BMPR—IB基因多態(tài)性與湖羊產(chǎn)羔性能的關(guān)系

楊媛 翁愷麒 李擁軍 顧祝榮 郭海燕

摘要[目的]研究骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體IB（Bone morphogenetic protein receptor IB，BMPR-IB）基因多態(tài)性與湖羊產(chǎn)羔性能的關(guān)系。[方法]采用PCR擴(kuò)增、酶切和序列測(cè)定等方法對(duì)湖羊BMPR-IB基因型進(jìn)行鑒定，并分析BMPR-IB基因型與湖羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系。[結(jié)果]共檢測(cè)出3種基因型，并將其分別定義為AA、AG、GG。測(cè)序結(jié)果表明，等位基因A與G相比發(fā)生了1處堿基突變（A746G）。BMPR-IB基因在湖羊中存在多態(tài)性（AA、AG和GG）；湖羊中A等位基因的頻率為0.032，G等位基因的頻率為0.968。AA、AG和GG基因型頻率分別為0.006、0.053和0.941。AA、AG和GG基因型湖羊的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.25、1.81和1.96。[結(jié)論]BMPR-IB基因可能是湖羊多胎性能的主效基因，可用于對(duì)湖羊產(chǎn)羔數(shù)的選擇。

關(guān)鍵詞湖羊；BMPR-IB基因；產(chǎn)羔數(shù)

中圖分類號(hào)S826文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）26-0113-03

Relationship between Polymorphism of BMPRIB Gene and Lambing Performance of Hu Sheep

YANG Yuan， WENG Kaiqi， LI Yongjun* et al

（College of Animal Science and Technology， Yangzhou University/Key Laboratory for Animal Genetic， Breeding， Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province，Yangzhou，Jiangsu 225009）

Abstract[Objective]To study the relationship between the polymorphism of bone morphogenetic protein receptor IB（BMPRIB） gene and the lambing performance of Hu Sheep.[Method] The genotypes of BMPRIB gene was identified by the methods of PCR amplification，enzyme digestion and sequencing.And the relationship between the genotypes of BMPRIB and litter size of Hu Sheep was analyzed.[Result]Three genotypes were detected， and defined as AA， AG， GG， respectively. The sequencing results showed that the allele A and G had a base mutation （A746G）， and there was BMPRIB genes polymorphism （AA， AG and GG） in Hu Sheep. The frequency of A allele in Hu Sheep was 0032， the frequency of G allele was 0.968. The frequencies of AA，AG and GG genotype were 0.006， 0.053 and 0.941，respectively. The average litter size of Hu Sheep with AA， AG and GG genotypes were 1.25， 1.81 and 1.96，respectively. [Conclusion]BMPRIB gene might be the major gene for the prolificacy of Hu Sheep， it could be used to select litter size of Hu Sheep.

Key wordsHu Sheep；BMPRIB gene；Litter size

我國(guó)綿羊的遺傳資源和飼養(yǎng)數(shù)量均位居世界第一，但出欄率僅19.6%，與世界平均水平（35%）相比明顯偏低[1-2]。湖羊主要分布在江浙一帶，是我國(guó)著名的一級(jí)保護(hù)多胎品種。湖羊具有終年發(fā)情的特點(diǎn)，且性成熟較早，一年內(nèi)可以完成出生、配種、產(chǎn)羔，產(chǎn)羔率能達(dá)到200%～250%[3-4]。湖羊的繁殖性狀是其主要的經(jīng)濟(jì)性狀之一，這一性狀是由多基因控制，因此尋找控制繁殖性狀的主效基因?qū)τ谔岣咂浣?jīng)濟(jì)性狀具有重要意義。隨著現(xiàn)代分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，湖羊繁殖性狀的遺傳改良有了新的方向和途徑。

早在1980年就有研究表明綿羊的多胎性是由控制繁殖性狀的基因發(fā)生突變所導(dǎo)致的，并將該突變基因初步命名為FecB，該基因的功能是通過(guò)增加排卵數(shù)而提高產(chǎn)仔數(shù)[5-6]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenetic protein，BMP）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming growth factor，TGF）超家族中最大的亞家族，它們具有多功能性，且在動(dòng)物機(jī)體的各組織器官?gòu)V泛分布，參與動(dòng)物的免疫系統(tǒng)、胚胎發(fā)育和生殖發(fā)育，對(duì)哺乳動(dòng)物的繁殖有著非常重要的影響[7-11]。BMPR-IB基因?qū)ψ訉m內(nèi)膜的發(fā)育有著直接或間接作用[12]。BMPR-IB基因是由可編碼502個(gè)氨基酸的10個(gè)外顯子組成，其編碼序列長(zhǎng)1 509 bp[13]，該基因在骨骼肌、腦和腎臟中有中度表達(dá)，最重要的是在與綿羊繁殖有關(guān)的各器官（如卵巢、子宮、睪丸和前列腺）中都有廣泛表達(dá)[14]。研究表明，控制多胎性能的基因是對(duì)應(yīng)于人染色體4q22～23區(qū)間的6號(hào)常染色體BMPR-IB基因，該基因的1對(duì)等位基因A與G相比發(fā)生了1處堿基突變（A746G），使攜帶BMPR-IB突變基因母羊的顆粒細(xì)胞分化加快，卵泡成熟加速，進(jìn)而使排卵數(shù)增多[15-16]。此外，一些研究表明Booroola母羊高繁殖力與該突變完全相關(guān)[17-20]。筆者研究了湖羊BMPR-IB基因的多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系，旨在為篩選湖羊多胎性候選基因提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

選取具有第1胎和第2胎生產(chǎn)記錄的湖羊，共342只。采集湖羊頸靜脈血液約3 mL，并記錄耳標(biāo)號(hào)，羊只全部來(lái)自于江蘇省太倉(cāng)金倉(cāng)湖羊場(chǎng)。采血用一次性采血盛血器，并且提前在采血管中加入ACD抗凝劑。血樣用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室后4 ℃下保存，以備提取DNA。

1.2DNA的提取及檢測(cè)

參照天根生化科技（北京）有限公司的血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書來(lái)提取DNA，-20 ℃下保存。

1.3PCR擴(kuò)增與酶切

1.3.1PCR擴(kuò)增。

BMPR-IB引物采用Primer5-blast設(shè)計(jì)引物的方法，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成，引物序列為：

上游引物為5′-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3′；

下游引物為5′-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3′。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）包括DNA 1 μg、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR MasterMix（天根生化科技有限公司）12.5 μL，用ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，57 ℃復(fù)性90 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.3.2

酶切。用AvaⅡ限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切體系為20 μL，其中擴(kuò)增產(chǎn)物為5 μL，限制性內(nèi)切酶10 U，37 ℃水浴3 h；酶切反應(yīng)結(jié)束后，將20 μL消化液全部加樣于2.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后在紫外凝膠成像系統(tǒng)中照相，根據(jù)酶切產(chǎn)生的條帶確定基因型。

1.4序列測(cè)定

將提取的DNA送至無(wú)錫翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序及基因型鑒定。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

收集并整理湖羊的生產(chǎn)記錄，計(jì)算湖羊BMPR-IB不同基因型及基因頻率。使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，對(duì)不同BMPR-IB基因型的湖羊產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行LSD多重比較，分析不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增結(jié)果

從342個(gè)樣品PCR產(chǎn)物中隨機(jī)抽出9個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，結(jié)果表明其特異性良好（圖1），目的條帶長(zhǎng)度符合預(yù)期，在140 bp左右。

2.2湖羊BMPR-IB基因酶切結(jié)果

由于湖羊BMPR-IB基因的1對(duì)等位基因A與G相比發(fā)生了1處堿基突變（A746G），因此對(duì)湖羊BMPR-IB基因經(jīng)酶切后進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，得到110和140 bp 2種帶型（圖2）。在所檢測(cè)的羊群中共有3種基因型，設(shè)與PCR原液條帶相同的個(gè)體為AA基因型，同時(shí)含有110和140 bp條帶的個(gè)體為AG基因型，只含有110 bp條帶的個(gè)體為GG基因型。

2.3不同基因型測(cè)序結(jié)果

為確定BMPR-IB基因的突變位點(diǎn)，將AA、AG與GG基因型的PCR產(chǎn)物送交無(wú)錫翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，等位基因A與G相比發(fā)生了1處堿基突變（A746G）。測(cè)序結(jié)果如圖3所示。

2.4湖羊BMPR-IB基因型及基因頻率

檢測(cè)結(jié)果表明，在342個(gè)湖羊樣本中，2個(gè)為AA型，18個(gè)為AG型，322個(gè)為GG型。經(jīng)計(jì)算，等位基因G和等位基因A的基因頻率分別為0.968和0.032。AA、AG和GG基因型頻率分別為0.006、0.053和0.941，湖羊AA、AG和GG基因型的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.25、1.81和1.96。

2.5湖羊BMPR-IB基因的不同基因型產(chǎn)羔數(shù)比較

由表1可知，AA、AG、GG基因型第1胎產(chǎn)羔數(shù)差異顯著（P<005）；AA與AG、GG基因型第2胎產(chǎn)羔數(shù)差異顯著（P<005），但GG基因型與AG基因型間差異不顯著（P≥005）。整體來(lái)看，AA與AG、GG基因型的產(chǎn)羔數(shù)差異顯著（P<005），GG與AG基因型產(chǎn)羔數(shù)間差異不顯著（P≥0.05）。

3討論與結(jié)論

綿羊作為經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，為人們提供肉和毛皮。隨著社會(huì)的發(fā)展，其產(chǎn)量已不能滿足人類的需求，主要是因?yàn)榫d羊?yàn)閱翁ザ倘照談?dòng)物，生產(chǎn)力低下，嚴(yán)重限制了綿羊業(yè)的發(fā)展。湖羊作為我國(guó)特有的多胎品種，研究其多胎機(jī)制對(duì)于綿羊業(yè)的發(fā)展具有重要作用。

很早以前，育種學(xué)家便開始關(guān)注湖羊的多胎性，許多學(xué)者通過(guò)研究湖羊的內(nèi)分泌機(jī)制和表型特點(diǎn)，對(duì)其選育進(jìn)行指導(dǎo)，明顯提高了湖羊的產(chǎn)羔率。管峰等[21]對(duì)湖羊的BMPR-IB基因進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該湖羊群體中只檢測(cè)出 BB基因，因而在湖羊中的基因效應(yīng)完全一致，所以認(rèn)為BMPR-IB基因不是湖羊多胎的主效基因，對(duì)該湖羊群體進(jìn)行選育后仍然可以提高其產(chǎn)羔率。閆亞?wèn)|等[19]認(rèn)為湖羊BMPR-IB基因與其他單胎品種差異顯著，所以BMPR-IB基因是導(dǎo)致湖羊多胎性狀的主效基因。

該試驗(yàn)的樣本數(shù)為342個(gè)，將全部樣本送交無(wú)錫冀和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定基因型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA、AG和GG基因型頻率分別為0.006、0.053和0.941。對(duì)BMPR-IB與湖羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AA、AG和GG基因型之間的產(chǎn)羔數(shù)存在顯著差異，這與吳麗麗等[22]的研究結(jié)果相一致，但與管峰等[21]的研究結(jié)果不一致，這可能是由于參照對(duì)象不同。該試驗(yàn)結(jié)果表明，BMPR-IB基因可能是湖羊多胎性能的主效基因，可用于對(duì)湖羊產(chǎn)羔數(shù)的選擇。

參考文獻(xiàn)

[1] 賈建磊，張利平，丁強(qiáng)，等.綿羊BMPR-IB基因第7外顯子多態(tài)性與產(chǎn)羔性狀的相關(guān)性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，44（1）：7-13.

[2] 楊燕燕.影響蒙古羊雙羔群體繁殖性狀候選基因的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[3] 殷子惠.綿羊骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體ⅠB Q249R突變的檢測(cè)及其對(duì)小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)的效應(yīng)分析[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[4] 史洪才，武堅(jiān).我國(guó)對(duì)湖羊和小尾寒羊多胎基因的研究[J].草食家畜，2004（4）：14-16.

[5] 賈存靈.小尾寒羊多胎性狀主要候選基因及繁殖相關(guān)基因表達(dá)量研究[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[6] 楊華，張永勝，何其宏，等.中國(guó)美利奴羊多胎品系選育中多胎性狀分離與BMPR-IB基因型的相關(guān)性分析[J].中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)，2009，29（1）：16-18.

[7] GALLOWAY S M，MCNATTY K P，CAMBRIDGE L M，et al.Mutations in an oocytederived growth factor gene（BMP15）cause increased ovulation rate and infertility in a dosagesensitive manner[J].Nature genetics，2000，25（3）：279-283.

[8] LAN Z J，GU P，XU X，et al.GCNFdependent repression of BMP15 and GDF-9 mediates gamete regulation of female fertility[J].Embo journal，2003，22（16）：4070-4081.

[9] LAWSON K A，DUNN N R，ROELEN B A，et al.Bmp4 is required for the generation of primordial germ cells in the mouse embryo[J].Genes & development，1999，13（4）：424-436.

[10] 桑林華，儲(chǔ)明星，王金玉，等.綿羊高繁殖力候選基因BMPR-IA的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，37（9）：852-857.

[11] 劉昌乙，李曉勇，王純.骨形態(tài)發(fā)生蛋白研究的某些進(jìn)展[J].成都體育學(xué)院學(xué)報(bào)，1995（1）：81-85.

[12] 王啟貴，鐘發(fā)剛，李輝，等.綿羊BMPRIB基因多態(tài)性與其產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)研究[J].草食家畜，2003（2）：20-23.

[13] 朱二勇，史洪才，武堅(jiān)，等.BMPRIB基因作為綿羊多胎性能候選基因的研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15（6）：20-23.

[14] WILSON T，WU X Y，JUENGEL J L，et al.Highly prolific booroola sheep have a mutation in the intracellular kinase domain of bone morphogenetic protein IB receptor（ALK-6）that is expressed in both oocytes and granulosa cells[J].Biology of reproduction，2001，64（4）：1225-1235.

[15] 葛燕，張家驊.骨形態(tài)發(fā)生蛋白在動(dòng)物繁殖上的研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（6）：33-37.

[16] SOUZA C J，MACDOUGALL C，MACDOUGALL C，et al.The booroola（FecB）phenotype is associated with a mutation in the bone morphogenetic receptor type 1 B（BMPR1B）gene[J].Journal of endocrinology，2001，169（2）：1-6.

[17] MULSANT P，LECERF F，F(xiàn)ABRE S，et al.Mutation in bone morphogenetic protein receptorIB is associated with increased ovulation rate in Booroola Mérino ewes[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，2001，98（9）：5104-5109.

[18] 田秀娥，孫紅霞，王永軍.3個(gè)綿羊群體INHA基因的遺傳多態(tài)性及對(duì)產(chǎn)羔數(shù)的影響[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，38（1）：23-29.

[19] 閆亞?wèn)|，儲(chǔ)明星，曾勇慶，等.小尾寒羊和湖羊高繁殖力候選基因BMPRIB的研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13（1）：66-71.

[20] 王生寶，張英杰，劉月琴，等.不同綿羊品種BMPRIB基因多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（12）：8-10.

[21] 管峰，艾君濤，劉守仁，等.BMPRIB和BMP15基因作為湖羊多胎性候選基因的研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào)，2005，26（3）：9-12.

[22] 吳麗麗，趙曉楓，張立凡，等.湖羊BMPRIB、BMP15和GDF9基因的RFLP分析[J].中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué)，2011，31（4）：9-12.

45卷26期楊 媛等BMPR-IB基因多態(tài)性與湖羊產(chǎn)羔性能的關(guān)系