• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    慢性蜜蜂麻痹病毒中國(guó)株RNA1序列克隆及進(jìn)化分析

    2017-06-08 05:50:53李貝貝侯春生刁青云
    中國(guó)蜂業(yè) 2017年5期
    關(guān)鍵詞:進(jìn)化樹克隆蜜蜂

    李貝貝 侯春生 刁青云

    (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所,北京100093)

    慢性蜜蜂麻痹病毒中國(guó)株RNA1序列克隆及進(jìn)化分析

    李貝貝 侯春生 刁青云

    (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所,北京100093)

    慢性麻痹病是成蜂中的一種傳染性疾病,患病蜜蜂呈現(xiàn)一些神經(jīng)性行為如顫抖、爬行,能引起兩種不同的癥狀,可導(dǎo)致蜜蜂體表發(fā)黑光亮無毛或腹部膨大。該病的病原體是慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,以下簡(jiǎn)稱CBPV),對(duì)其致病性起決定性作用的是RNA依賴RNA聚合酶(RdRp),而RdRp位于CBPV基因組的RNA1片段上。為了深入理解CBPV的感染特點(diǎn)及致病機(jī)理,本文克隆中國(guó)北京株CBPV RNA1的全基因組序列并對(duì)其進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析,為深入開展病毒研究提供信息數(shù)據(jù)。

    慢性蜜蜂麻痹病毒;序列分析;RNA依賴的RNA聚合酶;進(jìn)化特點(diǎn)

    1 引言

    蜜蜂是糧食作物開花授粉的重要媒介昆蟲之一,不僅為人類提供多種多樣的蜂產(chǎn)品而且通過授粉產(chǎn)生更大的經(jīng)濟(jì)效益。在世界農(nóng)業(yè)范圍內(nèi)蜜蜂通過授粉創(chuàng)造的價(jià)值約為1750億美元[1],僅在歐洲和北美大約為170~180億美元[2,3]。但是蜜蜂的健康正受到多個(gè)病原及環(huán)境壓力的影響,從寄生性瓦螨、RNA病毒和微孢子蟲等致病因子到環(huán)境中的農(nóng)藥等,都會(huì)導(dǎo)致蜂群數(shù)量持續(xù)下降[4,5]。尤其是自2007年發(fā)現(xiàn)IAPV是引起蜜蜂崩潰癥的主要病毒之一,病毒病被發(fā)現(xiàn)在全球分布廣泛且危害巨大。同樣,CBPV在近兩年對(duì)我國(guó)蜂群造成了較大的影響,分布也較廣。

    慢性麻痹病是成蜂中的一種傳染性疾病,在1963年被首次發(fā)現(xiàn)[6]。其感染主要的癥狀是:行為上,患病蜜蜂身體顫抖,翅膀不對(duì)稱外翻狀態(tài)和只能在地上爬行不能飛行,幾天后巢門口聚集大量死蜂;體表上,蜜蜂體色發(fā)黑或腹部膨大。大多數(shù)情況下主要通過食物和表皮傷口傳播,健康蜂通過與病蜂接觸或者哺育蜂清理病蜂糞便時(shí)被感染[7]。

    CBPV是長(zhǎng)度30~60 nm,寬度20 nm的非等軸無包膜病毒粒子[8]。它是單鏈正義RNA病毒,由兩段基因組成,分別是 RNA1和 RNA2,已知的參考株(EU122229)RNA1長(zhǎng)度3674個(gè)核苷酸,(EU122230)RNA2包含2305個(gè)核苷酸[9],有實(shí)驗(yàn)顯示CBPV的RNA3’端不含多聚腺苷酸尾但有一個(gè)閉鎖結(jié)構(gòu),5’端有一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)。RNA1和RNA2分別編碼三個(gè)和四個(gè)開放閱讀框[9]。Olivier V在2002年提交了兩個(gè)基因序列 CBPV-B-441(EU122231) 和 CBPV A-79P(EU122229),兩個(gè)序列長(zhǎng)度分別為3658 nt和3678 nt[9]。Philippe Blanchard擴(kuò)增獲得9個(gè)國(guó)家(奧地利、比利時(shí)、丹麥、法國(guó)、匈牙利、波蘭、西班牙、瑞士、烏拉圭)22個(gè)蜜蜂樣品中的CBPV RNA1的ORF3序列,序列號(hào)從FJ345306到FJ345327長(zhǎng)度為1947 nt,以獲得不同地區(qū)CBPV的親緣關(guān)系[10]。Kojima在Genbank提交了日本株 CBPV RdRp區(qū)序列,序列號(hào)從 AB682795到AB682799,長(zhǎng)度都為469 nt。吳艷艷等擴(kuò)增中國(guó)地區(qū)17個(gè)蜜蜂樣品的CBPV RNA1 RdRp區(qū)序列,序列號(hào)從KM036169到KM036185,長(zhǎng)度都不超過400 bp[11]。至今為止CBPV并未被病毒國(guó)際分類委員會(huì)進(jìn)行種屬分類(ICTV),只有RNA1中的ORF3區(qū)與野田病毒科和番茄矮叢病毒科同源性較高,因此推測(cè)RNA1的ORF1和ORF3編碼非結(jié)構(gòu)蛋白,RNA2的ORF2和ORF3編碼結(jié)構(gòu)蛋白[12]。CBPV RNA1中包含許多重要信息,大多數(shù)研究克隆序列較短,Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中僅有三條全基因組序列。因此本研究通過克隆獲得北京CBPV RNA1的全基因組序列,以期獲得更多的病毒信息。

    2 材料與方法

    2.1 樣本采集

    在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所內(nèi)采集有明顯黑腹癥狀的意大利蜜蜂(Apis mellifera mellifera)爬蜂,采集的樣品迅速放置于-80℃冰箱保存。

    2.2 RNA提取

    將蜜蜂樣品置于1.5 ml無菌管中,用電動(dòng)組織研磨器在液氮中將蜜蜂研磨成細(xì)粉狀,隨后加入Trizol(Invitrogen美國(guó)),之后用氯仿和異丙醇按照RNA提取操作步驟提取RNA,用TE溶解,在-20℃冰箱中保存。

    2.3 反轉(zhuǎn)錄、PCR和克隆

    按照反轉(zhuǎn)錄(Promega美國(guó))試劑盒說明書合成cDNA,使用Primer 5.0依據(jù)實(shí)驗(yàn)要求共設(shè)計(jì)5對(duì)引物,覆蓋CBPV的全長(zhǎng),引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    克隆CBPV各個(gè)片段。PCR反應(yīng)液:cDNA模板為1 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl,2×Es Taq Master-Mix(康為世紀(jì)中國(guó))10 μl,無菌水7 μl。反應(yīng)條件為:94℃3 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃0.5~2 min(由克隆片段長(zhǎng)度決定),共34個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳,使用膠回收試劑盒(天根中國(guó))回收目的條帶。

    按照全試金克隆試劑盒說明書(全試金中國(guó))將目的片段連接到pEASY-T1載體上,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中,進(jìn)行陽性克隆檢測(cè),將陽性菌株送去生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

    2.4 CBPV RNA1全長(zhǎng)及RdRp進(jìn)化樹構(gòu)建

    目前在GenBank上公布的CBPV RNA1全基因組序列僅有3株,名稱及登錄號(hào)分別為:France B-441 (EU122231)、France A-79P (EU122229)、China LN(KU950353)。將本實(shí)驗(yàn)中得到的序列KX168412與這3株CBPV RNA1序列構(gòu)建進(jìn)化樹,并以以色列急性麻痹病毒IAPV(EU218534)全基因組序列作為進(jìn)化樹外群,用Mega6分析軟件中的Clustal W程序進(jìn)行多重序列對(duì)齊分析,使用鄰接法(Neighbour-Joining)Bootstrap重復(fù)1000次構(gòu)建進(jìn)化樹。

    在GenBank上公布的CBPV RNA1序列中能夠全部覆蓋RdRp區(qū)的序列共25條,使用Mega6軟件分析中的Clustal W程序?qū)@25株和本文得到的序列進(jìn)行多重序列對(duì)齊分析,使用鄰接法(Neighbour-Joining)Bootstrap重復(fù)1000次構(gòu)建進(jìn)化樹。

    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

    3.1 CBPV基因拼接及全基因組進(jìn)化樹分析

    使用DNAman將5段CBPV RNA1序列拼接在一起,基因總長(zhǎng)度為3657 nt的序列,提交Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為KX168412。將 KX168412與其他三株CBPV RNA1序列共同構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果如圖1所示,括號(hào)中為各個(gè)序列的登錄號(hào)。

    圖1 CBPV RNA1全基因組系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

    通過 NCBI中的 BLAST將本文中所獲得的KX168412與全部3株CBPV RNA1基因組序列進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果顯示China BJ(KX168412)與China LN(KU950353)相似度最高為98%,其次為France B-441 (EU122231)相似度為 96%,與 France A-79P (EU122229)相似度最低91%。

    全基因組序列進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示,所有CBPV RNA1基因型都區(qū)別于IAPV的全基因組序列。在CBPV RNA1基因型中,進(jìn)化樹主要是一個(gè)大的分支,其中,F(xiàn)rance B-441(EU122231)與 France A-79P (EU122229)的同源性最高;China BJ(KX168412)與China LN(KU950353)的同源性高,在進(jìn)化關(guān)系上KX168412要高于France B-441(EU122231)、France A-79P(EU122229)、China LN(KU950353)。

    3.2 CBPV RNA1 BJ株全基因結(jié)構(gòu)及RdRp區(qū)進(jìn)化分析

    使用DNAman預(yù)測(cè)CBPV RNA1的ORF區(qū),經(jīng)預(yù)測(cè),China BJ(KX168412)含有三個(gè)ORF區(qū)域,包括ORF1(19-2575)、ORF2(32-887)、ORF3(1643-3587)。

    使用Mega6采用鄰近法,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,對(duì)已克隆并測(cè)序的China BJ(KX168412)序列的RdRp區(qū)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的其他已報(bào)道25條CBPV毒株(長(zhǎng)度為1974 nt)構(gòu)建進(jìn)化樹。圖2進(jìn)化樹結(jié)果顯示,有四個(gè)主要的集群,第一個(gè)集群包括一個(gè)法國(guó)株序列,兩個(gè)瑞士株序列和所有的波蘭株、奧地利株、丹麥株和匈牙利株;第二個(gè)集群包括兩個(gè)烏拉圭株;第三個(gè)集群包括三個(gè)法國(guó)株和一個(gè)瑞士株、一個(gè)烏拉圭株、兩個(gè)中國(guó)株序列;第四個(gè)集群包括法國(guó)株、西班牙株和比利時(shí)株。本文 得 到 的 China BJ(KX168412) 與 China LN(KU950353)的同源性最高,其次與France B-441、Switzerland R3 C10和Uruguay 6-M同源性較為相近。

    圖2 不同國(guó)家CBPV RNA1 RdRp區(qū)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

    4 討論

    NCBI最長(zhǎng)的CBPV RNA1基因序列是法國(guó)株,其序列號(hào)是EU122229,長(zhǎng)度為3674 nt,比China BJ (KX168412)長(zhǎng)17 nt[9]。經(jīng)Blast比對(duì),本文中所得到RNA1的序列與法國(guó)株(EU122229)序列的同源性達(dá)到98%。

    RdRd是病毒復(fù)制的關(guān)鍵酶,對(duì)于病毒的傳播和表達(dá)具有重要意義。Olivier V在2008年推測(cè)RNA1的ORF3氨基酸序列可能編碼RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)區(qū)域[9]。經(jīng)過比對(duì)發(fā)現(xiàn)我們克隆所得到的ORF3區(qū)與多個(gè)病毒的RdRd區(qū)高度相似。Olivier V的分析表明CBPV法國(guó)株介于番茄叢矮病毒科和野田村病毒科之間,但并不屬于任何病毒科。因此選擇ORF3區(qū)與其他國(guó)家CBPV病毒株進(jìn)行進(jìn)化樹分析,以期獲得更多關(guān)于CBPV分類的信息。

    用 ORF Finder對(duì) GenBank上其他 3株 CBPV RNA1全基因組序列進(jìn)行分析,預(yù)測(cè)開放閱讀框結(jié)果顯示四株序列都含有3個(gè)ORF區(qū)。其中France B-441 (EU122231)、France A-79P(EU122229)和 China BJ (KX168412)三條序列的三個(gè)ORF區(qū)所含氨基酸數(shù)目相等,分別是852(ORF1)、285(ORF2)、648(ORF3)個(gè)氨基酸,而China LN(KU950353)序列的ORF1區(qū)含有784個(gè)氨基酸,比上述三株序列中的ORF1區(qū)少68個(gè)氨基酸。

    進(jìn)化分析結(jié)果顯示烏拉圭株、瑞士株和法國(guó)株出現(xiàn)在多個(gè)集群中,沒有明顯的地域差異。第一集群中的CBPV RdRp序列主要集中在歐洲北部和東部;第二個(gè)集群主要集中在南美洲;第四個(gè)分支主要包括歐洲的南部和西部;第三個(gè)集群包括法國(guó)株、瑞士株、烏拉圭株和兩個(gè)中國(guó)株序列,其中兩個(gè)中國(guó)株序列聚為同一類,同源性較為相近,屬亞洲區(qū)域,但是從整體上看這一分支中的CBPV并無明顯地域差異,可能與頻繁的商業(yè)交換或者病毒變異有關(guān)。另外法國(guó)株序列出現(xiàn)在三個(gè)分支中,出現(xiàn)比例明顯高于其它地區(qū)CBPV株。因此可能需要更多的CBPV RdRp序列才能得到更詳細(xì)和精確的地域差異。

    [1]Gallai N,Salles J M,Settele J,et al.Economic valuation of the vulnerability of world agriculture confronted with pollinator decline [J].Ecol Econ,2009,68(3):810-821.

    [2]Calderone N W.Insect pollinated crops,insect pollinators and US agriculture:trend analysis of aggregate data for the period 1992-2009[J].Plos one,2012,7(5):e37235.

    [3]Leonhardt S D,Gallai N,Alejandro Garibaldi L,et al.Economic gain,stability of pollination and bee diversity decrease from southern to northern Europe[J].Basic Appl Ecol,2013,14(6):461-471.

    [4]Benjamin A,McCallum B.A World Without Bees[M].Guardian Books,2008.

    [5]Ratnieks F L W,Carreck N L.Carity on honey bee collapse[J]? Science,2010,327(5962):152-153.

    [6]Bailey L,Gibbs A J,Woods R D.The purification and properties of chronic bee-paralysis virus[J].Journal of General Virology, 1968,2(2):251-260.

    [7]Ribière M,Lallemand P,Iscache A L,et al.Spread of infectious chronic bee paralysis virus by honeybee(Apis mellifera L.)feces[J]. Applied and Environmental Microbiology,2007,73(23):7711-7716.

    [8]Bailey L,Gibbs A J,Woods RD.The purification and properties of chronic bee-paralysis virus[J].Journal of General Virology,1968, 2(2):251-260.http://dx.doi.org/10.1099/0022-1317-2-2-251.

    [9]Olivier V,Blanchard P,Chaouch S,et al.Molecular characterization and phylogenetic analysis of chronic bee paralysis virus,a honey bee virus[J].Virus Research,2008,132(1-2):59-68.

    [10]Blanchard P,Schurr F,Olivier V,et al.Phylogenetic analysis of the RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)and a predicted structural protein(pSP)of the Chronic bee paralysis virus(CBPV) isolate from various geographic regions[J].Virus Research,2009, 144(1-2):334-338.

    [11]Wu YY,Jia HR,Wang Q,et al.Multiple virus infections and the characteristics of chronic bee paralysis virus in diseased honey bees(Apis Mellifera L.)in China[J].Journal of Apicultural Science, 2015,59(2):95-106.

    [12]Ribière M,Olivier V,Blanchard P.Chronic bee paralysis:a disease and a virus like no other[J].Journal of Invertebrate Pathology,2010,103(Suppl.1):S120-S131.

    Clone and Phylogenetic Analysis of Chronic Bee Paralysis Virus China RNA1 Sequence

    Li Beibei,Hou Chunsheng,Diao Qingyun
    (Institute of Apicultural Research,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100093)

    Chronic bee paralysis virus is a contagious disease of adult honeybees,and diseased bee displayed several neurological symptoms such as trembling,crawling.And it can induce two kinds of significant different symptoms,black bright hairless or bloated abdomen.The pathogen of this disease is Chronic bee paralysis virus(CBPV), and RNA-dependent RNA polymerase(RdRp)plays a vital role in the pathogenesis for the CBPV and positioned at the RNA 1 segment of CBPV genome.In order to better understand the mechanism of CBPV,we cloned the full genome of RNA 1 of CBPV and made a phylogenetic analysis on that.These results provided the fundamental data for studying the infection characterization of CBPV.

    Chronic bee paralysis virus;phylogenetic analysis;RNA-dependent RNA polymerase;evolution characteristics

    中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-2017-IAR)

    李貝貝(1991-),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槊鄯洳∠x害,E-mail:15600928925@163.com

    刁青云,女,研究員,從事蜜蜂病害研究工作,E-mail:dqyun1@126.com

    猜你喜歡
    進(jìn)化樹克隆蜜蜂
    克隆狼
    基于心理旋轉(zhuǎn)的小學(xué)生物進(jìn)化樹教學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告
    常見的進(jìn)化樹錯(cuò)誤概念及其辨析*
    浙江:誕生首批體細(xì)胞克隆豬
    蜜蜂
    艾草白粉病的病原菌鑒定
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    蜜蜂
    蜜蜂
    蜜蜂谷
    男女高潮啪啪啪动态图| 久久国产亚洲av麻豆专区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 日日爽夜夜爽网站| 成人国产av品久久久| 免费在线观看黄色视频的| a级毛片在线看网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| av福利片在线| 97在线视频观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 水蜜桃什么品种好| 美女视频免费永久观看网站| 久久久国产欧美日韩av| 亚洲性久久影院| 夫妻性生交免费视频一级片| 中文天堂在线官网| 国产男女内射视频| 精品国产国语对白av| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 在线看a的网站| 亚洲欧美精品自产自拍| 欧美精品国产亚洲| 国精品久久久久久国模美| 最近手机中文字幕大全| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 午夜福利,免费看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 色94色欧美一区二区| 亚洲第一av免费看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av网站免费在线观看视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲美女搞黄在线观看| 日本欧美国产在线视频| 成人无遮挡网站| 美女内射精品一级片tv| 美女福利国产在线| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日韩三级伦理在线观看| 最黄视频免费看| 日本黄大片高清| 黄色配什么色好看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产激情久久老熟女| 久久综合国产亚洲精品| 一本大道久久a久久精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 日本91视频免费播放| 日韩成人伦理影院| 成年美女黄网站色视频大全免费| 最黄视频免费看| 国产精品免费大片| 国产亚洲精品久久久com| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美日韩成人在线一区二区| 岛国毛片在线播放| 久久久国产欧美日韩av| 黄片无遮挡物在线观看| 久久久精品免费免费高清| 国产一级毛片在线| 亚洲五月色婷婷综合| 三上悠亚av全集在线观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产精品无大码| 男女国产视频网站| 伦理电影免费视频| 七月丁香在线播放| 秋霞伦理黄片| 18禁动态无遮挡网站| 熟妇人妻不卡中文字幕| 久久久久久人妻| 亚洲美女搞黄在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 自线自在国产av| 午夜影院在线不卡| 国产精品不卡视频一区二区| 久久久久久久久久成人| 亚洲成色77777| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 日本午夜av视频| 日韩精品有码人妻一区| 啦啦啦在线观看免费高清www| 热re99久久国产66热| 9191精品国产免费久久| 99久久综合免费| 国产1区2区3区精品| 最后的刺客免费高清国语| 日本vs欧美在线观看视频| 日韩精品有码人妻一区| 国产熟女欧美一区二区| 午夜日本视频在线| 久久久国产一区二区| 美女内射精品一级片tv| 成人二区视频| 热99久久久久精品小说推荐| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲av中文av极速乱| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲欧美清纯卡通| 国产亚洲一区二区精品| 久久婷婷青草| 波多野结衣一区麻豆| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久久久网色| 欧美3d第一页| 天堂中文最新版在线下载| 久久这里只有精品19| av天堂久久9| 最近手机中文字幕大全| 激情视频va一区二区三区| a级毛色黄片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 成人亚洲精品一区在线观看| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 大码成人一级视频| 人妻人人澡人人爽人人| av黄色大香蕉| 久久国产精品大桥未久av| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 天美传媒精品一区二区| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 极品人妻少妇av视频| 青春草亚洲视频在线观看| 另类精品久久| 免费看光身美女| 一区二区三区精品91| 亚洲精品乱久久久久久| 精品酒店卫生间| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 国产成人免费无遮挡视频| 免费看av在线观看网站| 少妇精品久久久久久久| 老司机影院毛片| 国产精品偷伦视频观看了| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 妹子高潮喷水视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美人与性动交α欧美软件 | 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 桃花免费在线播放| 欧美另类一区| 久热久热在线精品观看| 午夜福利,免费看| 2022亚洲国产成人精品| 国产激情久久老熟女| 亚洲av综合色区一区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 满18在线观看网站| 少妇的丰满在线观看| av女优亚洲男人天堂| 国产成人精品一,二区| 亚洲成色77777| 男女免费视频国产| 丰满迷人的少妇在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久久久久人妻| av有码第一页| 一级毛片 在线播放| 日韩免费高清中文字幕av| av在线老鸭窝| 国产在线免费精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 黄色怎么调成土黄色| 午夜激情av网站| 老女人水多毛片| 夫妻性生交免费视频一级片| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品久久久久成人av| 另类精品久久| 22中文网久久字幕| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久久网色| 亚洲成av片中文字幕在线观看 | 亚洲美女搞黄在线观看| 在线看a的网站| 丰满迷人的少妇在线观看| 国产在线一区二区三区精| 亚洲精品aⅴ在线观看| 伦理电影免费视频| 午夜影院在线不卡| 两性夫妻黄色片 | 91精品三级在线观看| www.色视频.com| 欧美精品亚洲一区二区| 人体艺术视频欧美日本| 黄片播放在线免费| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 免费观看a级毛片全部| av电影中文网址| 亚洲精品一二三| 亚洲av.av天堂| 欧美xxxx性猛交bbbb| 九草在线视频观看| 一级毛片电影观看| 老女人水多毛片| 成人手机av| 一级毛片我不卡| 久久久欧美国产精品| 亚洲美女视频黄频| 久久精品久久久久久久性| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| av国产精品久久久久影院| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产黄频视频在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 久久久久国产网址| 中文字幕最新亚洲高清| 国产又爽黄色视频| 精品久久久久久电影网| 性色av一级| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产成人av激情在线播放| 日本91视频免费播放| 久久99蜜桃精品久久| 我要看黄色一级片免费的| 色5月婷婷丁香| 亚洲国产欧美在线一区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 哪个播放器可以免费观看大片| 国产亚洲精品久久久com| 国产免费又黄又爽又色| 欧美bdsm另类| 久久国内精品自在自线图片| 久久毛片免费看一区二区三区| freevideosex欧美| 久久97久久精品| 黄色 视频免费看| 免费看光身美女| 中文字幕人妻熟女乱码| av国产久精品久网站免费入址| 18禁动态无遮挡网站| 久久久久国产网址| 在线观看三级黄色| 国产 精品1| 热99久久久久精品小说推荐| 观看av在线不卡| 亚洲国产最新在线播放| 青春草视频在线免费观看| 边亲边吃奶的免费视频| 男女边吃奶边做爰视频| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 高清视频免费观看一区二区| 亚洲国产av新网站| 在现免费观看毛片| 宅男免费午夜| www.色视频.com| 一区二区三区乱码不卡18| 久久精品国产亚洲av天美| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av在线老鸭窝| 边亲边吃奶的免费视频| 精品久久久精品久久久| 精品视频人人做人人爽| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲伊人色综图| 插逼视频在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 性色av一级| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美性感艳星| 国产色爽女视频免费观看| 亚洲天堂av无毛| 亚洲综合精品二区| 少妇高潮的动态图| 国产精品免费大片| 日本91视频免费播放| 日韩av不卡免费在线播放| 在线观看美女被高潮喷水网站| 精品一区二区三卡| 91国产中文字幕| videossex国产| 在线观看免费视频网站a站| 美女国产视频在线观看| 老司机亚洲免费影院| 热99久久久久精品小说推荐| 精品国产乱码久久久久久小说| 大片免费播放器 马上看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 天天操日日干夜夜撸| 国产视频首页在线观看| 久久久久久久国产电影| 欧美日本中文国产一区发布| 七月丁香在线播放| 国产老妇伦熟女老妇高清| 男女无遮挡免费网站观看| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲精品成人av观看孕妇| 熟女人妻精品中文字幕| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 两个人免费观看高清视频| 成人亚洲欧美一区二区av| 日本午夜av视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 老司机亚洲免费影院| 婷婷成人精品国产| 在线观看免费视频网站a站| 捣出白浆h1v1| 久久免费观看电影| 国产成人91sexporn| 在线观看美女被高潮喷水网站| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美成人午夜精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 在线天堂中文资源库| 美女大奶头黄色视频| 中国三级夫妇交换| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日韩一区二区三区影片| 精品一品国产午夜福利视频| 黑丝袜美女国产一区| 18在线观看网站| 少妇的丰满在线观看| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 亚洲国产色片| 日韩电影二区| 精品熟女少妇av免费看| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 一边亲一边摸免费视频| 成人无遮挡网站| 乱人伦中国视频| 精品一品国产午夜福利视频| 色94色欧美一区二区| 日韩av不卡免费在线播放| 99热国产这里只有精品6| 久久精品久久精品一区二区三区| 日韩 亚洲 欧美在线| av视频免费观看在线观看| 制服丝袜香蕉在线| 少妇人妻 视频| 9色porny在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| av在线老鸭窝| 全区人妻精品视频| 亚洲国产精品专区欧美| 人人澡人人妻人| 最近2019中文字幕mv第一页| 成年av动漫网址| 深夜精品福利| 22中文网久久字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 性色avwww在线观看| 香蕉精品网在线| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲精品色激情综合| 综合色丁香网| 亚洲综合精品二区| 久热久热在线精品观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 日韩一区二区视频免费看| 哪个播放器可以免费观看大片| 婷婷色综合www| 免费在线观看完整版高清| 中国三级夫妇交换| 国产在线一区二区三区精| 成人毛片60女人毛片免费| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久久久人人人人人| 日韩精品有码人妻一区| 涩涩av久久男人的天堂| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲精品自拍成人| 国产精品嫩草影院av在线观看| 人妻一区二区av| 观看美女的网站| 亚洲丝袜综合中文字幕| 美女国产视频在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 欧美 日韩 精品 国产| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 97在线视频观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 久久99蜜桃精品久久| 成人无遮挡网站| 国产精品久久久久久久电影| 校园人妻丝袜中文字幕| 18+在线观看网站| 精品久久久久久电影网| 欧美日韩av久久| 捣出白浆h1v1| 国产精品无大码| 日本av手机在线免费观看| 极品人妻少妇av视频| 久久韩国三级中文字幕| 在线观看一区二区三区激情| 男人操女人黄网站| 视频中文字幕在线观看| 曰老女人黄片| 一个人免费看片子| 日本-黄色视频高清免费观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 美女大奶头黄色视频| 欧美性感艳星| 日本wwww免费看| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久精品国产综合久久久 | 精品国产国语对白av| 精品人妻一区二区三区麻豆| 伦精品一区二区三区| 欧美日韩精品成人综合77777| 亚洲,一卡二卡三卡| 久久人人97超碰香蕉20202| 国产男女超爽视频在线观看| 成人国语在线视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费人成在线观看视频色| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产视频首页在线观看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 最近中文字幕2019免费版| www.色视频.com| 制服人妻中文乱码| 久久精品夜色国产| 国产xxxxx性猛交| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产乱来视频区| 十八禁网站网址无遮挡| 伦理电影大哥的女人| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产精品女同一区二区软件| 国产精品蜜桃在线观看| 大香蕉久久网| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 五月天丁香电影| 天天影视国产精品| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 国产综合精华液| 人妻系列 视频| 看免费成人av毛片| 国产成人91sexporn| 国产免费一区二区三区四区乱码| 欧美+日韩+精品| 中文字幕最新亚洲高清| 精品一品国产午夜福利视频| 久久久久视频综合| 日日啪夜夜爽| 少妇被粗大猛烈的视频| 另类精品久久| 亚洲av中文av极速乱| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 午夜福利视频在线观看免费| 哪个播放器可以免费观看大片| 秋霞在线观看毛片| 国产免费福利视频在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产探花极品一区二区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日韩av在线免费看完整版不卡| 美女国产高潮福利片在线看| 国产免费福利视频在线观看| 婷婷色综合www| 国产免费现黄频在线看| 亚洲情色 制服丝袜| 国产又色又爽无遮挡免| 色哟哟·www| 夜夜爽夜夜爽视频| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲,欧美,日韩| 免费在线观看完整版高清| 街头女战士在线观看网站| www.熟女人妻精品国产 | 亚洲精品久久午夜乱码| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 在线天堂最新版资源| 亚洲成国产人片在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久欧美国产精品| 日本黄大片高清| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲第一av免费看| 国产不卡av网站在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 国产爽快片一区二区三区| 日本午夜av视频| 热re99久久国产66热| 久久精品国产亚洲av涩爱| 伦理电影免费视频| 18禁国产床啪视频网站| 两个人看的免费小视频| 午夜影院在线不卡| 亚洲成国产人片在线观看| www.av在线官网国产| 乱码一卡2卡4卡精品| 两性夫妻黄色片 | 99视频精品全部免费 在线| 色哟哟·www| 一级爰片在线观看| 观看av在线不卡| 午夜影院在线不卡| 9色porny在线观看| 亚洲在久久综合| 日韩伦理黄色片| 国产xxxxx性猛交| 亚洲欧洲日产国产| 热99久久久久精品小说推荐| 久久人人爽人人爽人人片va| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 在线精品无人区一区二区三| 男女国产视频网站| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品欧美亚洲77777| 国产高清三级在线| 日本色播在线视频| 国产精品蜜桃在线观看| 在线观看三级黄色| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 黄网站色视频无遮挡免费观看| 大话2 男鬼变身卡| 国产精品久久久久久精品电影小说| 天堂中文最新版在线下载| 曰老女人黄片| 22中文网久久字幕| 在线观看www视频免费| 波多野结衣一区麻豆| 国产xxxxx性猛交| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲精品自拍成人| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲情色 制服丝袜| 精品国产一区二区三区四区第35| 一区在线观看完整版| 午夜激情av网站| 黑丝袜美女国产一区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产淫语在线视频| 最新中文字幕久久久久| 亚洲精品第二区| 国产免费福利视频在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 一级黄片播放器| 人体艺术视频欧美日本| 桃花免费在线播放| 晚上一个人看的免费电影| 伊人亚洲综合成人网| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产精品 国内视频| 国产1区2区3区精品| 日韩电影二区| 26uuu在线亚洲综合色| 曰老女人黄片| 五月开心婷婷网| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 午夜91福利影院| 少妇精品久久久久久久| 制服诱惑二区| 高清av免费在线| 男人舔女人的私密视频| 免费大片黄手机在线观看| 亚洲中文av在线| 成人国语在线视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 大香蕉久久网| 久久综合国产亚洲精品| 精品视频人人做人人爽| 桃花免费在线播放| 国产精品蜜桃在线观看| 18在线观看网站| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美人与性动交α欧美软件 | 亚洲成人av在线免费| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲精品456在线播放app| 1024视频免费在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产精品一区二区在线观看99| 国产精品久久久久成人av| 91在线精品国自产拍蜜月| 秋霞伦理黄片| 国产精品一区二区在线不卡| 捣出白浆h1v1| 最近手机中文字幕大全| 国产成人精品无人区| 国产黄色视频一区二区在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 老女人水多毛片| 中文字幕最新亚洲高清| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 在现免费观看毛片|