轉(zhuǎn)移相關(guān)基因2對喉癌細胞系Hep-2的增殖、遷移和侵襲的影響

馬鵬，馮俊，杜經(jīng)緯

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 南充 637000)

轉(zhuǎn)移相關(guān)基因2對喉癌細胞系Hep-2的增殖、遷移和侵襲的影響

馬鵬，馮俊，杜經(jīng)緯

(川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 南充 637000)

目的：探討轉(zhuǎn)移相關(guān)基因2(MTA2)對喉癌細胞系Hep-2的增殖、遷移和侵襲的影響。方法：通過針對MTA2基因的小干擾RNA(siRNA-MTA2)對MTA2基因表達進行下調(diào)，采用RT-PCR和Transwell檢測轉(zhuǎn)染，作為實驗組，對照組轉(zhuǎn)染陰性對照(sicontrol)，通過MTT、細胞劃痕實驗和Transwell法分別檢測MTA2對Hep-2的增殖、遷移和侵襲的影響。結(jié)果：實驗組MTA2mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，實驗組培養(yǎng)7d和9d時細胞增殖能力明顯低于對照組(P<0.05)，實驗組細胞遷移能力和細胞侵襲能力明顯低于對照組(P<0.05)。結(jié)論：MTA2與喉癌細胞系Hep-2細胞增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)，有望成為治療喉癌的靶點。

MTA2；喉癌細胞；Hep-2；增殖；遷移

喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，嚴重威脅著患者的身體健康[1]。研究證實，抑癌基因功能缺失性突變以及喉癌原癌基因的異常表達會引發(fā)腫瘤細胞過度增殖[2]。MTA2是一種促癌基因，能夠調(diào)節(jié)細胞骨架的構(gòu)建和腫瘤細胞的凋亡[3]，而關(guān)于MTA2對喉癌細胞系Hep-2生物學(xué)行為的影響目前比較少。為了探討MTA2對喉癌細胞系Hep-2的增殖、遷移和侵襲的影響，本文作出如下研究。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

Transwell小室、MTA2抗體、DMEM、Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG試劑盒(美國英杰生命技術(shù)有限公司)；siRNA-MTA2、體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA與陰性對照(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑(美國Promega公司)；ABI 7500 Sequence Detector儀器(美國ABI公司)；喉癌細胞系Hep-2(中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) Hep-2細胞在含有10%的胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)液中，在飽和濕度環(huán)境為37 ℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)，當(dāng)細胞處于對數(shù)生長期時取出。

1.2.2 RT-PCR檢測 快速提取(TRIZOL法)細胞總RNA，取2 μg，在37 ℃下通過逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA酶抑制劑反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用TaqMan探針、cDNA 40 ng、Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG 10 μL、濃度為10 μmol/L的正義反義引物0.4 μL。反應(yīng)條件及操作步驟如下：50 ℃下溫育處理2 min，95 ℃下預(yù)變性處理3 min，95 ℃下變性處理半分鐘，58 ℃下退火延伸1 min，將上述操作循環(huán)往復(fù)40次。各基因分別檢測三次，將熒光信號到達閥值時的循環(huán)次數(shù)作為CT值，△T值為目的基因CT值減去管家基因CT值，以2-△CT表示mRNA的相對表達量。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡檢測 制備聚丙烯酰胺垂直平板凝膠(4%濃縮膠和10%分離膠)，40 μg總蛋白通過80V電壓電泳3 h后，再70 V電壓電泳3 h，轉(zhuǎn)印至PVDF膜。在室溫下，用TBS-T溶液封閉1 h，然后加入鼠抗人MTA2一抗，內(nèi)參抗體選擇β-actin，于4 ℃下輕搖過夜，用TBS-T洗6遍，添加以HRP標記過的二抗，在室溫下孵育1 h，然后再用TBS-T洗6遍，用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測試劑顯色1～2 min，X線光片曝光顯影，觀察細胞核組織中MTA2蛋白表達。

1.2.4 siRNA轉(zhuǎn)染 實驗組轉(zhuǎn)染小干擾RNA(siRNA-MTA2)，對照組轉(zhuǎn)染陰性對照(sicontrol)，將2×105個Hep-2細胞接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)一段時間。用100 nmol/L小干擾RNA(siRNA-MTA2)和陰性對照分別與2 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑在50 μL培養(yǎng)基中溶解，經(jīng)過5 min孵育后再充分混合20 min，置入500 μL OPTI-DMEM無血清培養(yǎng)基細胞中，培養(yǎng)6 h后，再用含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h后即可進行蛋白表達、基因表達檢測等實驗。

1.2.5 MTT檢測 將Hep-2分別用Lipofectamine 2000、陰性對照和siRNA-MTA2進行轉(zhuǎn)染，48 h后用胰酶對對數(shù)期生長細胞進行消化處理，然后予以離心處理，得到細胞懸浮液，然后將細胞計數(shù)濃度設(shè)為1 000～10 000/孔，孵育處理(37 ℃、5% CO2)，待孔底鋪滿細胞后，每個樣品做三個復(fù)孔，分別于24/48/72 h加入10 mL 5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4 h后，用PBS沖洗2～3遍，每個孔中添加二甲基亞砜(DMSO)100 μL，緩慢振蕩10 min，通過酶聯(lián)免疫法測量各孔在490 nm處的吸光度(A值)。

1.2.6 Transwell檢測 將在500 μL無血清培養(yǎng)基的5×104個siRNA-MTA2和陰性對照細胞分別在含Metrigel和不含Metrigel得Transwell上室，在下層加入75 μL含有10%的FBS細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，8 h后將Transwell小室取出，用棉簽輕輕擦去上層未穿孔的細胞，然后用蘇木素做染色處理并封片，于鏡下觀察穿孔細胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均經(jīng)EXCEL錄入計算機，使用SPSS 19.0處理，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05說明組間差異具統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率鑒定

實驗組mRNA表達水平及蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)。見圖1和圖2。

2.2 MTA2對Hep-2細胞增殖的影響

實驗組培養(yǎng)7 d和9 d時細胞增殖能力明顯低于對照組(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 各組吸光度比較

*P<0.05，與對照組比較。

2.3 MTA2對Hep-2細胞遷移的影響

實驗組細胞遷移能力明顯低于對照組(P<0.05)，見圖3。

2.4 MTA2對Hep-2細胞侵襲的影響

實驗組細胞侵襲能力明顯低于對照組(P<0.05)，見圖4。

3 討論

喉癌在臨床上比較常見，是頭頸部惡性程度較高的腫瘤之一，目前臨床上通過化療、放療和手術(shù)治療均不能起到明顯的療效，預(yù)后較差，對患者的生活質(zhì)量無顯著改善[4]。隨著研究的深入，喉癌治療得到一定程度的突破，腫瘤分子生物學(xué)技術(shù)在喉癌治療中得到應(yīng)用，而且喉癌發(fā)病機制也得到深入研究，分子靶向治療和抑癌基因成為治療喉癌的重要手段。

MTA2是一種新型的促癌基因，蛋白分子量為70KDa，編碼為668個氨基酸，基因定位在11q1213[5]。研究證實，MTA2會參與到核小體的組成中，在多種腫瘤細胞系中表達且與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[6-7]。本研究結(jié)果顯示，實驗組MTA2mRNA和蛋白表達水平明顯低于對照組(P<0.05)，實驗組培養(yǎng)7 d和9 d時細胞增殖能力明顯低于對照組(P<0.05)，實驗組細胞遷移能力和細胞侵襲能力明顯低于對照組(P<0.05)，這可能是由于MTA2對細胞粘附進行調(diào)節(jié)，對細胞外基質(zhì)進行降解最終實現(xiàn)。

MTA2可作為檢測細胞轉(zhuǎn)移的重要指標，是一個潛在的分子標志物，但是其分子機制尚不明確[8-9]。有研究指出，MTA2對SETD6啟動子活性具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能，可加快乳腺癌細胞的擴散、增殖及侵襲[10-12]。本研究結(jié)果提示，MTA2對喉癌細胞的擴散、增殖、侵襲等具有顯著抑制效果，可據(jù)此推測，MTA2有很大可能參與了腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程[13]。

綜上所述，MTA2與喉癌細胞系Hep-2細胞增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)，能夠起到促癌基因的作用，有可能用于喉癌的臨床診斷與治療。

[1] 郭俊宇.丹酚酸B對人喉癌Hep-2細胞增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及機制研究[J].醫(yī)學(xué)研究雜志，2015，44(12)：112-116.

[2] 劉學(xué)軍，黃賽瑜，高金建.吲哚-3-甲醇對人喉癌 Hep-2細胞增殖的抑制作用研究[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2015，31(11)：932-934.

[3] 張軍，張耀明.草蓯蓉多糖提取物誘導(dǎo)人喉癌Hep2細胞凋亡的實驗研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2014，(8)：947-949.

[4] 隋穎，康健，王曉光.丹皮酚誘導(dǎo)人喉癌Hep-2細胞凋亡的體外研究[J].實用腫瘤學(xué)雜志，2013，27(4)：344-349.

[5] 于鋒,黃鑫,艾毛毛,等.siRNA干擾β-catenin基因表達后喉癌Hep-2細胞對順鉑化療敏感性的研究[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2015,29(13):1143-1147.

[6] 衛(wèi)旭東,何健,高江霞,等.人喉癌Hep-2細胞系CD133^+腫瘤干細胞自我更新機制研究[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2014,28(21):1636-1641.

[7] 林雁，尹芳，袁瑩，等.內(nèi)皮素拮抗劑抑制人源性喉癌Hep-2細胞VEGF-C體外表達的定量分析[J].昆明理工大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2013，38(4)：71-74.

[8] Bian K,Fan J,Zhang X,etal.MicroRNA-203 leads to G1 phase cell cycle arrest in laryngeal carcinoma cells by directly targeting survivin[J].FEBS Letters,2012,24(6):106-109.

[9] Cao P,Zhou L,Zhang J,etal.Comprehensive expression profiling of microRNAs in laryngeal squamous cell carcinoma[J].Head Neck,2012,10(5):190-195.

[10]陳磊，鄭樹艷，黃永望.MTA2對喉癌細胞系Hep-2的增殖、遷移和侵襲的影響[J].中國實驗診斷學(xué)，2015，19(6)：883-885.

[11]謝杰斌,龐月珊,王崇樹,等.自噬抑制劑3-MA對結(jié)直腸癌細胞Jagged-1蛋白表達及其增殖的影響[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2015,30(1):60-63.

[12]羅大虎,婁衛(wèi)華.MCPH1基因?qū)戆〩ep-2細胞遷徙及侵襲影響[J].醫(yī)藥論壇雜志,2016,37(10):27-29.

[13]許里,徐新宇,林振中.CRYAB在喉癌中的表達變化及臨床意義[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2016,36(9):1095-1100.

(學(xué)術(shù)編輯：劉海)

Effect of metastasis associated gene 2 on proliferation,migration and invasion of laryngeal carcinoma cell line Hep-2

MA Peng，F(xiàn)ENG Jun，DU Jing-wei

(DepartmentofOtorhinolaryngology-HeadandNeckSurgery，NanchongCentralHospital，SecondClinicalMedicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege，Nanchong637000,Sichuan,China)

Objective：To investigate the effect of metastasis associated gene 2 (MTA2) on the proliferation,migration and invasion of laryngeal carcinoma cell line Hep-2.Methods：MTA2 gene expression was down regulated by small interfering RNA (siRNA-MTA2) of MTA2 gene,and the transfection was detected by RT-PCR and Transwell.As the experimental group,the control group was transfected with negative control (sicontrol),and the effect of MTA2 on the proliferation,migration and invasion of Hep-2 was detected by MTT,cell scratch test and Transwell assay.Results:the expression level of MTA2mRNA and protein in the experimental group was significantly lower than that in the control group (P<0.05).The cell proliferation ability of the experimental group was significantly lower than that of the control group (P<0.05) when cultured in 7d and 9D,The cell migration ability and invasion ability of the experimental group were significantly lower than those of the control group (P<0.05).Conclusion: MTA2 is closely related to the proliferation,migration and invasion of Hep-2 cell line,which is expected to be a target for the treatment of laryngeal cancer.

MTA2;Laryngeal cancer cell;Hep-2;Proliferation;Migration

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.02.005

四川省教育廳項目(13ZB0241)；川北醫(yī)學(xué)院博士科研啟動項目(CBY-QD-08)

2016-10-10

馬鵬(1981-)，男，碩士，主治醫(yī)師。

馮俊，E-mail：flj20041201@163.com

時間：2017-5-5 16∶46

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170505.1646.010.html

1005-3697(2017)02-0172-03

R739.65

A