QuEChERS結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法快速測(cè)定職業(yè)工人尿液中多溴聯(lián)苯醚

郁 東，王德軍，朱文文，陳 田，施致雄*

(1.山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院 檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南 250062；2.山東省疾病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)南 250014；3.首都醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069)

研究簡(jiǎn)報(bào)

QuEChERS結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜法快速測(cè)定職業(yè)工人尿液中多溴聯(lián)苯醚

郁 東1，王德軍2，朱文文1，陳 田3，施致雄3*

(1.山東省職業(yè)衛(wèi)生與職業(yè)病防治研究院 檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)南 250062；2.山東省疾病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)南 250014；3.首都醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069)

建立了QuEChERS前處理結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜快速測(cè)定職業(yè)工人尿液中8種多溴聯(lián)苯醚同系物的分析方法。尿液樣在氯化鈉和無水硫酸鎂的脫水與鹽析作用下以正己烷-丙酮混合液提取，采用C18去除提取液中的雜質(zhì)，并采用氣相色譜-負(fù)化學(xué)源質(zhì)譜法在選擇離子監(jiān)測(cè)模式下測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。三至七溴聯(lián)苯醚在1～100 pg/μL(十溴聯(lián)苯醚為10～1 000 pg/μL)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。待測(cè)物在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率為91.7%～110.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于10%。多溴聯(lián)苯醚的檢出限為0.3～36 pg/mL。該方法簡(jiǎn)單快速，靈敏度和選擇性較高，適合職業(yè)工人體內(nèi)污染物暴露水平監(jiān)測(cè)。

多溴聯(lián)苯醚；尿液；氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)；職業(yè)工人

溴系阻燃劑(BFRs)是一系列工業(yè)化學(xué)品，常添加于以電子電器產(chǎn)品為主的各類生產(chǎn)生活用品中用于防火阻燃，在預(yù)防火災(zāi)方面發(fā)揮了重要作用，但其在生產(chǎn)、使用和產(chǎn)品廢棄過程中不斷釋放到周圍環(huán)境中，并通過食物鏈富集放大，由此帶來的環(huán)境污染和人群健康危害備受關(guān)注[1-2]。多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)自上世紀(jì)70年代開始應(yīng)用，是迄今為止產(chǎn)量最大及使用時(shí)間最長(zhǎng)的一類BFRs，但由于被發(fā)現(xiàn)具有環(huán)境持久性、遠(yuǎn)距離傳輸性及多種毒性效應(yīng)[3-4]，2009年《關(guān)于持久性有機(jī)污染物的斯德哥爾摩公約》締約方大會(huì)已明確將PBDEs中的五溴和八溴聯(lián)苯醚列為持久性有機(jī)污染物并建議禁用，PBDEs中毒性較低的十溴聯(lián)苯醚雖然目前仍在生產(chǎn)與使用，但已有多國(guó)擬開展限用措施[5]。

BFRs的環(huán)境污染水平分析與人群暴露評(píng)估已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)問題，但目前其在人群內(nèi)的暴露評(píng)估以血清、母乳為主要基質(zhì)[6-7]，極少涉及尿液中BFRs的監(jiān)測(cè)。由于BFRs為脂溶性化合物，一般認(rèn)為其在尿液中含量不高，但尿液樣本具有易采集，對(duì)受試者無損傷等優(yōu)點(diǎn)，因此可嘗試將其作為職業(yè)工人體內(nèi)污染物暴露水平評(píng)估的基質(zhì)。在方法學(xué)上，當(dāng)前針對(duì)液態(tài)樣本中BFRs的測(cè)定多采用液液萃取法，但該方法溶劑消耗量大且程序復(fù)雜，亟需發(fā)展更簡(jiǎn)單快捷的前處理技術(shù)[8]。本研究采用QuEChERS前處理技術(shù)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜建立了尿液中8種PBDEs 同系物的檢測(cè)方法，并用于職業(yè)工人尿液的監(jiān)測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

7890B-5977A氣相色譜-質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司)；S-EVAP氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)。正己烷、丙酮、乙酸乙酯(色譜純，美國(guó)J&T.Baker公司或迪馬公司)；無水硫酸鎂、氯化鈉(優(yōu)級(jí)純，北京化工廠)；吸附劑N-丙基乙二胺(PSA)、C18(美國(guó)Agilent公司)。標(biāo)準(zhǔn)品：PBDEs標(biāo)準(zhǔn)溶液，包括美國(guó)環(huán)境保護(hù)署1614草案中列出的環(huán)境中優(yōu)先關(guān)注的8種PBDEs單體(7種三至七溴聯(lián)苯醚及十溴聯(lián)苯醚)：BDE-28，47，99，100，153，154，183和209(質(zhì)量濃度均為50 μg/mL，溶于異辛烷)；內(nèi)標(biāo)：3，3′，4，4′-四溴聯(lián)苯醚(BDE-77)和2，2′，3，3′，4，4′-六溴聯(lián)苯醚(BDE-128)(質(zhì)量濃度 50 μg/mL，溶于異辛烷)。上述標(biāo)準(zhǔn)品均購于美國(guó)AccuStandard公司。同位素內(nèi)標(biāo)13C12-BDE-209(質(zhì)量濃度 25 μg/mL，溶于甲苯)，購于美國(guó)Wellington Laboratories。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)系列的配制

混標(biāo)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確量取PBDEs各單體的標(biāo)準(zhǔn)液適量，混合后以正己烷稀釋，得到濃度為1 μg/mL(其中BDE-209為10 μg/mL)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于-18 ℃冰箱中冷凍保存。

標(biāo)準(zhǔn)溶液：取適量的上述混標(biāo)儲(chǔ)備液，以正己烷稀釋，配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中三至七溴聯(lián)苯醚濃度為1～100 pg/μL，BDE-209濃度為10～1 000 pg/μL。標(biāo)準(zhǔn)溶液中，內(nèi)標(biāo)BDE-77和BDE-128的濃度為10 pg/μL，13C12-BDE-209 的濃度為100 pg/μL。置于-18 ℃冰箱中冷凍保存。

1.3 樣品制備

取50 mL聚丙烯離心管，加入內(nèi)標(biāo)BDE-77和BDE-128各1 ng，13C12-BDE-209 10 ng，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)時(shí)需再加入不同濃度的待測(cè)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，氮?dú)獯蹈扇軇┖螅尤?0 mL尿液，渦旋混勻。加入10 mL正己烷-丙酮混合液(體積比1∶1)，渦旋振蕩1 min。再加入4 g 無水硫酸鎂和1 g氯化鈉，劇烈振蕩1 min后，4 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至15 mL聚丙烯離心管后氮吹至干，加入1 mL正己烷復(fù)溶，轉(zhuǎn)移至已加入100 mg 無水硫酸鈉和100 mg C18的2 mL離心管中。劇烈振蕩1 min，4 ℃下10 000 r/min離心5 min。上清液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00 μL正己烷復(fù)溶，待測(cè)。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件 色譜柱：DB-5MS毛細(xì)管柱(15 m×0.25 mm×0.1 μm，美國(guó)Agilent公司)，色譜柱升溫程序：100 ℃(保持1 min)，以20 ℃/min升溫至300 ℃(保持6 min)，再以20 ℃/min升溫至310 ℃(保持3 min)；載氣為He(純度>99.995%)，流速3 mL/min。不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度275 ℃，傳輸線溫度300 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜條件 離子源為負(fù)化學(xué)源(NCI)；甲烷反應(yīng)氣壓力0.2 MPa；離子源溫度200 ℃，溶劑延遲時(shí)間5 min。掃描方式為選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)，BDE-209的定量離子為m/z486.6，定性離子為m/z488.6，13C12-BDE-209的定量離子為m/z494.6，定性離子為m/z492.6，其他待測(cè)物的檢測(cè)離子均為m/z79和81。以BDE-77作為三至六溴聯(lián)苯醚的內(nèi)標(biāo)，BDE-128作為BDE-183的內(nèi)標(biāo)，13C12-BDE-209作為BDE-209的內(nèi)標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 QuEChERS前處理方法優(yōu)化

2.1.1 萃取溶劑的選擇 QuEChERS前處理技術(shù)具有回收率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，是近年來發(fā)展非常迅速的一種新興樣品前處理技術(shù)[9]。前處理方法的第1步是采用有機(jī)溶劑萃取待測(cè)液，乙腈由于萃取效率較高常被作為萃取溶劑[9]，萃取過程中加入無水硫酸鎂和氯化鈉除水并起到鹽析作用。本文采用對(duì)加標(biāo)尿液(三至七溴聯(lián)苯醚0.1 ng/mL，BDE-209 1 ng/mL)進(jìn)行萃取測(cè)試加標(biāo)回收率的方式比較了多種有機(jī)溶劑或混合有機(jī)溶劑的萃取效果，包括乙腈、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷-丙酮(體積比1∶1)、甲基叔丁基醚、正己烷-甲基叔丁基醚(體積比1∶1)等。發(fā)現(xiàn)對(duì)于尿樣，以乙酸乙酯、丙酮、甲基叔丁基醚及正己烷-甲基叔丁基醚混合液作為萃取溶劑時(shí)，有機(jī)相與無機(jī)相即使高速離心后也無法分離。使用乙腈、正己烷和正己烷-丙酮混合液萃取時(shí)，有機(jī)相與無機(jī)相可完全分層，但正己烷的萃取回收率偏低(約50%)，采用乙腈或正己烷-丙酮萃取時(shí)，待測(cè)物的回收率良好(80%以上)，但乙腈萃取時(shí)有機(jī)層明顯比正己烷-丙酮萃取時(shí)的顏色深，可見乙腈萃取時(shí)會(huì)有更多雜質(zhì)被萃取出。此外，由于PBDEs為低極性的脂溶性化合物，采用含低極性正己烷的混合溶劑更有利于提高萃取效率[1]，且乙腈毒性較大，因此后續(xù)采用正己烷-丙酮混合液為萃取溶劑。

2.1.2 吸附劑的選擇 QuEChERS前處理方法的第2步是加入N-丙基乙二胺(PSA)或C18等吸附劑通過吸附作用去除萃取液中的雜質(zhì)。PSA具有WAX功能團(tuán)，能有效去除非極性基質(zhì)中的糖、脂肪酸等極性化合物[10]，但其去除脂肪能力較弱；C18可有效去除萃取液中的脂肪類雜質(zhì)[11]，如果樣本中脂肪的含量超過2%，則適合采用C18作為吸附劑。本文通過對(duì)尿液進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)比較了PSA(100 mg)、C18(100 mg)和PSA/C18混合物(各50 mg)的吸附效率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)上述3種吸附劑凈化后，所有待測(cè)物的回收率均較好且差別不大?？紤]到C18價(jià)格遠(yuǎn)低于PSA，適于大批量樣本的分析，因此選擇C18為吸附劑。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化了C18的使用量(100～500 mg)，由于尿液中脂肪含量很低，100 mg C18已有足夠的吸附雜質(zhì)效果，且各化合物的回收率均較好(90%～115%)，而隨著C18使用量的增加回收率并無明顯變化，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中C18的使用量均為100 mg。

2.2 GC-MS方法的優(yōu)化

PBDEs為含溴的半揮發(fā)性化合物，多采用氣相色譜結(jié)合負(fù)化學(xué)源質(zhì)譜(GC-NCI/MS)進(jìn)行分析[12-13]。氣相色譜分離時(shí)由于BDE-209易在高溫下脫溴降解，故采用短色譜柱(≤15 m)以縮短保留時(shí)間。本文采用15 m毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行氣相色譜分離，所有待測(cè)物均可獲得良好的響應(yīng)。NCI/MS是測(cè)定PBDEs的最常用方法。在NCI源中三至七溴聯(lián)苯醚產(chǎn)生的離子主要為溴離子(m/z79和81)，BDE-209 產(chǎn)生的主要碎片離子則是分子離子丟失1個(gè)五溴苯后形成的C6Br5O-(m/z486.6)，故可以采用同位素內(nèi)標(biāo)13C-BDE-209進(jìn)行精確的定量分析[14]。

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限 按照“1.4”方法采集各標(biāo)準(zhǔn)溶液的譜圖，以各待測(cè)物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值(x)為橫坐標(biāo)，各待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)濃度的比值(y)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程與相關(guān)系數(shù)(r)。標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量色譜圖如圖1所示，各化合物的保留時(shí)間、線性方程和相關(guān)系數(shù)結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，當(dāng)三至七溴聯(lián)苯醚濃度為1～100 pg/μL，十溴聯(lián)苯醚濃度為10～1 000 pg/μL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以10 mL經(jīng)檢測(cè)無待測(cè)物殘留的普通人尿樣為基質(zhì)，測(cè)定最低加標(biāo)水平的響應(yīng)，計(jì)算信噪比，以信噪比為3對(duì)應(yīng)的濃度為方法檢出限(LOD)，三至七溴聯(lián)苯醚由于在NCI源上響應(yīng)較高，LOD均在2 pg/mL以下，十溴聯(lián)苯醚由于存在高溫分解情況其LOD較高(36 pg/mL)(見表1)。

2.3.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 以普通人尿液為空白基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，空白尿液中BDE-28，47，99，100和154的濃度控制在1 pg/mL以下，BDE-153和BDE-154的濃度控制在2 pg/mL以下，BDE-209則在40 pg/mL以下。尿液取樣量10 mL，加標(biāo)水平分別為0.01，0.1,1.0 ng/mL(其中BDE-209的加標(biāo)水平分別為0.1，1.0,10 ng/mL)，平均加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，PBDEs的平均回收率為91.7%～110.2%，RSD均小于10%，表明方法的精密度和回收率良好。

圖1 BFRs標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量色譜圖Fig.1 Chromatogram of BFRs standard solution concentrations of BDE-77，BDE-128 and tri- to hepta-BDEs were 10 pg/μL，BDE-209 and 13C12-BDE-209 were 100 pg/μL

AnalyteRetentiontime(min)Linearrange(pg/μL)Regressionequationr2LOD(pg/mL)BDE-28(2，4，4′?三溴聯(lián)苯醚)5 9051～100y=1 1712x+0 02610 99920 4BDE-47(2，2′，4，4′?四溴聯(lián)苯醚)6 9061～100y=1 0361x+0 03250 99910 3BDE-100(2，2′，4，4′，6?五溴聯(lián)苯醚)7 6171～100y=1 0830x+0 02610 99950 7BDE-99(2，2′，4，4′，5?五溴聯(lián)苯醚)7 8631～100y=0 9651x+0 01560 99980 6BDE-154(2，2′，4，4′，5，6′?六溴聯(lián)苯醚)8 4141～100y=1 0770x+0 03620 99960 7BDE-153(2，2′，4，4′，5，5′?六溴聯(lián)苯醚)8 7291～100y=1 0540x+0 04250 99951 1BDE-183(2，2′，3，4，4′，5′，6?七溴聯(lián)苯醚)9 5161～100y=1 8410x+0 03980 99921 7BDE-209(十溴聯(lián)苯醚)13 18510～1000y=1 0238x+0 15620 999536

*spiked concentration of BDE-209 were 0.1，1.0,10 ng/mL,respectively

2.4 方法應(yīng)用

按照本方法測(cè)定了2016年采自山東某溴系阻燃劑生產(chǎn)廠BDE-209生產(chǎn)車間的10份工人尿樣；同時(shí)還測(cè)定了采自北京某高校學(xué)生的10份尿樣進(jìn)行比對(duì)。在10份學(xué)生尿樣中均未檢出待測(cè)物。職業(yè)工人尿樣中有一樣本檢出了較高濃度的BDE-47，BDE-99，BDE-154和BDE-153，濃度為4.8～40.8 pg/mL，但其它尿樣中均未檢出三至七溴聯(lián)苯醚，在所有10份工人尿樣中均檢出BDE-209，濃度為0.42～18.2 ng/mL，平均值為4.25 ng/mL。圖2為檢出十溴聯(lián)苯醚的某車間工人尿樣的質(zhì)量色譜圖。至今為止涉及尿液中BFRs含量分析的文獻(xiàn)極少，Chen等[15]測(cè)定了采集自廣東的新生兒尿液樣本，其中總PBDEs含量在

圖2 檢出十溴聯(lián)苯醚的車間工人尿樣的色譜圖Fig.2 Chromatogram of an urine sample from decabrominated diphenyl ether manufacturing worker

3 結(jié) 論

本文以QuEChERS技術(shù)和氣相色譜-負(fù)化學(xué)源質(zhì)譜法為基礎(chǔ)，建立了尿液中8種多溴聯(lián)苯醚同系物的前處理和檢測(cè)方法，在對(duì)前處理方法和儀器分析條件進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上開展了職業(yè)工人尿液的檢測(cè)。結(jié)果表明QuEChERS技術(shù)能有效地提取尿液中的待測(cè)物并去除雜質(zhì)。NCI/MS測(cè)定PBDEs也獲得了較高的靈敏度和良好的選擇性。本方法簡(jiǎn)便快速，在職業(yè)工人暴露水平監(jiān)測(cè)方面具有較好的應(yīng)用前景。

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Rapid Determination of Polybrominated Diphenyl Ethers in Urine of Occupational Worker Using QuEChERS Coupled to Gas Chromatography-Mass Spectrometry

YU Dong1， WANG De-jun2， ZHU Wen-wen1， CHEN Tian3,SHI Zhi-xiong3*

(1.Department of Laboratory Medicine，Shandong Academy of Occupational Health and Occupational Medicine， Jinan 250062，China；2.Shandong Center for Disease Control and Prevention，Jinan 250014，China； 3.School of Public Health，Captical Medical University，Beijing 100069，China)

A method for the analysis of polybrominated diphenyl ethers(PBDEs) in urine of occupational worker was developed using QuEChERS(quick，easy，cheap，effective，rugged，safe) pretreatment coupled to gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS).Urine sample was extracted with an acetone-hexane mixture by dehydration and salting-out using NaCl and anhydrous MgSO4.The purification was performed with C18particlet,and GC-MS determination was perfomed under negative chemical ionization(NCI) mode.The calibration curves were linear in the ranges of 10-1 000 pg/μL for BDE-209，and 1-100 pg/μL for the rest of analytes，with correlation coefficients higher than 0.999 .The average recoveries were in the range of 91.7%-110.2% at three spiked levels，with relative standard deviations lower than 10%.The limits of detection(LOD) of PBDEs ranged from 0.3 pg/mL to 36 pg/mL.This method was validated to be simple，sensitive and selective，and was suitable for the exposure accessment of pollutant in occupational workers.

polybrominated diphenyl ethers(PBDEs);urine;gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS);occupational worker

2016-12-26；

2017-01-23

國(guó)家自然科學(xué)基金(21477083)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013WS0159)；首都醫(yī)科大學(xué)校自然科學(xué)基金(2016ZR01)；北京市自然科學(xué)基金(7122022)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.010

O657.71;O625.13

A

1004-4957(2017)05-0640-05

*通訊作者：施致雄，博士，副教授，研究方向：環(huán)境分析化學(xué)，Tel:010-83911775，E-mail:szx0127@ccmu.edu.cn