超聲波協同酶法提取菊苣根多糖工藝優(yōu)化

許 芳,吳雨龍,王俏娜,付愛葉,汪振炯,王仁雷,華 春,*

(1.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京 210046; 2.南京曉莊學院食品科學學院，江蘇南京 211171; 3.江蘇第二師范學院生命科學與化學化工學院，江蘇南京 210013)

超聲波協同酶法提取菊苣根多糖工藝優(yōu)化

許 芳1,2,吳雨龍2,王俏娜2,付愛葉1,2,汪振炯2,王仁雷3,華 春2,*

(1.南京師范大學生命科學學院，江蘇南京 210046; 2.南京曉莊學院食品科學學院，江蘇南京 211171; 3.江蘇第二師范學院生命科學與化學化工學院，江蘇南京 210013)

目的:優(yōu)化超聲波協同酶法提取菊苣根多糖的工藝條件。方法:采用中心組合設計方法(Box-Behnken Design),建立以超聲溫度、超聲時間、加酶量、酶解時間和液料比對菊苣根多糖得率的影響的二次回歸模型。結果:菊苣根多糖提取的最佳工藝條件為超聲溫度45 ℃、超聲時間35 min、加酶量1.6%、酶解時間1.8 h、液料比44∶1 (mL/g),在此條件下,菊苣根多糖的得率為46.75%,與預測得率47.71%接近。結論:該回歸模型有極顯著性,可以作為菊苣根多糖提取工藝的回歸分析和參數優(yōu)化。

菊苣根,多糖,超聲波,纖維素酶,中心組合設計方法

菊苣(CichoriumintybusL.)為菊科菊苣屬多年生藥食兩用草本植物,根肉質、短粗。菊苣主要分布在歐洲、亞洲、北非,我國北京、遼寧、新疆、江西等省市也有分布[1],是維吾爾族和蒙古族常用藥材。菊苣根富含多糖、生物堿、萜類等多種生物活性物質[2-5],而菊苣多糖在降血糖[6-7]、降血脂[8]、抗氧化[9]、保肝[10]、延緩衰老[11-12]、提高機體免疫力[14]等方面都表現出了較好的生物活性。陳立閣等[13]更是發(fā)現奇可力多糖(菊苣多糖)具有抗腫瘤作用,主要體現在菊苣多糖能明顯抑制S180荷瘤小鼠腫瘤的生長,延長S180荷瘤小鼠的生存時間,另對肝癌、胃癌細胞生長亦具有一定抑制作用。菊苣多糖的開發(fā)與應用也已成為食品、醫(yī)藥、生物工程等領域的重要研究方向。

關于植物多糖的提取方法有很多種,如熱水浸提法、酸提、堿提、超濾膜法提取、CO2超臨界萃取法等,但傳統(tǒng)的熱水浸提法提取的效率較低且耗時;酸提法和堿提法的酸堿度和作用時間需嚴格控制,否則會引起多糖的糖苷鍵斷裂,影響多糖的提取率;超濾膜法必須知道多糖的相對分子質量,對于未知的多糖則無法控制;CO2超臨界萃取法成本相對較高。目前,菊苣多糖的提取通常采用熱水浸提法[15],近年來還出現了超聲波提取法、微波提取法以及膜分離集成技術等[16-17],但有關超聲波協同酶法提取菊苣根多糖的研究尚未見報道。超聲波法在植物活性成分提取中具有提高提取率,縮短提取時間,增強提取物活性,節(jié)約能源等優(yōu)勢,具有常規(guī)提取方法難以達到的提取效果[18]。植物細胞的細胞壁主要由纖維素組成,而植物細胞中的活性成分被包裹在細胞壁內,利用纖維素酶特異性水解纖維素,破壞細胞壁,有利于胞內活性成分溶出,從而提高了植物活性成分的提取率[19]。有研究表明,在植物多糖的提取中,超聲波與纖維素酶同時使用,具有協同作用,能顯著提高多糖的提取率[20]。本實驗利用中心組合設計方法(Box-Behnken Design),采用五因素三水平的響應曲面分析法優(yōu)化了超聲波協同酶法提取菊苣根多糖的工藝條件,不僅大大的提高了菊苣根多糖的得率,降低了成本,而且不影響菊苣根多糖的結構與生物活性,為合理開發(fā)利用菊苣資源,提高其附加值以及綜合應用提供可靠的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菊苣根 黃石市潤生農業(yè)科技發(fā)展有限公司,烘干后粉碎備用；纖維素酶(酶比活力>400 U/mg) 南京奧多福尼生物科技有限公司;其它試劑均為分析純。

超聲波清洗儀KQ.250B 江蘇省昆山市超聲儀器有限公司;RE-3000旋轉蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵 上海亞榮生化儀器廠;T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;IEC1010-1臺式冷凍干燥機 美國Labconco公司;BR4I高速冷凍離心機 美國熱電公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菊苣根多糖的提取工藝 菊苣根(切成片狀)→烘干(60 ℃干燥至水分含量為5%)→粉碎→過60目篩→除脂→準確稱取一定量菊苣根粉末→加蒸餾水→加纖維素酶→調節(jié)pH→酶解→滅酶→超聲波處理→離心取上清液(4500 r/min,10 min)→加5倍體積95%乙醇沉淀→4 ℃冰箱靜置過夜→離心取沉淀(4500 r/min,10 min)→收集沉淀冷凍干燥得菊苣根多糖→加水溶解→苯酚-硫酸法測吸光度[21]。

1.2.2 菊苣根多糖含量的測定

1.2.2.1 標準曲線的繪制 精確稱取10.00 mg葡萄糖(105 ℃干燥至質量恒重),置于100 mL容量瓶中定容。精確量取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL,分別置于比色管中,按苯酚-硫酸法測定各管吸光度,另取蒸餾水2 mL(按苯酚-硫酸法進行顯色反應),作為空白對照,于波長 490 nm 處測定吸光度,以葡萄糖濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,得標準曲線回歸方程:y=7.56x+0.175,R2=0.9982。

1.2.2.2 菊苣根多糖得率的測定 取菊苣根多糖供試液1 mL于試管中,以去離子水補加到2 mL,按苯酚-硫酸法進行操作,于490 nm處測定吸光度,按標準曲線計算菊苣根多糖含量。菊苣根多糖得率按以下公式計算:

式中:C為菊苣根多糖濃度,mg/mL;V為菊苣根多糖溶液體積,mL;N為稀釋倍數;M為菊苣根粉末質量,g。

1.2.3 單因素實驗 以蒸餾水為提取溶劑,超聲功率為250 W,依次固定超聲溫度40 ℃、超聲時間40 min、加酶量2%、酶解時間1.5 h、液料比40∶1 (mL/g),分別考察不同超聲溫度、超聲時間、加酶量、酶解時間和料液比對菊苣根多糖得率的影響,各實驗重復3次。

1.2.4 中心組合設計方法優(yōu)化提取工藝設計 在單因素實驗結果的基礎上,采用Box-Behnken Design設計方法[22],以超聲溫度、超聲時間、加酶量、酶解時間和料液比為自變量,以菊苣根多糖得率為響應值設計實驗,并采用響應面分析法來分析各因素之間的交互作用,以確定最佳的工藝條件。實驗因素和水平見表1。

表1 中心組合設計的因素與水平設計

1.2.5 統(tǒng)計學分析 采用Graphpad prism 6對數據進行處理和分析,并采用Design-Expert 8.0軟件對響應面實驗結果進行分析,考察二次回歸模型及因素的顯著性(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

圖1 超聲溫度、超聲時間、加酶量、酶解時間和液料比對菊苣根多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic temperature,ultrasonic time,enzyme dosage,enzymolysis time and liquid-to-solid ratio on extraction yield of Chicory roots polysaccharides

由圖1A可知,菊苣根多糖得率隨著超聲溫度的增加而提高,當溫度達到40 ℃時菊苣根多糖得率達到最高(37.44%),后隨著超聲溫度的增加菊苣根多糖得率開始下降。原因可能是隨著超聲溫度的升高,水中的小氣泡(空化核)增多,對產生空化作用有利,菊苣根細胞破裂加速,菊苣根多糖溶出增加,但超聲溫度過高時,氣泡中的蒸氣壓太高,將增強氣泡閉合時的緩沖作用,導致空化作用減弱,導致菊苣根多糖的得率降低[23];另隨著超聲溫度的升高,纖維素酶的活性增強,菊苣根多糖溶出增加,但當超聲溫度過高時會導致纖維素酶失活,從而影響菊苣根多糖的得率[24]。因此,選擇40 ℃作為本實驗超聲溫度。

由圖1B可知,菊苣根多糖得率隨著超聲時間的增加而提高,當時間達到40 min時菊苣根多糖得率達到最高(38.29%),后隨著超聲時間的增加菊苣根多糖得率開始下降。原因可能是超聲波具有的機械效應,空化效應和熱效應使得菊苣根的細胞瞬間破碎,從而使菊苣根多糖快速溶出,而超聲時間過長可能會導致多糖被破壞,影響菊苣根多糖的得率[25]。另外,因超聲時間過長耗能增加,成本升高,考慮到生產成本,暫定超聲時間為40 min。

由圖1C可知,菊苣根多糖得率隨著添加的纖維素酶量的增加而不斷提高,當加酶量為1.5%時,菊苣根多糖含量為35.89%;當加酶量超過1.5%后,隨著加酶量的增加,菊苣根多糖得率的增加趨于平緩。原因可能是由于菊苣根細胞的細胞壁含大量纖維素,經纖維素酶酶解后導致細胞壁被破壞,從而使得菊苣根多糖快速溶出,菊苣根多糖得率增加;當加酶過多時由于沒有反應底物,從而使得菊苣根多糖得率維持在穩(wěn)定的水平[26]。考慮到增加纖維素酶對菊苣根多糖提取率的提高沒有明顯作用,故選擇纖維素酶的添加量為1.5%。

由圖1D可知,菊苣根多糖得率隨著酶解時間的增加而不斷提高,當酶解時間為2.0 h時,菊苣根多糖含量達37.58%;當酶解時間超過2.0 h時,隨著時間的延長,菊苣根多糖得率趨于平緩甚至略有下降。原因可能是剛開始酶的底物比較充足,隨著時間的延長,底物不斷減少直至酶解反應結束時,即使酶解時間繼續(xù)延長，菊苣根多糖得率也不會繼續(xù)增加,甚至可能由于酶解時間的延長,其它因素對多糖造成破壞,反而使多糖得率降低,這與玄光善等[26]提取樺褐孔菌多糖的結果類似,所以最適酶解時間為2.0 h。

由圖1E可知,菊苣根多糖得率隨著液料比的增加而不斷提高,當液料比達40∶1 (mL/g)時,菊苣根多糖得率達最大值(35.25%),此后隨著液料比的增加菊苣根多糖得率反而降低。原因可能是液料比越大,即水溶劑用量越大,越有利于水溶性菊苣根多糖的溶出,導致菊苣根多糖得率增加,但當液料比達一定值后,隨著水溶劑用量的增加,會造成提取液中纖維素酶濃度的降低,也會造成單位提取液中菊苣根多糖濃度的降低,導致菊苣根多糖提取率的下降,同時還增加了后續(xù)濃縮工作中的能耗[26]。因此,綜合提取效果和降低成本等方面考慮,選擇液料比為40∶1 (mL/g)左右比較合適。

2.2 中心組合設計實驗結果分析

2.2.1 菊苣根多糖得率回歸模型的建立與分析 中心組合設計實驗結果分析見表2,運用Design-Expert 8.0軟件進行多元回歸擬合,建立以菊苣根多糖得率與各提取條件之間的響應面回歸模型,得二次多項式回歸方程:

Y=43.12+2.22X1-2.80X2+4.21X3-1.66X4-1.06X5-3.60X1X2+0.68X1X3-1.68X1X4+8.95X1X5+1.10X2X3+4.45X2X4+0.65X2X5+1.53X3X4-0.15X3X5-4.50X4X5-7.24X12-4.21X22+1.62X32-4.09X42-6.26X52

表2 中心組合設計實驗設計與結果

為驗證回歸方程的有效性,對菊苣根多糖得率的回歸模型進行方差分析,結果見表3。由表3可知,菊苣根多糖得率的回歸模型具有極顯著性(p<0.0001),且失擬性具有不顯著性(p>0.05),說明該回歸模型比較好。Joglekar等[27]指出復相關系數(R2)大于0.80,且校正復相關系數(AdjR2)和預測復相關系數(PredR2)較為接近的情況下,表明方程的擬合度較好?；貧w方程中R2=0.9700,說明該模型能夠解釋97.00%響應值的變化;AdjR2=0.9460,PredR2=0.9263,二者較為接近,說明該模型具有較好的回歸性。因此,該回歸方程可以很好的對超聲波法協同酶法提取菊苣根多糖的得率進行預測與分析。從5個因素對菊苣根多糖得率的影響來看,一次項中X2、X3、X5,二次項中X12、X22、X42、X52,交互項中X1X2、X1X5、X2X4、X4X5對菊苣根多糖得率影響極顯著。由F值可知,各因素對菊苣根多糖得率的影響次序依次為X3>X2>X5>X4>X1。

表3 菊苣根多糖得率回歸模型方差分析表

2.2.2 菊苣根多糖得率響應面兩因素具明顯交互作用分析 由圖2A可知,當超聲時間一定時,菊苣根多糖得率隨超聲溫度的升高呈先上升后下降的趨勢;當超聲溫度一定時,菊苣根多糖得率隨超聲時間的延長呈先上升后下降趨勢。由圖2B可知,當液料比一定時,菊苣根多糖得率隨超聲溫度的升高呈先上升后下降的趨勢;當超聲溫度一定時,菊苣根多糖得率隨液料比的增加也呈先上升后下降的趨勢。由圖2C可知,當酶解時間一定時,菊苣根多糖得率隨超聲時間的增加呈先上升后下降的趨勢;當超聲時間一定時,菊苣根多糖得率隨酶解時間的延長而上升。由圖2D可知,當液料比一定時,菊苣根多糖得率隨酶解時間的延長而上升;當酶解時間一定時,菊苣根多糖得率隨液料比的增加呈先上升后下降的趨勢。

2.2.3 菊苣根多糖最佳提取工藝條件的確定和驗證 根據二項回歸模型的預測,得出菊苣根多糖最佳提取工藝條件為超聲溫度44.24 ℃、超聲時間35.51 min、加酶量1.58%、酶解時間1.73 h、液料比43.76∶1(mL/g)?？紤]到實際操作的便利性,修正菊苣根多糖最佳提取工藝條件為超聲溫度45 ℃、超聲時間35 min、加酶量1.6%、酶解時間1.8 h、液料比44∶1 (mL/g),在此條件下,菊苣根多糖的實際得率為46.75%(3次平行實驗),與預測得率47.71%接近,表明該模型與實際情況擬合較好,可以用來預測實驗結果,可以作為超聲波協同酶法提取菊苣根多糖的工藝的回歸分析和參數優(yōu)化。

超聲波協同酶法可以使植物組織的細胞結構被破壞,使得植物組織中的多糖成分快速溶解到提取溶劑中,使得多糖提取率明顯高于傳統(tǒng)提取法,而且對多糖的結構和活性無影響[28]。Ebringerova等[29]研究表明在一定的超聲波條件下不僅不會造成水溶性活性分子結構的破壞和分子特性的改變,而且還通過免疫細胞實驗證明超聲波有利于增強提取物的生物活性。本實驗采用超聲波協同纖維素酶法提取菊苣根中的多糖,得率達46.75%,與莊紅艷等[30]提出的關于菊苣中菊苣多糖的含量不低于43.056%相一致,且顯著高于爾西丁·買買提等[15]以及周俊等[31]用傳統(tǒng)方法提取菊苣多糖的得率(分別為3.80 mg/g和7.0745 mg/g),提示菊苣根多糖具有較好的開發(fā)潛力。

3 結論

采用超聲波協同酶法提取菊苣根中多糖,根據單因素實驗和中心組合設計實驗研究獲得菊苣根多糖提取的最佳工藝條件為超聲溫度45 ℃、超聲時間35 min、加酶量1.6%、酶解時間1.8 h、液料比44∶1 (mL/g),且在此條件下菊苣根多糖的最終得率為46.75%,證明該回歸模型可以優(yōu)化菊苣根多糖提取工藝的參數,提高多糖得率,節(jié)約成本,具有一定實際參考價值。

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Optimization of extraction technology of polysaccharide from roots ofCichoriumintybusL. by ultrasound assisted with enzyme hydrolysis

XU Fang1,2,WU Yu-long2,WANG Qiao-na2,FU Ai-ye1,2,WANG Zhen-jiong2,WANG Ren-lei3,HUA Chun2,*

(1.College of Life Sciences,Nanjing Normal University,Nanjing 210046,China; 2.School of Food Science,Nanjing Xiaozhuang University,Nanjing 211171,China; 3.School of Life Science and Chemistry,Jiangsu Second Normal University,Nanjing 210013,China)

Objective:Optimization of extraction technology of polysaccharide from roots ofCichoriumintybusL. by ultrasound assisted with enzyme hydrolysis. Methods:To establish the effects of ultrasonic temperature,ultrasonic time,enzyme dosage,enzyme solution time and liquid to solid ratio onChicoryroots polysaccharide yield of quadratic regression model by using Box-Behnken design. Results:The optimum extraction conditions of polysaccharide from roots ofCichoriumintybusL. were ultrasonic temperature 45 ℃,ultrasonic time 35 min,enzyme dosage 1.6%,enzymolysis time 1.8 h,liquid-to-solid ratio of 44∶1 (mL/g). Under these conditions,the extraction ofChicoryroots polysaccharide was 46.75%,closed to the predicted yield of 47.71%. Conclusion:The regression model was significant,could be used as thechicoryroots polysaccharide extraction process of regression analysis and parameter optimization.

Chicoryroots;polysaccharide;ultrasound;cellulose;Box-Behnken Design

2016-11-14

許芳(1990-),女,碩士研究生,研究方向：植物生理生化,E-mail:wyl_8080@sina.com。

*通訊作者:華春(1963-),女,本科,教授,研究方向：植物生理生化,E-mail:hc3501988@163.com。

國家高技術研究發(fā)展計劃(2012AA021701);國家自然科學基金(21376112);江蘇省自然科學基金(BK20141081);南京市環(huán)境科學與工程重點學科建設項目(20141123);江蘇省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201611460001Z)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)09-0168-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.024