基于線粒體COⅠ基因的竹筍夜蛾親緣關系*

張 琴 莫有迪 張亞波 舒金平 王浩杰 吳 鴻

(1.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所 富陽 311400； 2.杭州市林業(yè)科學研究院 杭州 311300；3.廣東省肇慶市懷集縣林業(yè)局 肇慶 526400)

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基于線粒體COⅠ基因的竹筍夜蛾親緣關系*

張 琴1,2莫有迪3張亞波1舒金平1王浩杰1吳 鴻1

(1.中國林業(yè)科學研究院亞熱帶林業(yè)研究所 富陽 311400； 2.杭州市林業(yè)科學研究院 杭州 311300；3.廣東省肇慶市懷集縣林業(yè)局 肇慶 526400)

【目的】 基于mtDNA COⅠ基因探究竹筍夜蛾的親緣關系，以確定其分類地位，為系統(tǒng)進化軌跡提供分子理論基礎?！痉椒ā?以分布于浙江杭州周邊竹子產(chǎn)區(qū)的4種竹筍夜蛾為研究對象，使用通用引物分別克隆4種竹筍夜蛾線粒體細胞色素C 氧化酶亞基Ⅰ(mtDNA COⅠ) 基因5′端709 bp 片段序列，通過構建系統(tǒng)進化樹，分析4種竹筍夜蛾親緣關系?！窘Y果】 1) 4種竹筍夜蛾遺傳距離較小； 2)與比對昆蟲相比，4種竹筍夜蛾同屬一個進化群，分支支持率達到100%?！窘Y論】 4種竹筍夜蛾親緣關系接近，除薩夜蛾外，建議將其他3種竹筍夜蛾歸為一個屬。4種竹筍夜蛾形態(tài)差異較小，生態(tài)習性相似，分布區(qū)域基本一致，可作為理想的同域物種進化研究素材。本研究可為4種竹筍夜蛾分類地位的確定提供初步分子基礎，同時可為竹筍夜蛾DNA條形碼鑒定提供理論基礎。

竹筍夜蛾； COⅠ基因； 序列比較； 親緣關系

竹筍夜蛾屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，是竹子筍期的主要害蟲之一。竹筍夜蛾鉆蛀取食竹筍，活動場所隱蔽，且幼蟲期較長，竹筍被危害嚴重時，被害率高達95%以上。被害竹筍能生長成竹者，亦為斷頭、折梢、蟲孔累累、材質(zhì)硬脆，竹材利用率低(徐天森， 1962； 徐天森等， 2004)。被害竹林大量退筍，使竹林日趨退化，影響筍用林產(chǎn)業(yè)的發(fā)展(胡正堅等， 1992； 梁光紅等； 2003； Yoshimatsuetal., 2005； 舒金平等， 2012； 葉碧歡等， 2014)。在我國，研究報道的竹筍夜蛾主要有基夜蛾(Kumasiakumaso)、竹筍禾夜蛾(Oligiavulgaris)、筍秀夜蛾(Apameaapameoides)和薩夜蛾(Sapporiarepetita)(徐天森等， 2004； 舒金平等， 2012)。這4種竹筍夜蛾均鉆蛀取食竹筍，屬寡食性昆蟲，生活史極其相似，生態(tài)位嚴重重疊，在時間、空間和營養(yǎng)等資源利用上存在激烈競爭(羅梅浩等， 2002； 黃瓊瑤等， 2009)，且在同一地區(qū)均有分布(黃煥華等， 2003)。此外，4種竹筍夜蛾成蟲體色差異小，大小接近，實際生產(chǎn)生活中難以區(qū)分，人們常將其混淆，統(tǒng)稱為竹筍夜蛾，導致研究和生產(chǎn)防治中對象模糊，目標不清。

傳統(tǒng)昆蟲分類學對這4種竹筍夜蛾的分類一直存在爭議，拉丁學名一再變更，屬的歸屬難以確定(徐天森等， 2004)。例如： 基夜蛾，曾用名淡竹筍夜蛾，其拉丁學名曾為Apamea(秀夜蛾屬)kumaso(Sugi)(朱弘復， 1964； Inoueetal,1982； 陳一心， 1985； 1992)；筍秀夜蛾，曾用名筍秀禾夜蛾，其拉丁學名曾為Oligia(禾夜蛾屬)apameoidis(Draudt)(陳一心， 1985)；竹筍禾夜蛾，曾用名竹筍夜蛾，其拉丁學名曾為Polydesma(紛夜蛾屬)vulgaris(Butler)、Oligiavulgaris(Hampson)、Bambusiphilavulgaris(Sugi)(朱弘復， 1964； Inoueetal., 1982； 陳一心， 1985; 1992)；薩夜蛾，曾用名筍連秀夜蛾，其拉丁學名曾為Apamea(秀夜蛾屬)repetita(Butler)、Trachea(陌夜蛾屬)repetita(Hampson)、Apamea(秀夜蛾屬)repetita(Chen)、Sapporia(薩夜蛾屬)repetita(Sugi)(Inoueetal., 1982； 陳一心， 1985； 1992)。在研究中更顯混亂，竹筍夜蛾的學名難以統(tǒng)一。

隨著分子生物學的快速發(fā)展，基于DNA所攜帶的遺傳信息進行生物分類已逐漸成為研究熱點。其中，昆蟲線粒體基因組中細胞色素氧化酶亞基Ⅰ(mtDNA COⅠ)基因序列因既具有高度保守序列，又具有足夠變異位點的特性，被廣泛用于昆蟲分類、種群和進化關系研究(Luntetal., 1996)。2002年，德國進化生物學家Tautz等首先提出將DNA作為生物分類研究平臺的觀點，即以DNA 序列為基礎建立物種鑒定體系(Tautzetal., 2003)。2003年，加拿大學者Hebert 等提出建立DNA條形碼鑒定系統(tǒng)，即以線粒體細胞色素氧化酶亞基I(COⅠ) 基因5′端648 bp 的序列多樣性為基礎進行物種鑒定。Hebert 等(2003)還發(fā)現(xiàn)這段序列在鱗翅目200個近緣種中鑒定的成功率為100%。本研究針對4種竹筍夜蛾近緣種生物學和生態(tài)學特性相似、分類地位上存在爭議的問題，克隆4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因5′端709 bp片段系列，通過構建系統(tǒng)進化樹，分析其親緣關系，為其進一步明確其分類地位提供分子理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2013年4月—2014年4月，在浙江省安吉市竹博園和富陽竹子產(chǎn)區(qū)采集4種供試竹筍夜蛾幼蟲各200頭，室內(nèi)飼養(yǎng)至成蟲羽化，拍照，搜集活體成蟲浸泡于無水乙醇中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗材料

TAKALA MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit VER.5.0 試劑盒，TaKaRa MiniBest DNA Fragment Purification Kit Ver 3.0試劑盒，PMD-19-T載體，大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細胞，其中擴增4種竹筍夜蛾的線粒體COⅠ基因所用引物來自通用引物(Folmeretal., 1994):

L1490-5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATT G-3’;

H2198-5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAA AA T-3’。

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 4種竹筍夜蛾總基因組DNA的提取 分別選取4種竹筍夜蛾成蟲樣本，按照TAKALA MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit VER.5.0 試劑盒操作步驟提取4種竹筍夜蛾總基因組DNA。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進行檢測，使用紫外成像系統(tǒng)對電泳條帶進行觀察和拍照。

1.3.2 4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因的擴增 以提取到的竹筍夜蛾總基因組DNA為模板，引物為上述通用引物，按照如下反應體系和反應條件對4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因進行擴增。反應體系為：25 μL，其中上下游引物各1 μL，10×擴增緩沖液 2.5 μL，4種dNTP混合物2 μL，DNA模板5 μL，Taq DNA聚合酶0.3 μL，ddH2O 13.2 μL。反應條件為： 預變性94 ℃ 2 min，變性94 ℃1 min，退火50 ℃1 min，延伸72 ℃1 min，進行35個循環(huán)。取3 μL PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用紫外成像系統(tǒng)對電泳條帶進行觀察和拍照。

1.3.3 4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因PCR產(chǎn)物純化、克隆和測序 產(chǎn)物經(jīng)電泳后，按照TaKaRa MiniBest DNA Fragment Purification Kit Ver 3.0試劑盒操作步驟對4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因PCR產(chǎn)物進行純化，純化的PCR 產(chǎn)物與PMD-19-T載體進行連接反應，16 ℃過夜。將連接反應的產(chǎn)物轉化至大腸桿菌JM109 感受態(tài)細胞，待菌落長出來后，挑選單個陽性菌落進行菌落PCR驗證，鑒定重組質(zhì)粒。測序公司為生工生物工程(上海)測序部，要求雙向測通并進行拼接。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 利用MEGA 5.0軟件分析4種竹筍夜蛾的堿基組成、結構特點、堿基替換模式和遺傳距離等特性。登錄NCBI對4種竹筍夜蛾線粒體COⅠ基因進行同源性搜索，選取其他21條(15屬21種)線粒體COⅠ基因(表1)的氨基酸序列，分別采用鄰接法(NJ)、最大簡約法(ML)和最大似然法(MP)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。分析其系統(tǒng)進化關系，其中NJ法選用的模型是P-Distance。所有方法均運用Bootstrap檢驗重復，抽樣1 000次，其余參數(shù)為默認。

表1 21種蛾類昆蟲COⅠ 基因信息①Tab.1 Information of COⅠ genes of 21 noctuid insects

① *：無中文屬名No Chinese name.

2 結果與分析

2.1 4種竹筍夜蛾成蟲形態(tài)特征

由圖1可知，4種竹筍夜蛾成蟲形態(tài)基本接近，主要區(qū)別在于其體色和斑紋。4種竹筍夜蛾成蟲形態(tài)相關指標見表2。

2.2 4種竹筍夜蛾COⅠ基因目的片段序列的克隆與鑒定

對4種竹筍夜蛾COⅠ基因片段克隆產(chǎn)物進行電泳檢測，每個擴增產(chǎn)物均出現(xiàn)1條700 bp左右的特異性條帶(圖2)，與試驗目的相符。樣品經(jīng)測序公司測序拼接后，獲得4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因片段堿基序列，每個樣品重復測序3次，結果相同，長度均為709 bp(登錄號分別為基夜蛾KR780071、薩夜蛾KR780072、竹筍禾夜蛾KR780073、筍秀夜蛾KR780074)。將該片段序列在NCBI上進行同源性搜索，結果同比對的夜蛾科中Noctuaatlantic(AY600452.1)等昆蟲的線粒體COⅠ基因序列相似度極高(94%以上)。

表2 4種竹筍夜蛾成蟲形態(tài)特征Tab.2 Adult morphological characteristic of 4 bamboo shoot-boring noctuids

圖2 竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因克隆陽性菌落PCR電泳Fig 2 MtDNA COⅠgene’s positive colony PCR electrophoregram of bamboo shoot borers

2.3 4種竹筍夜蛾及其比對昆蟲mtDNA COⅠ基因片段的序列特征

4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因片段堿基序列同源性達98.2%。在4種竹筍夜蛾樣本mtDNA COⅠ基因709 bp序列片段中，多態(tài)性位點為30個，僅占整個序列的4.2%，與其他物種同源基因序列進行堿基比對發(fā)現(xiàn)，獲得的4條樣本基因片段均為編碼區(qū)序列，并且沒有堿基插入和缺失。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，4種竹筍夜蛾的mtDNA COⅠ基因片段均從第3個堿基開始翻譯，無移碼現(xiàn)象，編碼235個氨基酸，同源性高達99.89%，其中僅薩夜蛾第162個氨基酸與其他3種夜蛾不同，其余3種夜蛾氨基酸片段完全相同。

2.4 4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因片段的遺傳變異分析

使用MEG5.0軟件計算4種竹筍夜蛾及其比對昆蟲mtDNA COⅠ基因序列的遺傳距離，計算模型為p-Distance。結果表明，筍秀夜蛾與基夜蛾間的遺傳距離為0.014，與竹筍禾夜蛾間的遺傳距離為0.006，與薩夜蛾間的遺傳距離為0.069； 基夜蛾與竹筍禾夜蛾間的遺傳距離為0.008，與薩夜蛾間的遺傳距離為0.067； 竹筍禾夜蛾與薩夜蛾間的遺傳距離為0.063(表3)。4種竹筍夜蛾中，除了薩夜蛾與其他3種夜蛾的種間遺傳距離較大，大于所有比對昆蟲的平均種間距離外，其他3種種間遺傳距離均較小，與比對昆蟲的種內(nèi)距離相近。

4種竹筍夜蛾及其比對昆蟲的堿基替換模式為： Ts >Tv，R值為12.6(表4)。TC間發(fā)生堿基轉換次數(shù)最多，達16次，占替換總數(shù)(19)的84.2%； TA發(fā)生堿基顛換次數(shù)最多，達13次，占顛換總數(shù)(16)的81.25%， CA和TG間的顛換次數(shù)較少，分別為2次和1次，CG間沒有替換發(fā)生。

表3 4種竹筍夜蛾種間遺傳距離Tab 3 Interspecific genetic distance between the our kinds of bamboo shoot borers

表4 4種竹筍夜蛾及其比對昆蟲mtDNA COⅠ基因的堿基替換頻次①Tab 4 Base substitution frequencies in mitochondrial DNA COⅠ gene from bamboo Shoot borers and other lepidopterous insects

① Ts堿基轉換數(shù)Transition;Tv:堿基顛換數(shù)Transversion.R=Ts/Tv.

圖3 基于mtDNA COⅠ基因構建的4種竹筍夜蛾系統(tǒng)進化樹(NJ法)Fig.3 Molecular phylogenetic tree of mtDNA COⅠ for bamboo shoot borers sequence with methods of Neighbor-Joining

在4種竹筍夜蛾樣本mtDNA COⅠ基因709 bp序列片段中，檢測到保守性位點(conserved sites)555個，多態(tài)性位點(variable sites)154個，占總檢測位點的21.72%； 簡約信息位點(parsimony-informative sites)118個，占16.64%； 單突變位點(singleton site)36個，占5.07%。

2.5 4種竹筍夜蛾基于mtDNA COⅠ基因片段的系統(tǒng)進化分析

用4種竹筍夜蛾及其比對昆蟲的mtDNA COⅠ氨基酸序列在Mega5.0中構建進化樹,結果如圖3、4、5所示，3種進化樹顯示結果大致相同。與比對序列相比，4種竹筍夜蛾分屬同一支，分支支持率達100%，親緣關系最近，其中薩夜蛾與其他3種夜蛾分屬2個分支，分支支持率為70%左右。MP法進化樹中，基夜蛾又與竹筍禾夜蛾和筍秀夜蛾分為2支，分支支持率為30%。3種進化樹均顯示，4種竹筍夜蛾與禾夜蛾屬、秀夜蛾屬的昆蟲遺傳距離較遠。

圖4 基于mtDNA COⅠ基因構建的4種竹筍夜蛾系統(tǒng)進化樹(ML法)Fig.4 Molecular phylogenetic tree of mtDNA COⅠ for bamboo shoot borers sequence with methods of Maximum Likelihood

3 討論

Foster等(1997)認為，線粒體基因密碼子位點在物種進化過程中由于受選擇壓力影響，會表現(xiàn)出不同程度的堿基突變。在不同的密碼子位點上，4種竹筍夜蛾及其比對昆蟲mtDNA COⅠ基因片段堿基含量變化規(guī)律一致。但密碼子第2位點的A+T含量顯著高于第1、3 位點，說明4種竹筍夜蛾密碼子第2位點上的堿基突變由純化選擇導致(陳星等， 2012)。此外，密碼子第2位點的堿基突變大多屬于同義突變，容易在進化過程中通過自然選擇固定下來(周繼亮等， 2001)。本研究結果與櫟黃掌舟蛾(Phaleraassimilis)mtDNA COⅠ基因密碼子位點變異特點不同，其密碼子第3位點的A+T含量顯著高于第1、2 位點(楊瑞生等， 2013)，可能是由于夜蛾種類不同導致。在堿基替換模式上，本研究中4種竹筍夜蛾的mtDNA COⅠ基因均為堿基轉換高于顛換，其R值為12.6，與鱗翅目蛾類昆蟲的堿基替換模式一致(楊瑞生等， 2008； 2011； 2013)。生物進化可以說是生物體在基因水平上堿基突變不斷累積的結果，一旦同種生物不同個體間的堿基突變累積到一定程度(量變)，就會產(chǎn)生種的分化(質(zhì)變)。Hebert(2003)等對動物界11門13 320種的COⅠ 基因序列進行比較研究發(fā)現(xiàn)，超過98%的物種間的遺傳距離大于0.002，而種內(nèi)遺傳距離多小于0.001，很少超過0.002，而同屬種之間的mtDNA COⅠ基因平均距離為0.011 3，除刺細胞動物門的物種外，COⅠ基因的序列多樣性足以區(qū)分所有動物中的近緣種。本研究結果表明，4種竹筍夜蛾及其比對昆蟲種間遺傳距離為0.002～0.093，符合Hebert等(2003)的研究結果。

圖5 基于mtDNA COⅠ基因構建的4種竹筍夜蛾系統(tǒng)進化樹(MP法)Fig.5 Molecular phylogenetic tree of mtDNA COⅠ for bamboo shoot borers sequence with methods of maximum parsimony(MP)

基于COⅠ基因建立的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，4種夜蛾親緣關系非常接近，而與秀夜蛾屬和禾夜蛾屬其他昆蟲親緣關系較遠，因未能檢索到基夜蛾屬和薩夜蛾屬其他昆蟲COⅠ基因，故無法比較其親緣關系。分類學上對4種竹筍夜蛾的歸屬研究一直存在爭議，本研究或可提供部分參考。本研究中筍秀夜蛾與基夜蛾、竹筍禾夜蛾、薩夜蛾的遺傳距離分別為0.014、0.006、0.069，所建進化樹也表明筍秀夜蛾與竹筍禾夜蛾親緣關系較近，其次為基夜蛾，與薩夜蛾親緣關系較遠。綜上所述，本研究建議可將基夜蛾、竹筍禾夜蛾和筍秀夜蛾歸為同一個屬，薩夜蛾由于其在浙江分布較少，主要分布于廣東茶稈竹上，與這3種竹筍夜蛾親緣關系相對較遠，其分類地位可進一步進行確認。此外，4種竹筍夜蛾成蟲形態(tài)差異較小，生態(tài)習性相似，分布區(qū)域基本一致，分子進化樹初步確定其親緣關系接近，可作為理想的同域物種進化研究素材。

昆蟲線粒體DNA 相對于核基因來說，具有進化速率快、物種間序列保守等特點，因而成為篩選條形碼標準基因的首選(Hebertetal., 2003)。研究發(fā)現(xiàn)， 昆蟲線粒體DNA含有13個蛋白質(zhì)編碼基因(Boore， 1999； Taanman， 1999)，其中因為mtDNA COⅠ基因的序列保守性強，在種間鑒定上具有較高的可靠性，且易于擴增，被絕大多數(shù)研究者選為昆蟲的DNA 條形碼基因。利用DNA條形碼鑒定的研究中，63.7%的研究樣本來自昆蟲，其中又以鱗翅目的研究居多(李青青等， 2010)，其次為雙翅目(Nelsonetal., 2007)、鞘翅目(Monaghanetal., 2005)等。本研究克隆了4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因片段，可為竹筍夜蛾DNA條形碼鑒定提供理論基礎。線粒體基因上保守基因眾多，多基因片段聯(lián)合的DNA 條形碼鑒定系統(tǒng)已經(jīng)成為一個探索的趨勢(肖金花等， 2004)，進一步驗證DNA條形碼技術在物種鑒定和物種親緣關系研究中的適用性。此外，由于4種竹筍夜蛾親緣關系較近，今后可通過采集不同地理種群，克隆其mtDNA COⅠ基因及其他保守序列(COⅡ、16sRNA等)，研究其進化過程，進一步揭示4種竹筍夜蛾的進化關系。

4 結論

本研究利用4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因片段構建了進化樹，結果表明4種竹筍夜蛾親緣關系接近，可為4種竹筍夜蛾分類地位的確定提供初步分子基礎，同時可為竹筍夜蛾DNA條形碼鑒定提供理論基礎。鑒于本研究克隆的只是4種竹筍夜蛾mtDNA COⅠ基因的5′端部分序列，今后可通過設計特異性引物，對竹筍夜蛾mtDNA COⅠ序列全長進行擴增，以提高mtDNA COⅠ 基因DNA條形碼的可靠性。4種竹筍夜蛾形態(tài)差異較小，生態(tài)習性相似，分布區(qū)域基本一致，可作為理想的同域物種進化研究素材。

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(責任編輯 朱乾坤)

Genetic Relationship of Shoot-Boring Noctuids Based on Mitochondrial Cytochrome Oxidase Ⅰ Gene

Zhang Qin1,2Mo Youdi3Zhang Yabo1Shu Jinping1Wang Haojie1Wu Hong1

(1.ResearchInstituteofSubtropicalForestry,CAFFuyang311400; 2.HangzhouAcademyofForestryHangzhou311300; 3.HuaijiForestryBureauofZhaoqing,GuangdongProvinceZhaoging526000)

【Objective】 The bamboo shoot-boring noctuid is a joint name for several species of moths which are hamful to bamboo shoot stage in southern China. There are four dominant species that have sympatric distribution and the same host. Their biological and ecological characteristics are similar. However,the classification status and evolutionary approach are still controversial. To determine their classification status and provide a molecular theory foundation for the system evolution, their genetic relationship was studied in the paper. 【Method】The bamboo shoot borers, distributing in the bamboo production areas surrounding in Hangzhou, Zhejiang Province, were used as the research object, and four 709 bp segments of cytochrome C oxidase subunit Ⅰ(COⅠ) gene were cloned, using universal primers, from mitochondrial DNA of different bamboo shoot borers′ individuals and compared with homologous sequences from other lepidopterous insects to analyze their base composition characteristics and the genetic relationship for accurate identification of bamboo shoot borers at molecular level by building system evolutionary trees．【Result】1)The results indicated that the genetic distance between the four kinds of bamboo shoot borers was small.2)Three phylogenetic trees showed that they got 100% support on the branch.【Conclusion】 The four bamboo shoot borers have closed genetic relationship,among which three species can be classified into one genus exceptSapporiarepetita.Furthermore, the four kinds of bamboo shoot borers could be used as ideal samples for sympatric speciation research for its similarity in body and habits and distribution.This study provides preliminary molecular basis for the genetic relationship and DNA barcoding technology of the 4 kinds of bamboo shoot moths at the same time.

shoot-boring noctuids; mitochondrial cytochrome oxidaseⅠgene; sequence comparison; genetic relationship

10.11707/j.1001-7488.20170411

2015-05-14；

2016-12-07。

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201304403)。

S718.7

A

1001-7488(2017)04-0096-09

* 舒金平為通訊作者。