實時熒光定量PCR檢測非小細胞肺癌組織中SP70的表達及意義

梁祥森　陳波　寧宇　韓勝富　陳軍　馮震

【摘要】 目的 探討非小細胞肺癌（NSCLC）組織中SP70抗原的表達及意義。方法 選取40例肺癌組織作為肺癌組[NSCLC 32例（NSCLC組）， 小細胞肺癌8例（小細胞肺癌組）]， 另取20例良性病變肺組織作為肺良性病變組， 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）相對標準曲線法檢測各組中SP70抗原表達的相對水平， 定量分析其與臨床組織病理學特征的關系。結果 肺癌組SP70平均表達水平為（1.798±1.275）pmol/μl， 明顯高于肺良性病變組的（0.921±0.238） pmol/μl， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；NSCLC組 SP70平均表達水平為（2.334±1.268）pmol/μl， 高于小細胞肺癌組的（1.171±1.286）pmol/μl， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；SP70表達水平與患者性別、年齡、TNM分期、淋巴結轉移情況、腫瘤分化程度均無關 （P>0.05）。結論 SP70可能是評價NSCLC的一個潛在的指標。

【關鍵詞】 SP70抗原；非小細胞肺癌；實時熒光定量聚合酶鏈反應

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.12.030

尋求肺癌早期檢測指標及方法是目前研究熱點， 近期有研究發(fā)現(xiàn)一株能特異性識別NSCLC的McAbNJ00l， 此抗體對NSCLC的免疫性診斷和治療意義重大， 其所針對的靶抗原為相對分子質量70000的胞漿新抗原SP70， SP70與NSCLC關系密切[1]。本研究采用實時熒光定量PCR（Q-PCR）相對標準曲線法檢測40例肺癌組織和20例良性病變肺組織中SP70的表達水平， 分析其表達與臨床組織病理學特征的關系， 評價其在臨床診治中的應用價值。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 本院2014年8月～2015年6月手術切除的肺癌組織40例作為肺癌組， 其中NSCLC 32例（NSCLC組）， 小細胞肺癌8例（小細胞肺癌組）。另取20例手術切除的肺良性病變組織作對照（肺良性病變組）， 均由病理確診， 標本收集后立即保存于-80℃冰箱。Trizol液和逆轉錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。TSYBR GreenI熒光染料：北京天根公司。引物由北京諾賽基因公司設計并合成， 目的基因SP70 F： 5′- CCAGTTCAAGTGCTCGG CAT-3′；R： 5′- TTGCTC TTGGAACCTCGGAC-3′。內參β-actin F： 5′-GTGACGTTGACATC CGTAAAGACC-3′；R：5′-CTAG GAGCCAGGGCAGTAATCT -3′。熒光定量PCR儀：Step one V2.1（美國ABI公司）。

1. 2 方法

1. 2. 1 總RNA提取及cDNA合成 按Trizol裂解抽提法提取總RNA， 常規(guī)檢測其純度、濃度及完整性， 將RNA逆轉錄合成cDNA后存放-20℃冰箱備用。

1. 2. 2 標準曲線的制備 將PCR產(chǎn)物目的條帶通過吸附柱式瓊脂糖DNA回收法進行回收純化， 測其濃度后再以10倍系列梯度進行連續(xù)倍比稀釋成106～101 copies/μl數(shù)量級的標準品， 進行實時熒光定量PCR擴增生成標準曲線。

1. 2. 3 相對標準曲線法實時熒光定量PCR擴增 每份標本均擴增SP70和β-actin， 20 ul反應體系：SYBR GreenI reaction mixture：10 ul， 目的基因（10 pmol/μ1）上、下游引物各0.4 μl， cDNA模板2 μl， ddH2O：17.2 μl。反應條件：95℃預變性2 min， 然后95℃20 s， 60℃30 s， 68℃45 s共40個循環(huán)， 按PCR儀默認條件進行溶解曲線分析， 每份標本重復3次， 通過擴增曲線及溶解曲線判定結果是否是陽性。

1. 2. 4 數(shù)據(jù)的標化處理 以同一樣本β-actin模板量為參照， 標化計算SP70的相對模板數(shù)， 即：SP70/β-actin。

1. 3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2. 1 熒光定量PCR評價指標 SP70標準曲線線性關系良好。見圖1。擴增效率R2>0.998， 溶解曲線只有一個單峰。見圖2。特異性高， PCR產(chǎn)物在>87.0℃以上獲得單一熔解峰， 經(jīng)瓊脂糖電泳后所得產(chǎn)物是目的基因SP70所要擴增的條帶。

2. 2 實驗結果 肺癌組SP70平均表達水平為（1.798±

1.275）pmol/μl， 明顯高于肺良性病變組的（0.921±0.238） pmol/μl，

差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；NSCLC組SP70平均表達水平為（2.334±1.268）pmol/μl， 高于小細胞肺癌組的（1.171±

1.286）pmol/μl， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；SP70表達水平與患者性別、年齡、TNM分期、淋巴結轉移情況、腫瘤分化程度均無關 （P>0.05）。見表1。

3 討論

相關研究[1-3]指出SP70是一種針對NSCLC的特異性蛋白靶標， 其存在于癌細胞的胞膜和胞漿， 可促進癌細胞增殖， 是肺癌檢測診斷的分子靶標， 同時也是抗肺癌治療靶點， SP70對于肺癌的診治意義重大。彭蘡等[3]采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）方法檢測NSCLC患者中外周血液中SP70的表達， 結果發(fā)現(xiàn)NSCLC組SP70陽性率明顯高于對照組， 提示SP70可能是診斷NSCLC的潛在血清腫瘤標志物。亦有研究[4-6]發(fā)現(xiàn)惡性胸腔積液中SP70的檢出率明顯增高， 而且NSCLC患者胸腔積液中SP70檢出率高于小細胞肺癌患者， 再次證實了SP70與NSCLC的密切關系。截止目前， 肺癌組織中SP70 mRNA表達的相關研究報道不多， 采用實時熒光定量PCR雙標準曲線法進行檢測尚未見報道。實時熒光定量PCR具有極高的靈敏度、特異性， 能精確分析微量物質的基因表達水平， 而雙標準曲線相對定量法可避免實驗中各基因擴增效率不相等導致的實驗誤差， 保證了實驗數(shù)據(jù)的準確性。

本研究發(fā)現(xiàn)， 肺癌組SP70平均表達水平為（1.798±

1.275）pmol/μl， 明顯高于肺良性病變組的（0.921±0.238） pmol/μl，

差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；NSCLC組 SP70平均表達水平為（2.334±1.268）pmol/μl， 高于小細胞肺癌組的（1.171±

1.286）pmol/μl， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與彭蘡等[3]研究結論一致， 進一步證實了SP70與NSCLC的密切關系， 提示SP70可能是診斷NSCLC的潛在指標。本實驗中內參β-actin在各檢測樣本中均陽性表達， 保證了實驗數(shù)據(jù)的可靠性， 但多數(shù)基因是通過蛋白的表達發(fā)揮作用， 從mRNA到蛋白中間翻譯、修飾過程中可能造成mRNA/蛋白水平倒置現(xiàn)象， 本實驗檢測的mRNA基于基因水平， 需后續(xù)實驗進一步驗證[7]。由于本研究樣本量較少， 隨訪時間短， 未能發(fā)現(xiàn)P70的表達與肺癌預后的關系， 有待于加大樣本量， 加強隨訪， 同時監(jiān)測SP70在外周血液中的表達情況， 可能會發(fā)現(xiàn)SP70與肺癌預后的關系。另外， SP70抗原在胞漿中和胞膜上均有表達， 胞漿中表達量更豐富， 抗癌藥物的作用靶點更為廣泛， 其潛在臨床意義重大。

綜上所述， SP70可能是評價NSCLC的一個潛在的指標， 但其作用機制仍有待于進一步研究探討。

參考文獻

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[3] 彭蘡， 潘世揚， 王芳， 等. 非小細胞肺癌患者血清中SP70的檢測及其臨床意義. 中華檢驗醫(yī)學雜志， 2012， 35（6）：554-558.

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[5] 張丹華. SP70抗原在癌性胸腔積液鑒別診斷中的臨床應用價值. 醫(yī)學綜述， 2015， 21（10）：1865-1866.

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[7] 陳銘伍， 梁祥森， 冼磊. 非小細胞肺癌中MTA1基因的表達及意義. 江蘇醫(yī)藥， 2012， 38（15）：1761-1763.

[收稿日期：2017-02-03]