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    仿生蜂巢花粉制備方法及其活性成分測定的研究

    2017-06-08 05:50:53楊茂森張世文王鑫劉占莉
    中國蜂業(yè) 2017年5期
    關(guān)鍵詞:蜂花粉蜂巢花粉

    楊茂森 張世文 王鑫 劉占莉

    (甘肅省蜂業(yè)技術(shù)推廣總站,天水741020)

    仿生蜂巢花粉制備方法及其活性成分測定的研究

    楊茂森 張世文 王鑫 劉占莉

    (甘肅省蜂業(yè)技術(shù)推廣總站,天水741020)

    蜂巢花粉是蜜蜂真正的天然食物,是蜜蜂采集植物花粉過程或在蜂房內(nèi)摻入自身唾液與蜂蜜后釀造成熟的產(chǎn)品,蜜蜂及其幼蟲缺食蜂巢花粉,將造成群勢下降、幼蟲不能完全羽化。根據(jù)蜜蜂釀制花粉的原理,我們采用多級發(fā)酵技術(shù),確立了仿生蜂巢花粉的制備方法;通過蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉(三種材料都是油菜花粉)對比研究試驗,發(fā)現(xiàn)仿生蜂巢花粉中的活性化學(xué)成分含量高于蜂花粉、蜂巢花粉的含量。通過對不同花粉淀粉酶、蛋白酶的對比檢測試驗,發(fā)現(xiàn)仿生蜂巢花粉中這兩種活性酶的含量與蜂巢花粉的含量十分接近。本研究為進一步開發(fā)活性仿生蜂巢花粉制劑及其單一活性物質(zhì)產(chǎn)品提供了理論依據(jù)。

    蜂花粉;蜂巢花粉;仿生蜂巢花粉;淀粉酶;蛋白酶

    花粉為植物的雄性生殖細胞,它具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實:花粉具有預(yù)防腦心血管疾病、降血脂,調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng),促進睡眠,調(diào)節(jié)胃腸系統(tǒng)功能,促進消化,治療習(xí)慣性便秘;在調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、提高機體免疫功能、抗衰老、改善性功能、治療男性不育、前列腺炎癥等方面有一定的效果,具有防癌抑癌、保肝護肝、防止貧血、糖尿病、抗疲勞、養(yǎng)顏美容等功能而倍受人們的關(guān)注和應(yīng)用[1-6]。蜂花粉是經(jīng)蜜蜂采集的花粉,在蜂箱巢門口人工脫取的花粉被稱為“蜂花粉”,經(jīng)蜜蜂采集帶回巢內(nèi)釀造成熟的花粉被稱為“蜂巢花粉”,蜂巢花粉是蜂花粉在巢脾蜂房內(nèi)被蜜蜂加入自身唾液和蜂蜜后,得以釀熟的天然產(chǎn)品。蜂巢花粉是蜜蜂真正的食物,具有很高的營養(yǎng)和藥用價值。但是人類要享用蜂巢花粉,只能采取人工掏取的辦法,經(jīng)我們試驗:一個勞力一天(8小時)的掏取量在350~450g左右,生產(chǎn)成本較高。如何批量生產(chǎn)出與天然蜂巢花粉活性成分接近的產(chǎn)品,是本研究要解決的問題。

    我國是世界第一養(yǎng)蜂大國,蜂花粉產(chǎn)量及出口量均居世界首位。據(jù)2009年統(tǒng)計數(shù)據(jù):我國蜂花粉年產(chǎn)量超過13500噸,產(chǎn)量位居世界第一,其中一部分用于保健食品或藥品,一部分用于出口外銷,絕大多數(shù)被用做蜜蜂過冬時的“口糧”。我國可開發(fā)利用的蜂花粉數(shù)量在600噸以上,如果采用仿生蜂巢花粉的制備方法,可增進吸收,使其附加值得以大幅提高,從而帶動提升國內(nèi)養(yǎng)蜂業(yè)的經(jīng)濟效益。我國仿生蜂巢花粉產(chǎn)品研發(fā)剛剛起步,其發(fā)展前景十分遠大[7]。

    1 儀器與材料

    紫外光譜儀:UV-2001型紫外光譜儀(日本日立公司);Surveyor高效液相色譜分析儀(Thermo Finnigan);凍干機;

    油菜(Brassica campestris L)蜂花粉、天然蜂巢花粉均由甘肅耐克特蜂產(chǎn)品有限公司采集并通過蘭州大學(xué)藥學(xué)院馬志剛教授鑒定。

    酵母菌:安琪酵母股份有限公司提供;乳酸菌:河南君安生物技術(shù)有限公司提供;蘆丁標準品:成都曼思特生物科技有限公司;葡萄糖標準品:成都曼思特生物科技有限公司;甲醇:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;亞硝酸鈉:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;硝酸鋁:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;NaOH:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;苯酚:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;硫酸:分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

    2 試驗方法與分析

    2.1 仿生蜂巢花粉的制備方法

    蜂花粉的稱量、滅菌:從冷庫稱取油菜蜂花粉,精選除雜,經(jīng)臭氧殺菌機滅菌,使原料蜂花粉達到食品安全衛(wèi)生要求。

    脫敏處理:按蜂花粉重量的15~30%噴灑生理鹽水,攪拌均勻后,在溫度為28~38℃條件下培養(yǎng)48~72小時,完成第一級處理。

    蜂巢花粉液處理:對完成第一級處理蜂花粉,按每份1 kg均勻噴灑200~300 ml蜂巢花粉培養(yǎng)液,在溫度為28~35℃條件下培養(yǎng)48~72小時,完成第二級處理。

    天然蜂巢花粉液的準備方法:用蒸餾水制成5%濃度的滅菌蜂花粉液,用蜂蜜調(diào)節(jié)其糖度18%,然后加入天然蜂巢花粉,天然蜂巢花粉含量達12%(w/v)以上,調(diào)節(jié)pH值在3.5,在恒溫箱28~35℃條件下培養(yǎng)3天,得到天然蜂巢花粉液。

    酵母菌液處理[8,9]:對完成第二級處理的蜂花粉,按每份1kg均勻噴灑200~300ml酵母菌液,在溫度為28~35℃條件下培養(yǎng)48~72小時,完成第三級處理。

    酵母菌液的準備方法:用蒸餾水制成5%濃度的滅菌蜂花粉液,用蜂蜜調(diào)節(jié)其糖度在18%,調(diào)節(jié)pH值在3.5,在恒溫箱28~35℃條件下自然接種培養(yǎng)5天,得到酵母菌培養(yǎng)液。

    乳酸菌液處理[9,10]:對完成第三級處理的蜂花粉,按每kg均勻噴灑200~300ml乳酸菌液,在溫度為28~35℃條件下培養(yǎng)48~72小時,完成第四級處理。

    乳酸菌液的準備方法:用蒸餾水制成5%濃度的滅菌蜂花粉液,量取加入天水當(dāng)?shù)貪{水菜汁,漿水菜汁含量為25%(v/v),在恒溫箱25~30℃條件下培養(yǎng)3天,得到乳酸菌培養(yǎng)液。

    真空凍干:完成第四級處理的蜂花粉,用60目的紗網(wǎng)制成小顆粒后,進行真空凍干處理36~48小時,溫度控制在-55~-65℃之間,真空度為-0.009MPa,使花粉中含水量在3~5%即可。

    滅菌:將完成凍干的蜂花粉置于臭氧滅菌罐中滅菌,滅菌時間為50分鐘,完成滅菌后裝入潔凈食品袋中備用,即生產(chǎn)出凍干活性仿生蜂巢花粉。

    2.2 油菜蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分對比檢測

    油菜蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分對比采用高效液相色譜測定[11],其色譜條件為色譜柱:Hypersil GOLD C18 2.1×150mm;柱溫:25℃;流動相:甲醇:0.1%磷酸=45:55;檢測器:UV和PDA;進樣量:5μl。

    圖1 油菜蜂花粉高效液相色譜

    圖2 油菜天然蜂巢花粉高效液相色譜

    2.2.1 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分檢測方法

    分別準確稱取蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉相同質(zhì)量,定容于50ml,取5 μl進樣分析,得到如下色譜圖:蜂花粉見圖1、天然蜂巢花粉見圖2、仿生蜂巢花粉見圖3。

    2.2.2 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉活性成分對比分析

    由表1可知,根據(jù)色譜分析的色譜峰保留時間和色譜峰面積對照分析,仿生蜂巢花粉與天然蜂巢花粉之間的活性物質(zhì)出峰位置完全一樣,活性物質(zhì)非常接近,而仿生蜂巢花粉與蜂巢花粉之間的活性物質(zhì)出峰位置也基本一樣,僅差一個峰的區(qū)別,其他活性物質(zhì)非常接近;同時還發(fā)現(xiàn)仿生蜂巢花粉各活性物質(zhì)的色譜峰面積有所增加,說明其活性物質(zhì)的含量有所增加,仿生蜂巢花粉可以完全替代蜂巢花粉和蜂花粉。

    2.2.3 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的總黃酮對比測定

    2.2.3.1 測定方法

    (1)蘆丁標準曲線的制作[12]

    稱取0.0099 g蘆丁溶解于100 ml甲醇溶液,搖勻,得標準液;取標準液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 ml分別置于10 ml容量瓶中,加入蒸餾水使成5 ml;精密加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 ml,搖勻,放置5min;再加入10%硝酸鋁溶液0.3 ml,搖勻,放置6min;再加入4% NaOH溶液4 ml;各用蒸餾水定容至刻度線,搖勻,放置10min。在510nm處測定吸光度,制作標準曲線。

    (2)實驗組

    稱取仿生蜂巢花粉0.0275 g,用甲醇定溶至50 ml容量瓶中;稱取蜂花粉0.0126 g,用甲醇定容至50 ml容量瓶中;稱取天然蜂巢花粉0.0249 g,用甲醇定容至50 ml容量瓶中備用。

    取仿生蜂巢花粉、蜂花粉和天然蜂巢花粉甲醇溶液5 ml加入到10 ml容量瓶,加入蒸餾水使成5 ml;精密加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3 ml,搖勻,放置5min;再加入10%硝酸鋁溶液0.3 ml,搖勻,放置6min;再加入4%NaoH溶液4 ml;各用蒸餾水定容至刻度線,搖勻放置10min。在510nm處分別測定吸光度。

    表1 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉之間活性物質(zhì)含量峰值面積對比表

    2.2.3.2 實驗結(jié)果

    依據(jù)標準曲線測定蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總黃酮含量見表2。

    2.2.4 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總多糖對比測定

    (1)測定方法—標準曲線的制作

    準確稱取葡萄糖標準品適量,配制成含量為129.465mg/l標準溶液,分別移取該標準溶液0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml、1.0 ml、1.5 ml、2.0 ml于具塞比色管,各精密加入5.0%苯酚溶液1.0 ml,搖勻,迅速精密加入硫酸5.0 ml,搖勻,放置10分鐘,置于40℃水浴中保溫15分鐘,取出迅速冷卻至室溫,以相應(yīng)試劑為空白,依照紫外可見光譜儀在490nm波長處測定吸光度檢測,系列標準溶液葡萄糖含量分別為:25.893μg、51.786μg、77.697μg、103.572μg、129.1975μg、258.93μg,測得該系列標準溶液吸光度值分別為:0.291、0.429、0.553、0.707、0.829、1.197、1.468,空白溶液吸光度值為0.125,得標準曲線如下圖:

    (2)蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總多糖測定

    依據(jù)標準曲線測定蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉總多糖含量見表3。

    圖3 油菜仿生蜂巢花粉高效液相色譜

    2.2.5 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉淀粉酶、蛋白酶的對比測定

    淀粉活性酶測定按GB/T18932.16-2003方法,蛋白活性酶測定按GB/T23527-2009方法進行測定,測定結(jié)果見表4:

    表2 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的總黃酮含量結(jié)果

    表3 蜂花粉、天然蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉的總多糖含量結(jié)果

    表4 蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉淀粉酶、蛋白酶測定結(jié)果

    3 結(jié)論

    蜂巢花粉是蜜蜂真正的天然食物,是蜜蜂采集植物花粉過程或在蜂房內(nèi)摻入自身唾液與蜂蜜后釀造成熟的產(chǎn)品,蜜蜂及其幼蟲缺食蜂巢花粉,將造成群勢下降、幼蟲不能完全羽化。根據(jù)蜜蜂釀制花粉的原理,我們采用多級發(fā)酵技術(shù)確立了仿生蜂巢花粉的制備方法;通過蜂花粉、蜂巢花粉、仿生蜂巢花粉(三種材料都是油菜花粉)對比研究試驗,根據(jù)色譜分析的色譜峰保留時間和色譜峰面積對照分析,仿生蜂巢花粉與天然蜂巢花粉之間的活性物質(zhì)出峰位置完全一樣,活性物質(zhì)成分非常接近,而仿生蜂巢花粉與蜂巢花粉之間的活性物質(zhì)出峰位置也基本一樣,僅差一個峰的區(qū)別,其他活性物質(zhì)成分也非常接近;同時還發(fā)現(xiàn),仿生蜂巢花粉各活性物質(zhì)的色譜峰面積有所增加,說明其活性物質(zhì)的含量有所增加,因此仿生蜂巢花粉可以完全替代蜂巢花粉和蜂花粉。同時,還發(fā)現(xiàn)仿生蜂巢花粉中的活性化學(xué)成分含量高于蜂花粉、蜂巢花粉的含量,另外通過對不同花粉淀粉酶、蛋白酶的對比檢測試驗,發(fā)現(xiàn)仿生蜂巢花粉中,這兩種活性酶的含量與蜂巢花粉的含量十分接近。

    致謝:本課題研究受甘肅省科技支撐計劃《多級仿生蜂花粉的制造及其制劑的制備研究》(No:0708NKCE080,2009-2011)、《仿生蜂花粉系列制劑產(chǎn)業(yè)化開發(fā)》(No:1204 NKCE102,2012-2014)及《天水蜂產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)化工藝技術(shù)研究與開發(fā)》(No:144NKCE244,2014-2015)的支持,表示感謝。

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