values were significantly lower at 2 hours and 24 hours after embolization (P＜0．05)． ADC values in contralateral normal brain regions were not significantly different between before and after embolization (P＞0．05)． 24 hours after embolization, the signal intensity of the lesion was increased on the DWI imaging． The brain tissue HE staining showed infarct area of brain parenchyma clear boundary, the brain tissue in the infarct liquefaction, necrosis． High-power microscope showed infarction cell necrosis, such as mesh-like, nuclear fragmentation and dissolution． Conclusion The technique of micro-catheter super selective intubation can be used to prepare a stable monkey model of focal cerebral ischemia．

Interventional Radiology; Micro-catheter; Cerebral Ischemia Model; Monkey

R743.31

A

國家自然科學基金(編號：81160147)

10.3969/j.issn.1672-5131.2017.06.001

周智鵬

2017-05-09