袁 航,汪 闖,王琴容,趙 艷,李雅潔,龍妮婭,周建獎(jiǎng)
(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550004)
阻斷胃泌素受體對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡及其信號(hào)通路的影響*
袁 航,汪 闖,王琴容,趙 艷,李雅潔,龍妮婭,周建獎(jiǎng)△
(貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550004)
目的 探討阻斷胃泌素受體對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡及其相關(guān)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。方法 試驗(yàn)組使用終濃度為5 mmol/L的丙谷胺(胃泌素受體阻斷劑)處理胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS 6 d,以不加丙谷胺培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞SGC-7901和AGS為對(duì)照組。四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)法檢測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期,Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡;實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)方法檢測(cè)典型Wnt/β-catenin通路、核因子κB、磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白中關(guān)鍵蛋白β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、核轉(zhuǎn)錄因子RelA、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白、糖原合酶激酶3β mRNAs的表達(dá);免疫蛋白印跡檢測(cè)β-catenin蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果 用丙谷胺處理后,試驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度低于對(duì)照組細(xì)胞,細(xì)胞周期中S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)也低于對(duì)照組細(xì)胞,而G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)高于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05);試驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡數(shù)高于對(duì)照組(P<0.05); RT-qPCR結(jié)果顯示:丙谷胺處理后,胃癌細(xì)胞中β-catenin的 mRNA表達(dá)量降低(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示丙谷胺處理后,β-catenin蛋白質(zhì)的表達(dá)量降低(P<0.05)。結(jié)論 阻斷胃泌素受體能下調(diào)胃癌細(xì)胞中β-catenin的表達(dá),抑制細(xì)胞增殖,同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
胃腫瘤;胃泌素類;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞增殖;丙谷胺;β-catenin
胃泌素是一種由胃竇部的G細(xì)胞合成分泌的肽類激素,胃泌素受體主要是膽囊收縮素-B(cholecystokinin-B receptor,CCK-B)受體,通常表達(dá)在胃腸道細(xì)胞的細(xì)胞膜上[1]。 已有證據(jù)表明,幽門螺旋桿菌(HP)感染會(huì)引起高胃泌素血癥[2-3],本課題組前期研究也表明HP感染會(huì)上調(diào)胃泌素基因mRNA的表達(dá)水平[4],而HP感染作為胃癌高發(fā)的生物因素,已經(jīng)得到公認(rèn),因此胃泌素可能與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本課題組前期的體外研究也發(fā)現(xiàn),胃泌素及其受體在胃癌細(xì)胞株AGS、SGC-7901均有表達(dá),用商品化胃泌素處理細(xì)胞后,兩種細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng)[5-6]。丙谷胺具有跟胃泌素相似的結(jié)構(gòu),能夠與胃泌素競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合胃泌素受體,是胃泌素受體的阻斷劑[7]。為了探究阻斷胃泌素受體對(duì)胃癌細(xì)胞的作用及其可能的信號(hào)通路,本研究用丙谷胺處理胃癌細(xì)胞株SGC-7901和AGS,檢測(cè)細(xì)胞的增殖、凋亡及相關(guān)信號(hào)通路中幾個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá),包括Wnt、核因子kappa B(NF-κB)、磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸-哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-AKT-MTOR)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、核轉(zhuǎn)錄因子(Rel A P65)、MTOR、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β),尋找胃泌素的作用途徑及胃癌可能的治療靶點(diǎn)。
1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株 SGC-7901和AGS購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),由本實(shí)驗(yàn)室保存。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco,美國(guó)),丙谷胺(國(guó)家食品藥品檢定研究所),青鏈霉素(Hyclone,美國(guó)),細(xì)胞總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Tiangen,中國(guó)),四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)試劑盒、Western blot相關(guān)試劑、蛋白提取試劑盒(碧云天,中國(guó)),瓊脂糖(Sigma,美國(guó)),八連管(ABI,美國(guó)),SYBER Green (ABI,美國(guó)),細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(BD,美國(guó)),二喹啉甲酸 (BCA)蛋白定量試劑盒(Thermo,美國(guó)),β-catenin一抗、羊抗兔二抗(Proteintech,美國(guó))。
1.2 方法
1.2.1 胃癌細(xì)胞株SGC-7901和AGS的培養(yǎng) 用含5%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基,于5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)80%以上融合度時(shí)進(jìn)行傳代,備用。
1.2.2 MTT試驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩種細(xì)胞以2×103/孔接種于96孔板,試驗(yàn)組加入含5 mmol/L丙谷胺的RPMI 1640完全培養(yǎng)基200 μL,對(duì)照組用RPMI 1640完全培養(yǎng)基,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,37 ℃,5%CO2培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液,每孔加20 μL MTT 液。孵育4 h后,去上清液,加入DMSO每孔150 μL,振蕩器振蕩10 min,于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)各孔吸光度(A)值,連續(xù)檢測(cè)7 d后繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。
1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡 試驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng),3 d后換液,繼續(xù)培養(yǎng)3 d,棄培養(yǎng)基后PBS洗3次,加入胰酶消化收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡,按試劑說(shuō)明書操作。試驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.4 RT-qPCR檢測(cè)各信號(hào)通路中關(guān)鍵基因mRNA的表達(dá) 取各組細(xì)胞,按試劑盒步驟提取總RNA,去除gDNA。反應(yīng)體系如下:5×gDNA Buffer 2.0 μL,總RNA 2 μg,RNase-Free ddH2O補(bǔ)足10.0 μL,37 ℃ 孵育30 min。隨后用Oligo dt逆轉(zhuǎn)成cDNA。體系為 MIX 10.0 μL,上、下游引物各0.5 μL,cDNA模板2.0 μL,去離子水補(bǔ)足至20.0 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,60 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。收集各基因的熒光信號(hào),以β-action為內(nèi)參基因,SDS 1.4軟件計(jì)算試驗(yàn)組細(xì)胞中各靶基因的相對(duì)表達(dá)量。用融解曲線監(jiān)測(cè)各樣本PCR反應(yīng)的特異性,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率,試驗(yàn)重復(fù)3次,每次3個(gè)復(fù)孔。計(jì)算公式:△Ct=待測(cè)基因Ct值-β-actin Ct值,△△Ct=試驗(yàn)組△Ct-對(duì)照組△Ct,相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。qPCR引物序列見(jiàn)表1。
1.2.5 Western blot 檢測(cè)β-catenin蛋白質(zhì)的表達(dá) 取試驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞,提取總蛋白,BCA蛋白定量試劑盒定量后,取20 μg總蛋白上樣,10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳3.0 h后轉(zhuǎn)膜封閉,兔抗β-catenin多克隆抗體(1∶1 500)4 ℃孵育過(guò)夜,加入山羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)及HRP-β-actin(1∶10 000)孵育1 h后暗室膠片曝光。用Image J軟件處理?xiàng)l帶并讀取灰度值,試驗(yàn)重復(fù)3次。
2.1 阻斷胃泌素受體對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 丙谷胺處理細(xì)胞后,試驗(yàn)組SGC-7901、AGS細(xì)胞在培養(yǎng)第4天時(shí)A值低于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.05),培養(yǎng)第7天時(shí)兩組差異最大,見(jiàn)圖1。
表1 qPCR引物序列
A:SGC-7901;B:AGS。
圖1 SGC-7901(A)和AGS(B)的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線
2.2 阻斷胃泌素受體對(duì)細(xì)胞周期的影響 丙谷胺處理6 d后,試驗(yàn)組細(xì)胞的S期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯低于對(duì)照組細(xì)胞,G0/G1期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯高于對(duì)照組細(xì)胞,比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2。
2.3 阻斷胃泌素受體對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 丙谷胺處理細(xì)胞6 d后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示試驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組細(xì)胞,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖3。
2.4 阻斷胃泌素受體對(duì)信號(hào)蛋白β-catenin、P65、MTOR、GSK-3β mRNA表達(dá)的影響 試驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞的總RNA,A260/A280比值為1.8~2.0,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), RNA 28 s與18 s 的比例為1.5~2.0,提示RNA質(zhì)量較好。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示各基因的溶解曲線均為單峰,各基因的擴(kuò)增特異性較好。 丙谷胺處理后,試驗(yàn)組的β-catenin mRNA的表達(dá)量比對(duì)照組顯著降低,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而其他基因的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)圖4。
2.5 阻斷胃泌素受體對(duì)β-catenin蛋白表達(dá)的影響 丙谷胺處理細(xì)胞6 d后,試驗(yàn)組兩種胃癌細(xì)胞中的β-catenin蛋白質(zhì)表達(dá)較對(duì)照組明顯下調(diào),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖5。
*:P<0.05,與對(duì)照組比較。
圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果
*:P<0.05,與對(duì)照組比較。
圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果
*:P<0.05,與對(duì)照組比較。
圖4 信號(hào)通路中相關(guān)基因mRNA的表達(dá)
*:P<0.05,與對(duì)照組比較。
圖5 丙谷胺處理對(duì)β-catenin蛋白表達(dá)的影響
胃泌素促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用在諸多研究中已經(jīng)證實(shí), Cao等[8]在結(jié)腸癌細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)胃泌素有類似的作用,并且闡明是通過(guò)激活β-catenin/Tcf-4通路發(fā)揮作用。然而阻斷胃泌素受體對(duì)胃癌細(xì)胞作用的潛在機(jī)制的報(bào)道較少。為了進(jìn)一步探究丙谷胺對(duì)胃癌細(xì)胞株SGC-7901、AGS的作用,本研究根據(jù)前期結(jié)果用丙谷胺處理胃癌細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng),細(xì)胞周期,細(xì)胞凋亡。與楊瑩瑩等[9]的結(jié)果相似,試驗(yàn)組細(xì)胞的增殖受到抑制。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果提示阻斷胃泌素受體可能阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S 期,從而抑制細(xì)胞增殖。流式細(xì)胞儀檢測(cè)的結(jié)果還顯示,試驗(yàn)組的凋亡細(xì)胞數(shù)增加,提示阻斷胃泌素受體不僅能抑制胃癌細(xì)胞的增殖,還能促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡,這些結(jié)果與國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究結(jié)果一致[10-11]。
為了探討丙谷胺的作用機(jī)制,本研究用定量PCR技術(shù)篩查了與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)信號(hào)通路中幾個(gè)關(guān)鍵蛋白的mRNA表達(dá),包括Wnt、NF-κB、PI3K-AKT-MTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin、P65、MTOR及GSK-3β,結(jié)果僅有β-catenin mRNA的表達(dá)水平在處理的2株細(xì)胞中一致性的明顯降低,隨后用Western blot證實(shí)β-catenin蛋白表達(dá)量在丙谷胺處理后也一致性的明顯降低。β-catenin的功能主要體現(xiàn)在2個(gè)方面:(1)與E-cadherin組成復(fù)合物參與細(xì)胞間的黏附[12];(2)作為經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白參與通路的激活[13]。在腫瘤細(xì)胞中,當(dāng)Wnt蛋白與受體結(jié)合后,會(huì)抑制此β-catenin降解復(fù)合物的形成,使β-catenin在胞內(nèi)聚集進(jìn)而轉(zhuǎn)移至核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子Tcf/Lef-1 結(jié)合,引起c-Myc、Cyclin-D1、survivin等轉(zhuǎn)錄,引起腫瘤的發(fā)生[14-16]。同時(shí)也會(huì)調(diào)節(jié)眾多上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)移(EMT)相關(guān)蛋白如MMP7、Snail、Twist等表達(dá),誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[17]。研究發(fā)現(xiàn),β-catenin在胃癌組織高表達(dá),同時(shí)與胃癌惡性程度正相關(guān),并且隨著浸潤(rùn)深度的增加而增加,推測(cè)可能是E-cadherin與β-catenin的復(fù)合物中E-cadherin的丟失使得癌細(xì)胞黏附減弱,易于脫落,促進(jìn)了腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[18]。同時(shí),β-catenin從膜E-cadherin的結(jié)合部位分離,會(huì)更多地在胞內(nèi)聚集,從而激活Wnt信號(hào)通路,使腫瘤進(jìn)展。因此,有諸多學(xué)者認(rèn)為β-catenin的異常表達(dá)可能作為胃癌進(jìn)展的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)[19]。
在體外試驗(yàn)中,潘安萍等[20]用慢病毒載體沉默胃癌細(xì)胞中β-catenin蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默β-catenin后能夠減慢細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,使眾多癌基因的表達(dá)下調(diào)。結(jié)合本研究,推測(cè)丙谷胺阻斷胃泌素受體后,可能通過(guò)下調(diào)β-catenin的表達(dá),抑制Wnt信號(hào)通路,進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡,提示β-catenin有可能成為胃癌治療的靶點(diǎn)之一,但是具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。
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Influence of blocking gastrin receptor on the proliferation and apoptosis and expression of key proteins in related pathway of gastric cancer cell*
YuanHang,WangChuang,WangQinrong,ZhaoYan,LiYajie,LongNiya,ZhouJianjiang△
(KeyLaboratoryofMolecularBiologyofGuizhouMedicalUniversity/KeyLaboratoryofEndemicandMinorityDiseases,MinistryofEducationGuiyang,Guiyang,Guizhou550004,China)
Objective To investigate the effects of blocking gastrin receptor on the proliferation,apoptosis and expression of key proteins in the related pathway in gastric cancer cell lines.Methods In the experimental group,the gastric cancer cell lines SGC-7901 and AGS cells were treated with 5 mmol/L proglumide,a kind of a gastrin receptor antagonist.And the normal cultured gastric cancer cells SGC-7901 and AGS were used in control group.The growth of each group was detected by MTT assay;the cell growth curve was drawn by flow cytometry;the cell cycle of each group was detected by flow cytometry.Annexin V-FITC/PI double staining was used to detect the cell growth of apoptosis.The relative mRNA expression of β-catenin,nuclear factor-P65,mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 beta in Wnt,NF-κB and PI3K-AKT-MTOR pathways were detected by RT-qPCR.The expression of β-catenin protein was detected by Western blotting.Results After treatment with proglumide,the growth of the cells in the experimental group was lower than that in the control group;and the proportion of S phase cells in the cell cycle was also lower than that in the control group,but the proportion of cells in G0/G1phase was higher than that in the control group (P<0.05).The percentage of apoptotic cells was also increased after treatment with proglumide(P<0.05).Furthermore,proglumide treatment significantly reduced the expression of β-catenin at both mRNA and protein levels(P<0.05).Conclusion Blocking gastrin receptor can down-regulate the expression of β-catenin,inhibit the cell proliferation and promote the cell apoptosis in gastric cancer cells.
stomach neoplasms;gastrins;apoptosis;cell proliferation;proglumide;β-catenin
著·
10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.001
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260303,31560326);貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合LH字[2015]7360)。 作者簡(jiǎn)介:袁航(1989-),住院醫(yī)師,碩士,主要從事胃癌方面研究?!?/p>
,E-mail:jianjiangzhou@sina.cn。
R735.2
A
1671-8348(2017)15-2017-04
2016-11-18
2017-01-06)