甜瓜白粉病抗病基因的定位及候選基因分析

李 冰趙玉龍朱強(qiáng)龍張志鵬樊 超欒非時(shí)*高 鵬*

（1農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南基地，海南三亞 572000）

甜瓜白粉病抗病基因的定位及候選基因分析

李 冰1，2趙玉龍1，2朱強(qiáng)龍1，2張志鵬1，2樊 超2，3欒非時(shí)1，2*高 鵬1，2*

（1農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150030；2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南基地，海南三亞 572000）

以甜瓜高抗白粉病自交系MR-1為母本，易感白粉病自交系Top Mark為父本，構(gòu)建BC1P2和F2群體，經(jīng)13個(gè)國際通用的甜瓜白粉病生理小種鑒別寄主鑒定，2015年東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程中心的白粉病發(fā)病病菌為P. xanthii生理小種1，甜瓜MR-1對P. xanthii生理小種1的抗性由單顯性基因控制。通過對266個(gè)F2分離群體的抗病性鑒定和CAPS標(biāo)記分析，采用復(fù)合區(qū)間作圖法對甜瓜抗白粉病性狀進(jìn)行QTL分析，最終構(gòu)建了1張包含203個(gè)CAPS標(biāo)記的甜瓜遺傳連鎖圖譜，并將抗病基因PXR定位在第12號染色體上M12-GH和M12-TE 2個(gè)標(biāo)記之間，該基因與兩側(cè)翼標(biāo)記間的距離分別為0.63 cM和0.42 cM，兩側(cè)翼標(biāo)記間在甜瓜參考基因組上對應(yīng)的物理距離為303 kb，該區(qū)域內(nèi)含有60個(gè)預(yù)測基因，其中10個(gè)基因含有非同義單堿基突變。10個(gè)基因熒光定量分析結(jié)果顯示，在抗病與感病甜瓜表達(dá)量存在較大差異的4個(gè)基因MELO3C002434、MELO3C002437、MELO3C002441、MELO3C002457為甜瓜白粉病抗病候選基因。

甜瓜；白粉??；CAPS；抗病基因

甜瓜（Cucumis meloL.）起源于非洲和亞洲熱帶地區(qū)，廣泛栽培于世界范圍內(nèi)溫帶至熱帶地區(qū)（林紅梅 等，2013），據(jù)FAOSTAT和中國農(nóng)業(yè)統(tǒng)計(jì)資料最新數(shù)據(jù)顯示，2014年全球甜瓜總產(chǎn)量達(dá)到0.296億t，我國2015年的甜瓜總產(chǎn)量約為0.153億t。白粉病作為甜瓜、黃瓜、南瓜等葫蘆科作物上廣泛發(fā)生的一種世界性真菌病害，在露地和保護(hù)地栽培中均有發(fā)生，發(fā)病時(shí)葉片表面形成不規(guī)則大片病斑，嚴(yán)重時(shí)全葉或莖蔓上遍布白粉，葉片脆硬干枯甚至喪失光合能力，造成植株早衰（谷醫(yī)林，2013），從而嚴(yán)重影響葫蘆科作物的品質(zhì)和產(chǎn)量，是危害甜瓜生產(chǎn)的主要病害之一。目前，已報(bào)道的最常見的引起白粉病的病原菌是單囊殼屬的單囊殼菌Podosphaera xanthii（原名為Sphaerotheca fuliginea）和白粉菌屬的二孢白粉菌Golovinomyces cichoracearum（原名為Erysiphe cichoracearum）（Kí? stko vá et al.，2009）。同二孢白粉菌相比，單囊殼菌主要發(fā)生在全球范圍內(nèi)的高溫高濕度地區(qū)，具有生理小種多、發(fā)病范圍廣的特點(diǎn)（Mccreight，2003）。根據(jù)對不同鑒別寄主侵染的反應(yīng)，P. xanthii被分為很多生理小種，包括小種0、1、2 US、2 France（2F）、3、4、5、N1（race 6）、N2（race 7）、N3和N4（Hosoya et al.，1999，2000）。隨著鑒別寄主數(shù)量的增加和研究的不斷深入，陸續(xù)有新的生理小種被發(fā)現(xiàn)（Mccreight，2006；Hoytaek et al.，2016）。美國發(fā)病較多的為P. xanthii生理小種1、2和3（Mccreight，2003），法國則是P. xanthii生理小種0、4和5（Bardin et al.，1999）。 在我國最普遍發(fā)生的是P. xanthii小種1和2F（盧浩 等，2015），這兩種生理小種在黑龍江省均有報(bào)道（馬鴻艷 等，2011）。

白粉病病原菌增殖快，傳播迅速，致死率高，防治困難。抗真菌藥物的施用雖然有一定的作用，但是并不能完全抑制白粉病的發(fā)生，而且過多的施用會(huì)引起白粉病生理小種的耐藥性甚至突變，也會(huì)對環(huán)境造成危害（Hollomon et al.，2002）。植物抗病育種是控制病害發(fā)生和減少藥劑使用量的有效途徑，深入了解甜瓜白粉病抗病遺傳機(jī)制是甜瓜白粉病抗性育種工作的基礎(chǔ)和首要任務(wù)，也是分子標(biāo)記等生物技術(shù)輔助育種的基礎(chǔ)。針對P. xanthii小種1和小種2F的抗病基因研究已有多篇報(bào)道。甜瓜品種PI 414723中的抗病基因Pm-7對P. xanthii生理小種 1具有抗性（Pitrat，2006）；甜瓜品種WMR 29中的抗病基因Pm-w對P. xanthii生理小種1和2具有抗性；抗病基因Pm-1抗P. Xanthii生理小種1，被定位在 LGⅨ上（Teixeira et al.，2008）；甜瓜品種PI 414723中的抗病基因Pm-x對P. Xanthii生理小種2F具有抗性（Pitrat，1990）；甜瓜品種K7-1中的抗病基因Pm-2F被定位在LG Ⅱ上（Zhang et al.，2012）。MR-1是白粉病鑒別寄主之一，對多種白粉病生理小種均表達(dá)出抗性，但是其中的抗病基因還未被準(zhǔn)確定位。

本試驗(yàn)以國際甜瓜白粉病生理小種通用鑒別寄主中高抗品種MR-1為母本，以高感白粉病品種Top Mark為父本，配制BC1P2和F2群體，開發(fā)CAPS分子標(biāo)記，構(gòu)建甜瓜分子遺傳圖譜，并對甜瓜白粉病抗病基因進(jìn)行QTL分析。獲得2個(gè)與白粉病抗病基因相連鎖的CAPS標(biāo)記。運(yùn)用熒光定量PCR方法對預(yù)測候選基因在親本中的表達(dá)量進(jìn)行差異性分析，從而對甜瓜白粉病抗病基因進(jìn)行預(yù)測，為甜瓜白粉病抗病基因的克隆與轉(zhuǎn)基因研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

選用國際甜瓜白粉病生理小種通用鑒別寄主中高抗品種MR-1為母本，以高感白粉病品種Top Mark為父本，雜交獲得到F1，將F1嚴(yán)格自交授粉獲得F2種子，F(xiàn)1與Top Mark回交獲得BC1P2。本試驗(yàn)用于白粉病生理小種鑒定的13種國際鑒別寄主分別為：Iran H、Top Mark、V é drantais、PMR 45、PMR 5、WMR 29、Edisto 47、PI 414723、MR-1、PI 124111、PI 124112、PMR 6和Nantais Oblong。供試種子均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院西甜瓜分子遺傳育種研究室提供。

2015年5月，將MR-1、Top Mark、F1、BC1P2、F2群體和13個(gè)鑒別寄主分別定植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程中心（44°04′N，125°42′E），親本與F1采用隨機(jī)區(qū)組方式各定植15株，BC1P2種植45株，13個(gè)鑒別寄主各種植5株，采用完全隨機(jī)方式定植266株F2群體。株距50 cm，行距80 cm，均采用常規(guī)栽培管理方式和水肥供給。

1.2白粉病菌接種和抗性調(diào)查

在盛花期采集同年同地區(qū)嚴(yán)重侵染甜瓜植株的白粉病菌，配制濃度為106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，均勻噴灑在植株葉片上（Zhang et al.，2011）。接種10 d后對親本、F1、BC1P2、F2和13個(gè)鑒別寄主的白粉病侵染情況進(jìn)行調(diào)查，取每株植株從下至上10片真葉分別進(jìn)行觀察記錄與拍照留存。根據(jù)病斑分布情況將每片葉片的發(fā)病情況分為6級：0級，無病斑；1級，沒有明顯的病斑；2級，低級程度侵染；3級，中等程度侵染；4級，嚴(yán)重侵染；5級，病斑分布整片葉子（圖1），并計(jì)算每株單株的發(fā)病指數(shù)（PDI）。PDI＜40的植株為高抗，PDI＞60的植株為感病，40≤PDI≤60的植株為中抗，其中高抗植株與中抗植株均記為抗病。

圖1葉片病斑分級標(biāo)準(zhǔn)

調(diào)查統(tǒng)計(jì)13份鑒別寄主的發(fā)病情況，并參考魏尊苗等（2011）鑒定葫蘆科白粉病生理小種的標(biāo)準(zhǔn)對本試驗(yàn)中的甜瓜白粉病生理小種進(jìn)行鑒別。

1.3 DNA的提取

分別采集P1、P2、F1、F2群體單株的幼嫩葉片保存于-80 ℃冰箱中，采用改良CTAB法（Allen et al.，2006）提取葉片的基因組DNA。DNA的質(zhì)量和濃度通過1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測（SMA 3000，Plextech，中國深圳）。

1.4 CAPS分子標(biāo)記的開發(fā)與篩選

將MR-1與Top Mark的基因組重測序數(shù)據(jù)與甜瓜DHL92參考基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對（Li et al.，2009），利用東北農(nóng)業(yè)大學(xué)西甜瓜分子遺傳育種研究室自編Perl語言腳本提取位于SNP位點(diǎn)兩端約500 bp的片段序列作為候選SNP位點(diǎn)序列。通過SNP2CAPS軟件結(jié)合7種不同的限制性內(nèi)切酶（EcoR I、Hind Ⅲ、PstI、BamH I、XbaI、XhoI和Hinf I）對候選SNP序列進(jìn)行CAPS酶切位點(diǎn)信息的分析，在酶切位點(diǎn)上、下游100～500 bp設(shè)計(jì)引物，盡可能讓引物均勻地分布在12條染色體上，引物設(shè)計(jì)使用Primer premier 6.0軟件并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行合成。

將MR-1、Top Mark與F1利用引物進(jìn)行降落PCR（Touchdown PCR）擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系（10 μL）為：60 ng基因組DNA，上下游引物各1 pmol，1.5 mmol·L-1dNTPs，10×Taq緩沖液和1 U的Taq酶；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)熱7 min，共30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性1 min，60 ℃至45 ℃每個(gè)循環(huán)減少0.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃最終延伸10 min。

選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶在37 ℃酶切PCR產(chǎn)物3～4 h，酶切反應(yīng)體系包含：5 μL PCR產(chǎn)物，3 U限制性內(nèi)切酶，1 μL緩沖液和9 μL ddH2O。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物多態(tài)性。

1.5 QTL分析

將篩選出的具有多態(tài)性的203對CAPS標(biāo)記用于F2群體的基因型分析，經(jīng)過降落PCR、酶切，以及1%瓊脂糖凝膠電泳，將母本帶型記為2，父本帶型記為0，雜合帶型記為1，缺失帶型記為-1。利用QTL ICImapping v4.0軟件構(gòu)建甜瓜遺傳連鎖圖譜（LOD=3.0），并進(jìn)行QTL分析（LOD=4.0）。

1.6 RNA的提取與cDNA的合成

利用Trizol（Invitrogen USA）法提取MR-1與Top Mark葉片RNA。RNA的質(zhì)量和濃度同樣通過1%瓊脂糖凝膠電泳和超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測，檢測合格的RNA利用東洋紡反轉(zhuǎn)錄試劑盒（First Strand cDNA Synthesis Kit，TOYOBO，JAPAN）進(jìn)行第1條鏈cDNA的合成，并于-80 ℃條件進(jìn)行保存。

1.7熒光定量分析

根據(jù)CAPS分子標(biāo)記所設(shè)計(jì)的引物在甜瓜參考基因組中的位置和最新版本的基因組注釋信息，截取該區(qū)域內(nèi)的所有推測基因，并分析這些基因在兩親本間的單核苷酸多態(tài)性。篩選其中具有非同義單核苷酸多態(tài)性（nsSNP）的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析（qRT-PCR）?；蚓幋a全長序列來源于甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫（https：//melonomics.net），再根據(jù)所用的熒光定量試劑盒說明書要求，使用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1）并送至上海生工生物工程有限公司合成。利用熒光定量試劑盒（RealMaster Mix SYBR Green，TIANGEN）進(jìn)行所有樣品的qRT-PCR反應(yīng)，所有樣本均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，配制與加樣過程均在冰上進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系為：1 μL稀釋的cDNA樣品，上、下游引物各1 μL，9 μL 2.5× RealMaster Mix反應(yīng)液，加8 μL RNase-free ddH2O至20 μL。qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性60 s；40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。擴(kuò)增反應(yīng)后通過溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。采用2-ΔΔCT法（Livak & Schmittgen，2001）計(jì)算相對表達(dá)量。

表1熒光定量分析引物

2 結(jié)果與分析

2.1甜瓜白粉病發(fā)病生理小種鑒定

根據(jù)13個(gè)甜瓜白粉病鑒別寄主的抗感鑒定結(jié)果與文獻(xiàn)中白粉病生理小種鑒定標(biāo)準(zhǔn)，2015年東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程中心的白粉病發(fā)病特征符合P. xanthii生理小種1的發(fā)病特征，即認(rèn)為本試驗(yàn)中所有抗感分級及分離群體抗感鑒定均針對P. xanthii生理小種1。

2.2分離群體抗感反應(yīng)鑒定

在抗感反應(yīng)鑒定中（表2），母本MR-1與F1中未發(fā)現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)少量白粉病斑，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病性；而父本Top Mark被白粉病嚴(yán)重侵染，表現(xiàn)出較強(qiáng)的感病性；BC1P2中抗病單株21株，感病單株24株；F2群體中抗病單株為201株，感病單株為65株，經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合3∶1的分離比例（P＞0.05）。由此可知，MR-1中抗白粉病P. xanthii生理小種1的基因?yàn)轱@性單基因。

表2各世代群體對白粉病的抗感反應(yīng)

2.3甜瓜遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及QTL分析

利用203對CAPS引物對266個(gè)F2單株進(jìn)行基因型分析，構(gòu)建了一張包含12條連鎖群的遺傳連鎖圖譜，覆蓋基因組長度1 865.32 cM，標(biāo)記圖上位置與物理圖譜位置一一對應(yīng)，標(biāo)記間平均距離為9.19 cM。其中第9號染色體圖距最長，為186.22 cM，包含19個(gè)CAPS標(biāo)記；第1號染色體圖距最短，為69.28 cM，包含18個(gè)CAPS標(biāo)記（表3、圖2）。

表3甜瓜遺傳連鎖圖譜上的分子標(biāo)記分布

2.4白粉病抗病基因的染色體定位

基于本試驗(yàn)獲得的甜瓜遺傳連鎖圖譜和白粉病抗病表型鑒定結(jié)果，運(yùn)用QTL ICIMapping v4.0 軟件對白粉病抗病基因進(jìn)行QTL分析，共檢測到1個(gè)與甜瓜白粉病抗病相關(guān)的QTL，命名為PXR（圖2），PXR位于第12號染色體M12-GH與M12-TE標(biāo)記之間，與兩側(cè)翼標(biāo)記間的距離分別為0.63 cM和0.42 cM。LOD值為32.5，可解釋78.26%的表型變異率，加性效應(yīng)為0.399 9，顯性效應(yīng)為0.518 0。由于遺傳距離較小和貢獻(xiàn)率較高，說明PXR與兩側(cè)翼的標(biāo)記連鎖緊密且可以作為主效基因進(jìn)行下一步基因挖掘。

2.5候選基因確定及熒光定量分析

標(biāo)記M12-GH和M12-TE在染色體上的位置相距較近，分別位于第12號染色體22 623 096 bp和22 926 554 bp處，因此初步將PXR定位在12號染色體上物理距離303 kb的范圍內(nèi)，根據(jù)該區(qū)段內(nèi)的參考基因組的注釋信息及兩親本間序列的單核苷酸多態(tài)性信息，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)已注釋的甜瓜相關(guān)基因有60個(gè)，其中10個(gè)基因（MELO3C002434、MELO3C002437、M E L O 3 C 0 0 2 4 3 9、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 0、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 1、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 3、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 5、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 7、MELO3C002457、MELO3C002465）上包含了32個(gè)nsSNPs，并推測這10個(gè)基因?yàn)楹蜻x基因（表4）。經(jīng)過基因功能注釋，這些基因?yàn)殄^蛋白重復(fù)家族蛋白、熱休克蛋白、抗壞血酸氧化酶等。

圖2甜瓜F2群體構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜

在親本中對10個(gè)基因進(jìn)行熒光定量分析和表達(dá)量差異分析。結(jié)果表明（圖3），4個(gè)基因MELO3C002434、MELO3C002437、MELO3C002441、MELO3C002457在抗白粉病甜瓜MR-1中的表達(dá)量均大于同期感白粉病甜瓜Top Mark，并存在較大差異，但其他基因的表達(dá)量無明顯差別。由此推測：MELO3C002434、M E L O 3 C 0 0 2 4 3 7、M E L O 3 C 0 0 2 4 4 1、MELO3C002457更有可能是白粉病抗病基因。

表4基因功能注釋結(jié)果

圖3 10個(gè)基因在親本中表達(dá)量差異分析

3 結(jié)論與討論

甜瓜的高產(chǎn)量與高質(zhì)量是育種的主要目標(biāo)，白粉病的發(fā)生對甜瓜的產(chǎn)量與品質(zhì)產(chǎn)生了很大的危害，培育抗白粉病的甜瓜品種是控制甜瓜白粉病發(fā)生的有效途徑，為了從抗病材料中進(jìn)行抗病基因的挖掘，首先要對該抗病材料的抗病基因的遺傳特性進(jìn)行研究。甜瓜不同抗病材料中抗病基因的抗病機(jī)制與遺傳位置不同，遺傳模式也有所差別（寧雪飛 等，2013）。通常有單顯性基因（Liu et al.，2010）、不完全顯性基因（王建設(shè) 等，2005）、主效基因和微效基因（Barnes & Epps，1956）、多基因（Epinat et al.，1993）等。近年的研究結(jié)果大都符合單顯性基因控制白粉病抗性這一理論，部分研究出現(xiàn)不符合單基因孟德爾遺傳的抗病分離群體可能是由于存在偏分離現(xiàn)象或受到環(huán)境等因素的影響（Wang et al.，2011）。本試驗(yàn)結(jié)果也支持甜瓜白粉病抗性是由單顯性基因控制的理論。但是即使同一種甜瓜材料，隨著生理小種的不同，抗病基因與遺傳模式也不盡相同。

2016年于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽農(nóng)場定植相同群體，但13個(gè)鑒別寄主的鑒定結(jié)果表明，當(dāng)年當(dāng)?shù)匕l(fā)病白粉病病菌為P. xanthii生理小種2F，同本試驗(yàn)2015年該地區(qū)發(fā)病生理小種不同，相同親本MR-1與Top Mark雜交得到的F1表現(xiàn)出明顯的感病狀態(tài)，并且F2群體感病植株與抗病植株分離比例約為2∶1，不符合單基因模型，表明P. xanthii生理小種2F的抗病基因?yàn)殡[性遺傳，但基因遺傳模型比較復(fù)雜或還受到白粉病其他生理小種的干擾。由此推斷，本試驗(yàn)抗病親本MR-1中同時(shí)存在P. xanthii生理小種1和2F的抗病基因，且基因數(shù)量、位置和遺傳模型不同。

由于常規(guī)的PCR和Northern blot難以對基因的表達(dá)差異進(jìn)行準(zhǔn)確和快速的分析，人們通常選用qRT-PCR進(jìn)行候選基因的確定。Xu等（2015）采用qRT-PCR對20個(gè)黃瓜果肉厚度的候選基因進(jìn)行差異性表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)Csa2M058670.1基因在父母本之間表達(dá)量差異很大，從而確定其為黃瓜果肉厚度候選基因。Nie等（2015）在對pm5.1基因在親本間進(jìn)行熒光定量分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，這個(gè)基因與植物細(xì)胞壁厚度有關(guān)，因此在接種白粉病菌后表達(dá)量的改變說明pm5.1通過調(diào)控細(xì)胞壁厚度從而阻礙白粉病菌的入侵。本試驗(yàn)對10個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，比較它們在抗感甜瓜品種中的表達(dá)量差異，得到了4個(gè)差異性表達(dá)的基因作為甜瓜白粉病抗病的候選基因（MELO3C002434、MELO3C002437、MELO3C002441、MELO3C002457）。

在4個(gè)候選基因中，MELO3C002434與MELO3C002441為含錨蛋白重復(fù)序列的相關(guān)基因。前人在錨蛋白重復(fù)序列基因與植物抗病與抗逆的關(guān)系中有一些相關(guān)研究，水稻XB3是一個(gè)泛素連接酶E3，其中含有RING指結(jié)構(gòu)域和錨蛋白重復(fù)序列，它與水稻中響應(yīng)生物脅迫信號的類受體激酶XA21相結(jié)合，調(diào)節(jié)水稻對白葉枯病的抗性。擬南芥中含有的XBAT35基因中含有錨蛋白重復(fù)序列，通過參與乙烯信號的負(fù)調(diào)過程，從而對脅迫產(chǎn)生免疫機(jī)制（劉士揚(yáng)，2014）。MELO3C002457為類似過氧化物酶基因，在低溫脅迫過程中，起著清除自由基的作用，避免自由基大量積累損害膜系統(tǒng)（沈麗雯，2015）。侯建設(shè)等（2009）通過熱激處理青椒，來提高過氧化物酶等的活性，從而顯著降低低溫冷藏過程中的冷害。而在基因功能注釋的結(jié)果中，MELO3C002437并未顯示出具有已報(bào)道的基因功能，所以對候選基因的確認(rèn)還需要進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)對白粉病抗病基因定位的研究表明，2015年東北農(nóng)業(yè)大學(xué)設(shè)施園藝工程中心的白粉病優(yōu)勢生理小種為P. xanthii生理小種1，甜瓜高抗白粉病品種MR-1對P. xanthii生理小種1的抗性由單顯性基因控制。經(jīng)過QTL和qRT-PCR分析，得到了1個(gè)303 kb的基因組區(qū)域，并初步確認(rèn)該區(qū)域內(nèi)的4個(gè)基因?yàn)樘鸸习追鄄】共『蜻x基因，為下一步的基因克隆以及基因功能驗(yàn)證提供了理論依據(jù)。

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Melon Powdery Mildew Resistance Gene Location and Candidate Gene Analysis

LI Bing1，2，ZHAO Yu-long1，2，ZHU Qiang-long1，2，ZHANG Zhi-peng1，2，F(xiàn)AN Chao2，3，LUAN Fei-shi1，2*，GAO Peng1，2*

〔1KeyLaboratoryofBiologyandGeneticImprovementofHorticulturalCrops（NortheastRegion），Ministryof Agriculture，Harbin150030，Heilongjiang，China；2HorticultureandLandscapeArchitectureCollegeofNortheast AgriculturalUniversity，Harbin150030，Heilongjiang，China；3HainanBaseofHeilongjiangAcademyofAgricultural Sciences，Sanya572000，Hainan，China〕

BC1P2and F2generations were constructed by crossing a melon inbred line ‘MR-1’ highlyresistant to powdery mildew（Podosphaera xanthii）as female parent，and a melon inbred line ‘Top Mark’highly susceptible to powdery mildew as male parent. The race ofP. xanthiiwas identified as race 1 according to the infecting action of 13 international differential hosts for melon powdery mildew，and the resistance to powdery mildew was controlled by a single dominant gene based on the population genetic analysis of BC1P2and F2. Through evaluating the resistance in 266 individuals of F2，the genotype analysis using cleaved amplified polymorphic sequences（CAPS），and quantitative trait loci（QTL）analysis using composite interval mapping method（CIM）for locating the locus resistant to powdery mildew，a genetic linkage map of melon contained 203 CAPS was constructed. One QTL namedPXRwas detected on chromosome 12 between the 2 CAPS markers，M12-GH and M12-TE，which were tightly linked to the gene resistant to powdery mildew with the genetic distances of 0.63 cM and 0.42 cM，respectively. Sixty putative genes were located in the region with the length of 303 kb between the 2 flanking markers. Ten of them with non-synonymous single nucleotide polymorphism（nsSNP）were further identified as candidate genes resistant to powdery mildew in melon. The results suggested that 4 genes（MELO3C002434，MELO3C002437，MELO3C002441，andMELO3C002457）showed bigger differences in expression of disease resistance and susceptible might be the candidate genes resistant to powdery mildew in melon.

Melon；Powdery mildew；CAPS；Disease resistance gene

李冰，女，碩士研究生，專業(yè)方向：甜瓜分子遺傳育種，E-mail：1332142074@qq.com

*通訊作者（Corresponding authors）：欒非時(shí)，女，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：西甜瓜分子遺傳育種，E-mail：luanfeishi@neau.edu.cn；高鵬，男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：西甜瓜分子遺傳育種，E-mail：gaopeng_neau@163.com

2016-12-22；接受日期：2017-03-13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301791，31672177），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“學(xué)術(shù)骨干”計(jì)劃項(xiàng)目（16XG06），東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“青年才俊”計(jì)劃項(xiàng)目（14QC09），國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系-分子育種崗位項(xiàng)目（CARS-26-02）