苧麻根際土壤水浸提液化感潛力評價

劉楠楠，白玉超，李雪玲，楊瑞芳，郭婷,2，崔國賢,3*

苧麻根際土壤水浸提液化感潛力評價

劉楠楠1，白玉超1，李雪玲1，楊瑞芳1，郭婷1,2，崔國賢1,3*

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)苧麻研究所，湖南長沙 410128；2 湖南省桂陽縣煙草專賣局，湖南桂陽 424000 ；3 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南長沙 410205）

【目的】通過苧麻根際土壤水浸提液有機化合物的分離鑒定及生物學(xué)實驗，探討了苧麻敗蔸與化感作用的關(guān)系?！痉椒ā窟\用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) (GC-MS)，對苧麻根際土壤的不同極性有機溶劑萃取液進行了物質(zhì)成分分析；采用室內(nèi)生物測定方法，研究了不同濃度苧麻根際土壤水浸提液對蘿卜、油菜、擬南芥 3 種植物的化感效應(yīng)；并應(yīng)用實時定量 PCR 技術(shù) (QPCR)，測定了不同濃度根際土壤水浸液處理后擬南芥其抗逆基因RD29A (AT5G52310) 和 RD29B (AT5G52300) 及生長素合成相關(guān)基因 YUC1 (AT4G32540) 的相對表達水平?！窘Y(jié)果】四種不同極性有機溶劑萃取液經(jīng) GC-MS 檢測共鑒定出 51 種有機化學(xué)物質(zhì)，包括烴類及其衍生物、甾類化合物、苯甲酸及其衍生物、酚類、萜類、含氮類等已被報道具有化感活性的化合物。不同濃度苧麻根際土壤水浸液對 3 種不同植物的下胚軸長及根長的化感效應(yīng)具有差異性，隨著浸提液濃度增加，對油菜及擬南芥抑制作用越顯著，但對蘿卜的影響不顯著。QPCR 檢測結(jié)果表明，擬南芥的 RD29A、RD29B、YUC1 這 3 種基因的表達量隨水浸提液濃度增加均降低?！窘Y(jié)論】苧麻根際土壤中含有抑制自身生長的潛在化感物質(zhì)豆甾-4-烯-3,6-二酮，2,5-二叔丁基苯酚，鄰苯二甲酸二乙酯，6,6-二甲基-1,3-庚二烯-5-醇，羊毛甾-8,24-二烯-3,22-二醇。高濃度苧麻根際土壤水浸提液對供試三種植物下胚軸長及根長具有抑制效果，因此，連作導(dǎo)致的化感物質(zhì)累積可能是連作導(dǎo)致苧麻敗蔸的原因之一。

苧麻；根際土壤水浸提液；化感作用；基因表達；化感物質(zhì)；敗蔸

苧麻 (Boehmeria nivea) 為蕁麻科 (Urticaceae) 苧麻屬 (Boehmeria)，多年生宿根性旱地草本植物，是我國重要的纖維作物和特色經(jīng)濟作物[1]。一般情況下，苧麻麻蔸能夠自我更新，可以宿根種植 10～20 年，然而在目前栽培管理措施下，苧麻連續(xù)種植3～5 年，出現(xiàn)了爛蔸或者缺蔸現(xiàn)象，導(dǎo)致苧麻產(chǎn)量和品質(zhì)均下降，嚴(yán)重的甚至引起全株死亡[2–3]。苧麻在長期多年的生長發(fā)育中經(jīng)常會受到連作栽培的影響[4]，研究表明連作栽培極易產(chǎn)生化感自毒作用，而化感現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于土壤內(nèi)部化感物質(zhì)常年累加引起[5]。朱四元等[6–7]研究也認為，苧麻宿根生長障礙主要是由連作多年土壤中毒引起的。

植物能夠分泌豐富的次生代謝產(chǎn)物，這些化學(xué)物質(zhì)能夠影響鄰近植物生長的現(xiàn)象稱之為化感作用[8]。許多化感植物釋放的毒素不僅對鄰近植物有害也對其自身有毒害作用，稱之為自毒作用[9]。在外界管理得當(dāng)?shù)臈l件下，宿根苧麻生長受阻引起的敗蔸發(fā)生可能來源于其自身物質(zhì)的釋放及根際環(huán)境的影響，但涉及這一方面的研究還鮮有報道，故從化感方面來探究苧麻敗蔸的要因?qū)τ跍p緩苧麻敗蔸、提高苧麻纖維產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要意義。白玉超等[10–11]研究結(jié)果表明，不同品種苧麻敗蔸率具有差異性。本研究主要以‘湘苧7號’該品種苧麻為材料，用含有供體植物不同部位的殘留物來種植受體植物是用來確定供體植物是否具有化感作用的最常見方法[12]，在自然界中，水溶性化感物質(zhì)主要通過雨霧等的淋溶而進入土壤產(chǎn)生化感作用[1]，因此在化感作用研究中根據(jù)化感物質(zhì)進入環(huán)境的途徑常用水作為浸提溶劑獲得浸提液，應(yīng)盡量避免用有機溶劑和熱水[13]。目前關(guān)于具有化感作用的植物種類報道較多，但化感物質(zhì)在植物體內(nèi)所起作用還鮮有報道。該試驗一方面探究了‘湘苧7號’苧麻根際土壤水浸提液的化感效應(yīng)，另一方面還初步探索了化感物質(zhì)對植物的脅迫基因和生長素合成基因表達的影響，力圖為減輕苧麻敗蔸產(chǎn)生的危害提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試根際土壤于 2015 年二麻收獲期取自湖南瀏陽澄潭江苧麻試驗基地。取樣品種為‘湘苧 7 號’。供試的受體植物為蘿卜、油菜、擬南芥 (哥倫比亞生態(tài)型)。

1.2 研究方法

1.2.1 浸提液的制備 將取回的根際土壤自然風(fēng)干過2 mm 篩，取 6.5 kg，按 1∶2 比例加入超純水浸泡，定期攪拌，浸泡 48 h 后用 4 層滅菌醫(yī)用紗布進行過濾收集粗浸提液，將粗濾液置于離心機 (2500 r/min，10℃) 離心 10 min，離心得到澄清的濾液過孔徑 0.45 μm的微孔濾膜得到精濾液 8500 mL，并濃縮至 500 mL，得到濃度為 8.5 g/mL (即 1 mL 水溶液中含有 8.5 g 土壤的浸提物) 的液體作為母液，放置于 4℃ 的冰箱待用。1.2.2不同極性有機溶劑萃取液的 GC-MS 檢測

1) 萃取液制備取 4 支 50 mL 離心管，每管加入母液 50 mL 放置于–80℃ 冰箱冷凍至固態(tài)，取出置于冷凍干燥機內(nèi)把水分完全除去留下物質(zhì)，再在 4支離心管內(nèi)分別加入石油醚、乙醚、氯仿、甲醇 4種極性由低到高的有機溶劑[14]進行萃取，萃取液經(jīng)針頭式微孔濾膜過濾后，存儲于 1 mL EP 管內(nèi)，待檢。

2) GC-MS 測定條件于湖南大學(xué)化學(xué)分析中心進行樣品測定：GC-MS (氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Thermo Finnigan 120150-T230 L)，HP-5MS 毛細管柱 (30 m × 0.01 m × 0.25 m)。進樣口溫度 280℃，檢測 250℃。初始化溫度 60℃，保留 3 min，然后按 15℃/min的程序升溫至 250℃，保留 5 min；載氣：He。

1.2.3 種子萌發(fā)實驗 選取顆粒飽滿、大小一致，萌發(fā)率整齊的蘿卜、油菜和擬南芥種子，用 15% 的消毒液消毒 3 min，再用無菌蒸餾水沖洗 5 次，待用。配制 1/2 MS 培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)基中加入 1 mL 和10 mL 母液，未加入的為空白對照，調(diào)節(jié) pH 至 5.8后，于 121℃ 濕熱滅菌 20 min 后待用。在無菌環(huán)境下，進行點種，蘿卜和油菜種子每皿 20 粒，擬南芥種子每皿 40 粒，每個處理 3 次重復(fù)，上蓋封好。放置于溫度 25℃、濕度 75% RH、光照 2000 Lx 的光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。每天記錄發(fā)芽種子數(shù)，在蘿卜、油菜和擬南芥生長 5 d、5 d和 7 d (生長狀態(tài)穩(wěn)定) 時分別測量它們的胚根以及下胚軸的長度。

1.2.4 實時熒光定量 PCR 檢測 選取生長在加入不同濃度苧麻土壤浸提液的 1/2 MS 培養(yǎng)基培養(yǎng) 10 天的擬南芥幼苗，將其整株置于離心管后迅速投入液氮中冷凍，參照 Sigma 公司植物 RNA 提取試劑盒的說明書對擬南芥進行 RNA 的提取；RNA 逆轉(zhuǎn)錄參照TaKaRa 生物公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行。轉(zhuǎn)錄完的cDNA 依據(jù) PCR 檢查的亮度稀釋 15～20 倍。

QPCR 可用于確定處理因素施用后基因表達水平的改變[15]。本實驗采用 Mx3000P 型實時熒光定量PCR 儀，PCR 反應(yīng)設(shè)置的條件為：95℃ 5 min，95℃30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)總數(shù) 40 個。實驗所涉及的定量引物序列見表 1，實驗的均一化內(nèi)參以ACTIN-2 基因表達的豐度為依據(jù)。10 μL 體系：5 μL SYBR Green Mix，0.5 μL 正向引物，0.5 μL 反向引物，0.2 μL Rox，3.8 μL 稀釋后的 cDNA 模板。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) (v7.05 專業(yè)版) 進行方差顯著性分析，Microsoft Excel 2007 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，Photoshop CS6 進行圖片處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS 檢測結(jié)果分析

由 GC-MS 檢測結(jié)果可知，不同極性萃取液的萃取效果不同，其中甲醇萃取液中共鑒定出 3 種主要物質(zhì) (表2)，氯仿萃取液中鑒定出 28 種主要物質(zhì)(表3)，乙醚和石油醚萃取液中均鑒定出 10 種主要物質(zhì) (表4、表5)。從甲醇、氯仿、石油醚、乙醚 4 種有機溶劑萃取液中鑒定出烴類及其衍生物、甾類化合物、苯甲酸及其衍生物、酚類、萜類、含氮類、其它雜環(huán)類共 7 大類別的化學(xué)成分。其中某些化學(xué)物質(zhì)的化感活性已被報道，張兵之在對伊樂藻的化感作用研究中，通過柱層析、薄層層析、GC-MS、LC-MS、NMR 等多種手段首次分離并鑒定出豆甾-4-烯-3,6-二酮為伊樂藻的主要化感物質(zhì)[16]，在苧麻根際土壤水浸液氯仿萃取液中分離鑒定出該物質(zhì)及其類似物。2,6-二叔丁基苯酚的化感特性已被多次報道[17–20]，前期研究表明該物質(zhì)是地黃、辣椒、水稻、大蒜、煙草等多種植物的主要化感物質(zhì)，該物質(zhì)可以對植株的幼苗生長及各種生理特性產(chǎn)生影響，在苧麻根際土壤水浸液氯仿萃取液中分離鑒定出該物質(zhì)的同分異構(gòu)體 2,5-二叔丁基苯酚。鄰苯二甲酸及其衍生物的化感活性已有相關(guān)研究[19–23]，鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯這幾種物質(zhì)的化感活性均被報道，在乙醚萃取液中分離鑒定出這幾種物質(zhì)的同系物鄰苯二甲酸二乙酯。氯仿萃取液中分離鑒定出的 6,6-二甲基-1,3-庚二烯-5-醇與桃金娘科五脈白千層的化感物質(zhì)橙花叔醇(3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳烯-3-醇)[24]具有類似結(jié)構(gòu)。羊毛甾-8,24-二烯-3,22-二醇與苜蓿的主要化感物質(zhì)皂苷[25]具有類似結(jié)構(gòu)。由前期對化感物質(zhì)的研究及本次對苧麻根際土壤水浸液 GC-MS 的檢測結(jié)果，可初步推測苧麻根際土壤中存在潛在的化感物質(zhì)，但由于化感物質(zhì)具有一定的作用譜，因此這些物質(zhì)在苧麻敗蔸中的作用還有待進一步證實。

表1 實時熒光定量 PCR 檢測引物序列Table1 Primer sequences used for Quantitative Real-time PCR (QPCR)

表2 經(jīng) GC-MS 鑒定的甲醇萃取液中的化合物Table2 Identification of compounds in methanol extracts by GC-MS

表3 經(jīng) GC-MS 鑒定的氯仿萃取液中的化合物Table3 Identification of compounds in chloroform extracts by GC-MS

表4 經(jīng) GC-MS 鑒定的乙醚萃取液中的化合物Table4 Identification of compounds in diethyl ether extracts by GC-MS

表5 經(jīng) GC-MS 鑒定的石油醚萃取液中的化合物Table5 The identification of compounds in petroleum ether extracts by GC-MS

2.2 不同濃度苧麻根際土壤水浸液對不同植物胚根、下胚軸的影響

由圖 1 可知，不同濃度苧麻根際土壤水浸液對三種植物的胚根及下胚軸長具有不同的效應(yīng)，隨著浸提液濃度增加，對蘿卜的胚根及下胚軸長均表現(xiàn)為促進作用，但處理與對照差異均不顯著；隨浸提液濃度增加，對油菜的胚根及下胚軸長均表現(xiàn)為抑制作用，尤其對根的影響更大，兩個處理與對照差異均顯著，對下胚軸的影響表現(xiàn)為高濃度與對照差異性顯著；隨浸提液濃度增加，對擬南芥的胚根及下胚軸長具有明顯的抑制作用，兩個處理的下胚軸長及根長與對照相比差異均顯著。實驗結(jié)果表明，蘿卜受化感作用抑制較其他兩種植物小，油菜及擬南芥兩種植物均表現(xiàn)出高濃度抑制效應(yīng)。

2.3 QPCR 檢測結(jié)果分析

由圖 2 可知，擬南芥隨著苧麻水浸液濃度的增加，其與逆境表達相關(guān)的基因 RD29A 及 RD29B 含量均呈現(xiàn)下降趨勢，同時，YUC1 這一與生長素合成相關(guān)的基因含量也呈現(xiàn)相同趨勢。非生物脅迫對植物的生長和繁殖會產(chǎn)生不利的影響，能引起植物在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)及分子多方面的改變。分子學(xué)方面的研究表明有一些具有諸多功能的基因被這些非生物因素所誘發(fā)。其中 RD29A 及 RD29B 這兩種基因會被干旱、寒冷及高鹽脅迫所誘發(fā)，這些基因能夠編碼親水性蛋白使植物具有抗逆性[26]。本實驗中，RD29A 及 RD29B 這兩種基因在不同濃度水浸液處理后其表達量隨濃度升高轉(zhuǎn)錄水平均下降，說明苧麻土壤水浸液對擬南芥的化感效應(yīng)的原因是：其處理后導(dǎo)致擬南芥的逆境基因含量下降，使其抗逆性變?nèi)?，故外在形態(tài)上表現(xiàn)出隨處理液濃度增加下胚軸長及根長變短。

圖1 不同濃度苧麻根際土壤水浸液對蘿卜、油菜、擬南芥胚根、下胚軸生長的影響Fig. 1 Influence of different concentrations of ramie rhizosphere soil water extracts on the radicle and hypocotyl growth of Raphanus sativus L., Brassica campestris L. and Arabidopsis thaliana[注（Note）：柱上不同字母表示同一時期處理間差異達到 5% 顯著水平Different letters above the bars mean significant among concentration treatments at the same stage at 5% level.]

圖2 不同濃度苧麻根際土壤水浸液對擬南芥 RD29A、RD29B、YUC1 基因表達的影響Fig. 2 Influence of different concentrations of ramie rhizosphere soil water extracts on Arabidopsis RD29A, RD29B and YUC1 gene expression

生長素是一種非常重要的植物激素，它能夠調(diào)節(jié)植物多種生長過程及許多逆境應(yīng)答。已有研究表明，生長素能夠調(diào)節(jié)種子的萌發(fā)，向性生長，根的生長，細胞分化，花器官的形成[27]。除此以外，內(nèi)源性和外源性生長素也會調(diào)控非生物應(yīng)激相關(guān)基因的表達 (RAB18、RD22、RD29A、RD29B、DREB2A等)，同時會影響活性氧代謝和抗氧化酶的活性[28]。本實驗中，與生長素合成相關(guān)的 YUC1 基因含量隨處理液濃度增加而降低，進一步說明苧麻根際土壤水浸液對擬南芥的化感效應(yīng)是因為改變了其內(nèi)在生理水平。

3 討論與結(jié)論

化感物質(zhì)在很多作物研究中均有報道，如水稻、辣椒等[18, 29]，其化感潛力不盡相同。在自然生長狀態(tài)下苧麻與其它植物相比競爭力強，麻園雜草較少，但連續(xù)種植敗蔸率提高[10]，說明苧麻釋放的物質(zhì)一方面抑制了其他植物的生長，另一方面由于物質(zhì)長期的累積對自身也產(chǎn)生了不利影響。目前已有文獻報道從其根莖葉中提取出綠原酸、黃酮、香豆素、β-谷甾醇等物質(zhì)[30–34]。綠原酸的化感機理已有報道，其能阻抑吲哚乙酸的降解，增強吲哚乙酸誘導(dǎo)生長的能力，同樣能抑制種子萌發(fā)所需要的關(guān)鍵酶類如磷酸化酶的活性，進而影響種子萌發(fā)[35]。黃酮是重要的化感作用物質(zhì)，世界熱帶、亞熱帶沿海地區(qū)海邊防護林樹種木麻黃 (Casuarina equisetifolia) 不僅對其他植物具有化感抑制作用，而且也有自毒作用，其作用的化感物質(zhì)就是不同結(jié)構(gòu)的黃酮[36]；勝紅薊抑制柑橘園中潰瘍病菌的化感物質(zhì)也是黃酮類物質(zhì)[37]，大量的研究都表明，黃酮類物質(zhì)在植物化感中具有重要地位。多種植物中存在的香豆素及其衍生物等都是已知種子萌發(fā)抑制劑，香豆素能阻斷洋蔥(A.cepia) 的有絲分裂過程[38]。

前期對苧麻敗蔸的研究主要集中于外部管理因素[2]。本實驗根據(jù)自然表型及前期對苧麻化學(xué)成分的研究結(jié)合植物化感物質(zhì)進入環(huán)境的途徑采用了最接近自然狀態(tài)下的水浸提法[39]來進行化感試樣的制備，對苧麻根際土壤所含物質(zhì)的活性進行探究。生物測定研究表明，高濃度苧麻根際土壤水浸提液對三種供試植物的下胚軸長及根長不同的抑制，因此連作導(dǎo)致的化感物質(zhì)累積可能是連坐導(dǎo)致苧麻敗蔸的原因之一。

化感物質(zhì)的作用機制主要有如下幾個方面：影響細胞膜的透性；影響細胞分裂、伸長和根尖的細微結(jié)構(gòu)、影響礦質(zhì)離子的吸收；影響呼吸作用；影響光合作用；影響植物激素的活性；抑制或刺激某些酶的活性[13]。RD29A 及 RD29B 是模式生物擬南芥重要的兩種與逆境表達相關(guān)的基因，YUC1 是與生長素合成相關(guān)的基因。本研究中擬南芥幼苗的 RD29A、RD29B 及 YUC1 相對含量隨著苧麻根際土壤水浸液濃度的增加而降低，說明植物在化感脅迫下受損害的程度越來越嚴(yán)重，暗示苧麻根系通過釋放化感物質(zhì)抑制了其他植物的逆境基因和生長基因的表達，從而達到了競爭的目的。

GC-MS 的檢測結(jié)果表明苧麻根際土壤中含有抑制自身生長的潛在化感物質(zhì)豆甾-4-烯-3,6-二酮，2,5-二叔丁基苯酚，鄰苯二甲酸二乙酯，6,6-二甲基-1,3-庚二烯-5-醇，羊毛甾-8,24-二烯-3,22-二醇。

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Allelopathic potential evaluation of water extracts from ramie rhizosphere soil

LIU Nan-nan1, BAI Yu-chao1, LI Xue-ling1, YANG Rui-fang1, GUO Ting1,2, CUI Guo-xian1,3*
( 1 Ramie Research Institute of Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2 Guiyang Country Tobacco Monopoly Administration, Hunan Province, Guiyang 424000, China; 3 Institute of Bast Fiber Crops, CAAS, Changsha 410205, China )

【Objectives】To study the relationship between root-rot and allelopathy of ramie, the organic compounds and allelopathic effect of rhizosphere oil water extracts were determined.【Methods】The GC-MS was used to identify the compounds of the different polarity organic solvent extracts. The allelopathy potentials of different concentrations of rhizosphere soil water extract were bioassayed for Raphanus sativus, Brassica rapa and Arabidopsis thaliana; and QPCR was applied to determine the gene expression (RD29A, RD29B, YUC1), which was related to stress tolerance and auxin synthesis.【Results】Fifty-one compounds in four different polar organic solvent extracts were identified, including hydrocarbons and their derivatives, steroid compounds, benzoic acid and its derivatives, phenols, terpenoids, nitrogenous substances and so on, and part of them is allelophathic substance. The different concentrations of rhizosphere soil water extracts had obvious allelopathy on hypocotyl and root length of three plants to different extent. The inhibition to Brassica rapa and Arabidopsis thaliana was more significant with the increase of concentration of water extracts, less significant to Raphanus sativus. The QPCR testing results showed that the gene expression relative quantity of RD29A, RD29B and YUC1 generallydecreased with the increase of the concentration of water extracts.【Conclusions】Raime rhizosphere soil is proved containing potential allelochemicals of cholest-4-ene-3,6-dione, phenol, 2,5-bis(1,1-dimethylethyl)-, diethyl phthalate, 6,6-dimethyl-1,3-heptadien-5-ol, lanosta-8,24-diene-3,22-diol. The hypocotyl and root length are mainly allelopathic effected at higher concentrations of rhizosphere soil water extracts. Therefore, we infered the allelopathy is one of the causes associated with ramie succession cropping obstacle and root-rot.

ramie; rhizosphere soil water extract; allelopathy; gene expression; allelophathic substance; root-rot

2016–04–22 接受日期：2016–12–02

國家麻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系土壤肥料崗位（CARS-19-E20）；國家自然科學(xué)基金項目（31471543）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目（CX2015B232）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IBFC07）資助。

劉楠楠（1991—），女，湖北棗陽人，碩士研究生，主要從事苧麻生理與生化研究。E-mail：422721493@qq.com

* 通信作者 Tel：0731-84635438，E-mail：gx-cui@163.com