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    普魯士藍(lán)@石墨烯-殼聚糖納米復(fù)合物用于構(gòu)建microRNA電化學(xué)傳感器的研究

    2017-06-07 08:23:51蘇會嵐李德長張瑞林
    分析測試學(xué)報 2017年5期
    關(guān)鍵詞:復(fù)合物探針電化學(xué)

    蘇會嵐,李德長,張瑞林,梅 浩,湯 科

    (成都醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生系, 四川 成都 610500)

    普魯士藍(lán)@石墨烯-殼聚糖納米復(fù)合物用于構(gòu)建microRNA電化學(xué)傳感器的研究

    蘇會嵐*,李德長,張瑞林,梅 浩,湯 科

    (成都醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生系, 四川 成都 610500)

    制備了基于普魯士藍(lán)(PB)、石墨烯(GN)、殼聚糖(Chi)的納米復(fù)合物(PB@GN-Chi),并將其修飾在玻碳電極表面制得microRNA電化學(xué)傳感器。實驗發(fā)現(xiàn),GN可有效提高敏感膜的導(dǎo)電性能和比表面積,增強PB在電極表面的穩(wěn)定性和傳感器的重現(xiàn)性。通過戊二醛的交聯(lián)作用,將氨基化的捕獲探針(ssDNA)固載在PB@GN-Chi修飾的電極表面,并用于miR-21的檢測。以透射電子顯微鏡對納米復(fù)合物的形態(tài)進行表征,采用循環(huán)伏安法、示差脈沖伏安法對傳感器的電化學(xué)特性進行研究。實驗結(jié)果表明,該傳感器具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,在2.8~2.8×104pmol/L濃度范圍內(nèi),響應(yīng)電流與miR-21濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系,檢出限為0.87 pmol/L,可用于miR-21的檢測。

    電化學(xué)生物傳感器;普魯士藍(lán);石墨烯;納米復(fù)合物;microRNA

    世界衛(wèi)生組織最新發(fā)布的《世界癌癥報告》指出:2012年新增1 400萬癌癥病例中,肺癌的發(fā)病率和致死率均居首位,缺少早期診斷是主要原因之一,大部分肺癌患者被確診時已是中晚期。MicroRNAs(miRNAs,miRs)是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA,長度約19~25個核苷酸,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用,是當(dāng)前研究的熱點之一。近期研究發(fā)現(xiàn),正常肺組織和肺癌組織的miRNA表達(dá)模式有明顯差異,且體現(xiàn)在實體腫瘤和患者血清中。Yanaihara和Wang等[1-2]研究發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)病人血清中miR-21水平顯著升高,提示miRNA-21可作為肺癌早期診斷的分子標(biāo)志物。

    miRNA家族成員間有高度保守性,同時具有序列短、豐度低、穩(wěn)定性差等特點,導(dǎo)致檢測難度較高。目前,miRNA的定量檢測多采用qRT-PCR、Northern雜交、微陣列芯片等技術(shù),但分析效率不高、檢測成本高,較難普及到常規(guī)篩查中[3-5]。為實現(xiàn)快速、靈敏、低成本的檢測,電化學(xué)生物分析技術(shù)用于miRNA檢測得到了關(guān)注和發(fā)展[6-9]。Gao等[10]利用miRNA為模板結(jié)合Os(dmpy)2(IN)Cl+實現(xiàn)了對miRNA的檢測。為了增加檢測靈敏度,一些信號增強策略也紛紛用于miRNA傳感器的構(gòu)建,如Kilic等[11]將酶催化放大策略引入miRNA電化學(xué)傳感器的構(gòu)建中,Wu等[12]利用目標(biāo)物循環(huán)級聯(lián)放大策略獲得增強的電信號,均顯示了較高的靈敏度。

    納米材料因具有良好的電化學(xué)特性而應(yīng)用于miRNAs 電化學(xué)傳感器的構(gòu)建。近年來的研究表明,石墨烯(GN)具有強導(dǎo)電性(103~104S/m)、高比表面積(2 630 m2/g)、高韌性等特點,是至今發(fā)現(xiàn)的最薄及強度最高的材料[13-15]。同時,基于石墨烯的復(fù)合納米材料因其協(xié)同效應(yīng)也引起了廣泛的研究[16-17]。

    普魯士藍(lán)(Prussian blue,PB)具有良好的電活性和電催化活性,已作為一種電活性物質(zhì)被廣泛使用。由于PB在電極表面易滲漏,為了提高PB的穩(wěn)定性,有研究者提出將PB和碳納米管及石墨烯等材料結(jié)合制備納米復(fù)合物,在提高PB穩(wěn)定性的同時可獲得優(yōu)良的電化學(xué)特性[18-20]。PB的制備通常是將Fe3+與[Fe(CN)6]4-混合或?qū)e2+與[Fe(CN)6]3-混合,其合成速度快,產(chǎn)物不易控制,導(dǎo)致傳感器的重現(xiàn)性不好[21]。近期研究發(fā)現(xiàn),GN可以減緩PB納米粒子形成的速度,通過控制反應(yīng)條件可獲得較穩(wěn)定的PB-GN 納米復(fù)合物,提高傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

    基于此,本研究在GN表面合成PB,結(jié)合殼聚糖(Chi)良好的成膜性合成了一種PB@GN-Chi納米復(fù)合物,并將其修飾在玻碳電極表面。研究表明,GN可增大電極的比表面積,提高Chi膜的導(dǎo)電性,同時可有效提高PB的固載量和穩(wěn)定性。通過戊二醛(GA)的交聯(lián)作用,將捕獲探針(ssDNA,Capture probe,Cp)固載在電極表面,采用己硫醇(HT)封閉,制得的miRNA 生物傳感器顯示了較高的靈敏度及良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

    1 實驗部分

    1.1 儀器、試劑與材料

    羧基功能化石墨烯(GN,2.0 mg/mL)購于南京先豐納米材料科技有限公司;殼聚糖(Chi)、凝血酶適體購于上海未來實業(yè)有限公司;寡核苷酸(miR-21:5’-CAA CAC CAG UCG AUG GGC UGU-3’,捕獲探針ssRNA:5’-SH ACA GCC CAU CGA CUG GUG UUG-3’,miR-155:5’-TTA ATG CTA ATC GTG ATA GGG GT-3’)購于寶生物工程(大連)有限公司,α-氧化鋁拋光粉購于阿依恒晟科技發(fā)展有限公司,其他化學(xué)試劑均為分析純。

    電化學(xué)測試采用三電極系統(tǒng):玻碳電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑絲電極為對電極,EC6800電化學(xué)工作站(上海恒平科學(xué)儀器公司)。pHS-3C型酸度計(上海大眾儀器公司),H-7500透射電子顯微鏡(日本 Hitachi Instrument 公司)。

    1.2 PB@GN-Chi納米復(fù)合物的制備

    將GN溶液(1.0 mg/mL)均勻分散在Chi溶液(1.0 mg/mL)中,攪拌1.5 h。將K3Fe(CN)6(6.4 mg)和氯化鉀(29.6 mg)加至上述溶液中,調(diào)節(jié)溶液的pH值為1.5,加入FeCl2·4H2O(4.8 mg)并持續(xù)攪拌24 h。將此溶液用超純水洗滌3次,即得PB@GN-Chi納米復(fù)合物,低溫冷藏保存。同時采用超聲合成法制備了上述復(fù)合物開展對照試驗,即在超聲條件下,將FeCl2·4H2O,K3Fe(CN)6和KCl溶液混合,調(diào)至pH 1.5。1 h后,加入1.0 mg/mL GN-Chi溶液,繼續(xù)超聲12 h,離心洗滌3次,即得PB/GN-Chi。

    圖2 GN(左)和PB@GN-Chi納米復(fù)合物(右)的透射電鏡表征圖Fig.2 TEM images of GN(left) and PB@GN-Chi composite(right)

    圖3 不同修飾電極的DPV表征圖Fig.3 DPV curves of different modified electrodesa.PB@GN-Chi;b.GA/PB@GN-Chi;c.Cp/GA/PB@ GN-Chi;d.HT/Cp/GA/PB@GN-Chi;e.miR-21/ HT/Cp/GA/PB@GN-Chi

    1.3 miRNA電化學(xué)傳感器的制備

    miRNA電化學(xué)傳感器的制備如圖1所示。依次用1.0,0.3,0.50 μm的氧化鋁粉于麂皮上將玻碳電極打磨拋光,再用無水乙醇和超純水反復(fù)超聲清洗,晾干后滴加10 μL PB@GN-Chi納米復(fù)合物溶液于電極表面,晾干后在GA溶液中浸泡30 min,與捕獲探針在4 ℃下反應(yīng)6 h,HT封閉,即制得miRNA電化學(xué)傳感器。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 電化學(xué)免疫傳感器的制備及檢測原理

    本研究提出的miRNA電化學(xué)傳感器是基于在玻碳電極表面自組裝PB@GN-Chi 納米復(fù)合物,并通過GA進一步固載捕獲探針(ssRNA)而制得。利用殼聚糖良好的成膜性和豐富的氨基以及石墨烯的強導(dǎo)電性和大的比表面積,可有效提高敏感膜的導(dǎo)電能力和PB固載量,從而提高免疫傳感器的靈敏度。該傳感器通過PB電化學(xué)信號的改變來指示待測miRNA的含量。

    2.2 PB@GN-Chi納米復(fù)合物的表征

    采用透射電子顯微鏡(TEM)對納米復(fù)合物進行表征(圖2),從圖中可以看到,GN均勻分散在Chi中,PB納米顆粒修飾在GN表面,提示PB@GN-Chi納米復(fù)合物已被成功合成?;谠搹?fù)合物修飾的電極有以下特點:①PB可呈現(xiàn)1對準(zhǔn)可逆的氧化還原峰,指示電信號變化;②通過原位合成法將PB固載在GN上,可提高PB的穩(wěn)定性,有效解決了測試時PB易脫落的問題;③GN具有大的比表面積和強的導(dǎo)電性能,可有效提高敏感膜的導(dǎo)電性能;④ Chi可提供大量的氨基進一步結(jié)合其它功能分子。因此,基于該復(fù)合物的電化學(xué)傳感器可望具有高的靈敏度和穩(wěn)定性。

    2.3 miRNA電化學(xué)傳感器的電化學(xué)表征

    采用DPV對電極的修飾過程進行表征,其結(jié)果如圖3所示。圖3曲線a為PB@GN-Chi修飾電極的DPV表征圖,可觀察到1個明顯的電流峰,為電活性物質(zhì)PB的特征峰。從曲線b可以看出,進一步修飾戊二醛的電極響應(yīng)信號稍有降低。氨基修飾捕獲探針可通過戊二醛的交聯(lián)作用牢固地結(jié)合在電極表面,導(dǎo)致電流信號的進一步降低(曲線c)。電極表面的非特異性吸附位點采用HT進行封閉,捕獲探針可通過堿基互補配位特異性識別miR-21。由于HT和miR-21的電化學(xué)惰性,圖3中曲線d和e的電極響應(yīng)信號逐步降低。電化學(xué)表征結(jié)果表明,該miRNA電化學(xué)傳感器得以成功制備。另外,本研究還對比了PB@GN-Chi和PB/Chi修飾電極的響應(yīng)信號,結(jié)果顯示,PB@GN-Chi修飾電極的峰電流較PB/Chi修飾電極高73.74 μA ,說明GN的摻雜可明顯增大電流響應(yīng)信號。

    2.4 不同掃速下修飾電極的電化學(xué)表征

    考察了修飾電極在不同掃速下(50~300 mV/s)的循環(huán)伏安表征圖(圖4)。從圖中可以看出,氧化還原峰電流均隨掃速的增加而增加,且峰電流與掃速成正比,其線性方程分別為y=40.267 73+0.112 98x(r=0.976 3),y=-1.672 33-0.175 31x(r=0.977 5),表明該電極過程受表面控制。

    圖4 修飾電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammetric curves of the modified electrode in different scan rates scan rate(a-f):50,100,150,200,250,300 mV/s;insert: relationship between redox peak current and scan rate

    圖5 PB@GN-Chi和PB/GN-Chi修飾電極在不同測試次數(shù)下的DPV表征圖Fig.5 DPV curves of the PB@GN-Chi prepared by in situ synthesis method and PB/GN-Chi ultrasonic synthesis method a,c:1st test;b,d:20th test

    2.5 生物識別作用時間的優(yōu)化

    miRNA與捕獲探針的特異性識別時間是影響檢測的重要因素。本研究測定了miRNA電化學(xué)傳感器與miR-21反應(yīng)不同時間時的電化學(xué)信號。結(jié)果顯示,隨著反應(yīng)時間的增加,峰電流逐漸降低,當(dāng)反應(yīng)時間為30 min時,繼續(xù)增大反應(yīng)時間,峰電流基本不變,說明miR-21在此電極表面與捕獲探針完全反應(yīng)需要30 min,故選擇30 min為本實驗的生物識別反應(yīng)時間。

    2.6 miRNA傳感器的性能研究

    2.6.1 傳感器對不同濃度miR-21的響應(yīng) 在最優(yōu)實驗條件下,將制備好的miRNA傳感器與不同濃度的miR-21溶液結(jié)合以考察該傳感器的電流響應(yīng)特性。結(jié)果顯示,隨著miR-21濃度的增加,其氧化還原峰電流逐漸減小。待測物的電流響應(yīng)與miR-21濃度的對數(shù)在2.8~2.8×104pmol/L范圍內(nèi)成正比,檢出限(S/N=3)為0.87 pmol/L。

    2.6.2 miRNA傳感器的穩(wěn)定性 對miRNA傳感器(PB@GN-Chi)的穩(wěn)定性進行研究。將制備好的miRNA傳感器采用DPV連續(xù)測定20次,其結(jié)果如圖5所示。圖中曲線c和d分別為第1次和第20次掃描的DPV表征圖,可以看出其峰電流基本無變化。同時制備了基于PB/GN-Chi納米復(fù)合物的miRNA傳感器進行對照研究,采用同樣的方法對該傳感器進行了穩(wěn)定性測試,圖中曲線a和b分別為該傳感器第1次和第20次掃描的DPV表征圖,可以看到曲線b較曲線a的電流有明顯降低,說明本研究提出的PB@GN-Chi納米復(fù)合物制備方法可以有效提高敏感膜在電極表面的穩(wěn)定性,提高該傳感器的穩(wěn)定性。另外,將傳感器與miR-21識別完成后,儲存于冰箱,每7 d測試1次,連續(xù)測試4次,結(jié)果顯示其響應(yīng)電流無明顯變化,說明該傳感器的長期穩(wěn)定性較好。

    2.6.3 miRNA傳感器的重現(xiàn)性與選擇性 為了考察該傳感器的重現(xiàn)性,將平行制備的5支電極插入相同濃度的miRNA溶液中。結(jié)果顯示,5支電極測量信號的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,n=5)為0.93%,提示該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。同時,將此miRNA傳感器用于560 pmol/L miR-21及混合溶液(5 nmol/L凝血酶適體,5 nmol/L miR-155,560 pmol/L miR-21)的測定,混合溶液和miR-21的電流響應(yīng)結(jié)果差(ΔI)為0.02 μA,證明該傳感器的選擇性良好。

    2.6.4 miRNA傳感器回收率的測定 采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測定了miRNA傳感器的回收率。分別將28,56,280,560 pmol/L 的miR-21加至模擬人體血清環(huán)境的溶液中,用miRNA傳感器分別進行檢測,結(jié)果顯示,傳感器的回收率分別為103.1%,100.0%,99.0%,96.8%。表明該傳感器具有較好的準(zhǔn)確性,可用于臨床血清的檢測。

    3 結(jié) 論

    GN具有大的比表面積和良好的導(dǎo)電性能,可在增強敏感膜導(dǎo)電性的同時提高電活性物質(zhì)PB的固載量。本文在GN表面合成了PB,結(jié)合殼聚糖制備了PB@GN-Chi納米復(fù)合物,并將其滴涂在玻碳電極表面成功構(gòu)建了miRNA電化學(xué)傳感器,實現(xiàn)了對miR-21的快速檢測。結(jié)果表明,該傳感器具有較高的穩(wěn)定性和靈敏度,同時具有良好的選擇性和準(zhǔn)確性。

    [1] Yanaihara N,Caplen N,Bowman E,Seike M,Kumamoto K,Yi M,Stephens R M,Okamoto A,Yokata J,Tanaka T,Calin G A,Liu C G,Croce C M,Harris C C.CancerCell,2006,9(3):189-198.

    [2] Wang Z X,Bian H B,Wang J R,Cheng Z X,Wang K M,De W,J.Surg.Oncd.,2011,104(7):847-851

    [3] Donnem T,Eklo K,Berg T,Sorbye S W,Lonvik K,Saad S A,Andersen S,Stenvold H,Bremnes R M,Busund L T.J.Transl.Med.,2011,9:6-10.

    [4] Sunitha T,Xu H,Chen J,Kwaku B,Qiu W,Zhao J X,Liu G D.Anal.Sci.,2016,32(6):617-622.

    [5] Nelson P T,Baldwin D A,Scearce L M,Oberholtzer J C,Tobias J W,Mourelatos Z.Nat.Methods,2004,1(2):155-161.

    [6] Xiang G M,Jiang D N,Luo F K,Liu F,Liu L L.Sens.ActuatorsB,2014,159:515-519.

    [7] Yin B C,Liu Y Q,Ye B C.J.Am.Chem.Soc.,2012,134:5064-5067.

    [8] Hong C Y,Chen X,Liu T,Li J,Yang H H,Chen J H,Chen G N.Biosens.Bioelectron.,2013,50:132-136.

    [9] Zhang P,Wu X Y,Yuan R,Chai Y Q.Anal.Chem.,2015,87:3202-3207.

    [10] Gao Z Q,Yu Y H.Sens.ActuatorsB,2007,121:552-559.

    [11] Kilic T,Topkaya S N,Ariksoysal D O,Ozsoz M,Ballar P,Erac Y,Gozen O.Biosens.Bioelectron.,2012,38:195-201.

    [12] Wu X Y,Chai Y Q,Zhang P,Yuan R.Appl.Mater.Interfaces,2015,7(1):713-720.

    [13] Bunch J S,Zande A M V D,Verbridge S S,F(xiàn)rank I W,Tanenbaum D M,Parpia J M,Craighead H G,McEuen P L.Science,2007,315(5811):490-493.

    [14] Rao C N R,Ood A K,Subrahmanyam K S,Govindaraj A.Angew.Chem.Int.Ed.,2009,48:7752-7777.

    [15] Yu H,Gao X L,Xu N,Chen X X,F(xiàn)eng X,Jin J.J.Instrum.Anal.(于浩,高小玲,徐娜,陳小霞,馮曉,金君.分析測試學(xué)報),2016,35(11):1416-1421.

    [16] Hu T,Zhang L,Wen W,Zhang X H,Wang S F.Biosens.Bioelectron.,2016,77:451-456.

    [17] Yang M H,Jeong J M,Lee K G,Kin D H,Lee S J,Choi B G.Biosens.Bioelectron.,2017,89:612-619.

    [18] Wang L,Tricard S,Yue P,Zhao J,F(xiàn)ang J,Shen W.Biosens.Bioelectron.,2016,77:1112-1118.

    [19] Wang H N,Qi Y,Sun Z,F(xiàn)eng T T,Hong C L.J.Instrum.Anal.(王海寧,齊譽,孫昭,馮濤濤,洪成林.分析測試學(xué)報),2016,35(10):1289-1294.

    [20] Jin E,Lu X F,Cui L L,Chao D M,Wang C.Electrochim.Acta,2010,55:7230-7234.

    [21] Lai G,Zhang H,Yu A,Ju H.Biosens.Bioelectron.,2015,74:660-665.

    Development of microRNA Electrochemical Biosensor Based on Prussian Blue@Graphene-Chitosan Nanocomposite Prepared by in situ Deposition

    SU Hui-lan*,LI De-zhang,ZHANG Rui-lin,MEI Hao,TANG Ke

    (Department of Public Health,Chengdu Medical College,Chengdu 610500,China)

    A microRNA(miR,miRNA) electrochemical biosensor was proposed in the present research.Firstly,graphene(GN) was dispersed in the chitosan(Chi) solution to promote the conductivity of chitosan film.Then,prussian blue(PB) was in situ deposited on GN to obtain the PB@GN-Chi nanocomposite.The obtained nanocomposites were modified on the surface of electrode.Compared with the PB@GN-Chi prepared by ultrasonic method,the prepared composite could effectively prevent PB leaking into detection solution and display a prominent stability when modified on the electrode.The capture probe was subsequently modified by amino group and covalently linked to the modified electrode via glutaraldehyde.After blocked by hexanethiol,the miRNA biosensor was successfully prepared.The prepared PB@GN-Chi nanocomposite was observed with transmission electron microscope,and the electrochemical characteristics of the miRNA biosensor were investigated by cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry.Under the optimal conditions,the biosensor displayed a linear relationship between current response and the logarithm of concentration of miR-21 in the range of 2.8-2.8×104pmol/L.The detection limit was calculated to be 0.87 pmol/L.The prepared biosensor owns good stability and repeatability,and could be employed to detect miR-21 in human serum sample.

    electrochemical biosensor;prussian blue;graphene;nanocomposite;microRNA

    2016-12-27;

    2017-01-20

    國家自然科學(xué)基金資助項目(81401757);發(fā)育與再生四川省重點實驗室項目(SYS16-004);成都醫(yī)學(xué)院科研創(chuàng)新團隊(CYTD16-03)

    10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.011

    O657.1;Q522

    A

    1004-4957(2017)05-0645-05

    *通訊作者:蘇會嵐,博士,講師,研究方向:生物分析化學(xué),Tel:028-62739576,E-mail :suhuilan1986@163.com

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