外周細(xì)胞淋巴瘤中TET2和DNMT3A的表達(dá)及意義

孫孟琦，王麗麗，冉雯雯，李 宏，邢曉明

外周細(xì)胞淋巴瘤中TET2和DNMT3A的表達(dá)及意義

孫孟琦1，王麗麗2，冉雯雯2，李 宏2，邢曉明2

目的 探討TET2和DNMT3A在外周T細(xì)胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma, PTCL)中的表達(dá)及其與PTCL免疫表型的關(guān)系。方法 應(yīng)用CD3、CD4、CD10、BCL-6、CXCL-13、CD30、ALK免疫標(biāo)記將PTCL分為血管免疫母細(xì)胞性T細(xì)胞淋巴瘤(angioimmu-noblastic Tcelll ymphoma, AITL)、外周T細(xì)胞淋巴瘤，非特指(peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified, PTCL-NOS)、ALK陽(yáng)性的間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALK+ anaplastic large cell lymphoma, ALK+ALCL)和ALK陰性的間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALK- anaplastic large cell lymphoma, ALK-ALCL)4種類型。應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)PTCL組織中TET2和DNMT3A的表達(dá)。結(jié)果 89例PTCL中，AITL 36例，PTCL-NOS 26例，ALK-ALCL 18例，ALK+ALCL 9例。在AITL組織中，TET2胞質(zhì)表達(dá)和DNMT3A胞質(zhì)及胞核表達(dá)的高表達(dá)率均高于PTCL-NOS和ALCL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。TET2胞質(zhì)表達(dá)和DNMT3A胞質(zhì)及胞核表達(dá)在AITL中均呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 TET2和DNMT3A可以作為診斷AITL的分子標(biāo)志物，為AITL的明確診斷提供新策略。

淋巴瘤；外周T細(xì)胞淋巴瘤；TET2；DNMT3A；免疫組織化學(xué)

外周T細(xì)胞淋巴瘤(peripheral T-cell lymphoma, PTCL)是一組具有高度異質(zhì)性的淋巴組織惡性增殖性病變，起源于胸腺后成熟T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞，占非霍奇金淋巴瘤的10%～15%，其侵襲性強(qiáng)，預(yù)后差，5年生存率約30%，目前尚無(wú)有效的治療方案。由于對(duì)PTCL的分子機(jī)制知之甚少以及缺乏有效的分子標(biāo)志物，導(dǎo)致PTCL分類復(fù)雜。根據(jù)(2008)WHO淋巴造血組織疾病分類，最常見的PTCL亞型包括外周T細(xì)胞淋巴瘤，非特指(peripheral T-cell lymphoma, not otherwise specified, PTCL-NOS)、血管免疫母細(xì)胞T細(xì)胞淋巴瘤(angioimmunoblastic T cell lymphoma, AITL)、ALK陰性的間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALK- anaplastic large cell lymphoma, ALK-ALCL)和ALK陽(yáng)性的間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALK+ anaplastic large cell lymphoma, ALK+ALCL)。

隨著基因測(cè)序水平的不斷提高，有關(guān)表觀遺傳調(diào)控的基因，如TET2和DNMT3A等突變?cè)谘合到y(tǒng)惡性腫瘤中相繼被發(fā)現(xiàn)[1-2]。隨后，TET2和DNMT3A突變被發(fā)現(xiàn)存在于淋巴瘤中，且在T細(xì)胞淋巴瘤中兩者突變有一定的相關(guān)性[3-4]。但對(duì)TET2及DNMT3A在PTCL中蛋白表達(dá)的研究較少，本文將從蛋白水平探討TET2與DNMT3A蛋白表達(dá)水平改變及其與PTCL各亞型之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院2008年11月～2016年4月診治的淋巴瘤患者，篩選病理診斷為PTCL病例，剔除重復(fù)送檢、穿刺組織及未明確病理分型病例，共89例。

1.2 免疫組化 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，3 μm厚切片。免疫組化染色采用PV6000法。所用抗體TET2(ab94580)、DNMT3A(ab23565)購(gòu)于Abcam公司，TET2抗體濃度1 ∶300，DNMT3A抗體濃度1 ∶800，CD3、CD4、CD10、BCL-6、CXCL-13、CD30、ALK工作液抗體均購(gòu)于北京中杉金橋公司，血管壁(TET2)和大鼠肺(DNMT3A)為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。應(yīng)用EDTA 9.0修復(fù)液，高壓修復(fù)2 min。

將TET2、DNMT3A表達(dá)情況采用半定量評(píng)估：隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。(1)按陽(yáng)性細(xì)胞率計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分；(2)按著色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)陽(yáng)性著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：0～3分為低表達(dá)，4分及以上為高表達(dá)[5]。由于TET2胞核表達(dá)及DNMT3A胞質(zhì)高表達(dá)例數(shù)較少，所以將評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)改為0～2分為低表達(dá)，3分及以上為高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組間數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，兩因素間的相關(guān)性采用非參數(shù)Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTCL亞型 89例PTCL中36例AITL、26例PTCL-NOS、9例ALK+ALCL、18例ALK-ALCL。

2.2 TET2和DNMT3A在PTCL中的表達(dá) TET2、DNMT3A均表達(dá)于胞質(zhì)或胞核，其中TET2胞質(zhì)高表達(dá)50例，胞核高表達(dá)19例(圖1)；DNMT3A胞質(zhì)高表達(dá)19例，胞核高表達(dá)48例(圖2)。

2.3 TET2、DNMT3A表達(dá)與PTCL臨床病理特征的關(guān)系 TET2在臨床Ⅲ+Ⅳ期PTCL的胞質(zhì)高表達(dá)率(67.4%)高于Ⅰ+Ⅱ期(40%)，差異雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但處于臨界水平(P=0.061)。在有B癥狀的PTCL患者中，TET2胞核高表達(dá)率(45%)高于無(wú)B癥狀者(8.11%，P=0.003)。TET2表達(dá)部位與PTCL患者性別、年齡、LDH水平、IPI評(píng)分、結(jié)外浸潤(rùn)無(wú)關(guān)(P>0.05)，DNMT3A表達(dá)部位與PTCL患者性別、年齡、LDH水平、臨床分期、IPI評(píng)分、B癥狀、結(jié)外浸潤(rùn)均無(wú)關(guān)(P>0.05，表1)。

2.4 TET2和DNMT3A在PTCL各亞型中的表達(dá) 在胞質(zhì)表達(dá)中，TET2在AITL中高表達(dá)率(83.3%)均高于PTCL-NOS(42.3%)和ALCL(33.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)，PTCL-NOS與ALCL的高表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；DNMT3A高表達(dá)率在AITL、PTCL-NOS、ALCL中分別為16.7%、11.5%、14.8%，同樣AITL與PTCL-NOS、ALCL高表達(dá)率之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在胞核表達(dá)中，TET2的高表達(dá)率在各亞型中之間無(wú)差異(P>0.05)，DNMT3A高表達(dá)率在各亞型之間均有差異，表達(dá)率高低依次為AITL、PTCL-NOS、ALCL(77.8%、53.8%、22.2%，P均<0.05，表3)。ALK+ALCL和ALK-ALCL之間TET2、DNMT3A表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表4)。

2.5 TET2表達(dá)與DNMT3A表達(dá)的相關(guān)性分析 在89例PTCL中，TET2胞質(zhì)表達(dá)與DNMT3A表達(dá)(胞質(zhì)與胞核)呈正相關(guān)。在AITL中，TET2胞質(zhì)表達(dá)與DNTM3A表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，在PTCL-NOS及ALCL中兩者表達(dá)無(wú)相關(guān)性(表5)。TET2胞核表達(dá)與DNMT3A(胞質(zhì)與胞核)表達(dá)均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

表1 TET2、DNMT3A表達(dá)與外周T細(xì)胞淋巴瘤臨床病理特征的關(guān)系

①A①B①C②A②B②C

圖1 外周T細(xì)胞淋巴瘤中TET2的表達(dá)：A.胞質(zhì)陽(yáng)性；B.胞核陽(yáng)性；C.陰性，PV6000法 圖2 外周T細(xì)胞淋巴瘤中DNMT3A的表達(dá)：A.胞質(zhì)陽(yáng)性；B.胞核陽(yáng)性；C.陰性，PV6000法

表2 TET2、DNMT3A胞質(zhì)表達(dá)在外周T細(xì)胞淋巴瘤各亞型中表達(dá)的比較

表3 TET2、DNMT3A胞核表達(dá)在外周T細(xì)胞淋巴瘤各亞型中表達(dá)的比較

表4 TET2、DNMT3A在ALK陽(yáng)性與ALK陰性間變性大細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)的比較

3 討論

表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是指在DNA的核苷酸序列不變前提下引起基因表達(dá)或細(xì)胞表型變化的遺傳機(jī)制，主要包括DNA的胞嘧啶(C)甲基化，組蛋白修飾和染色體重塑等。DNA的胞嘧啶甲基化在基因組印跡、基因表達(dá)調(diào)節(jié)、X染色體失活、癌癥發(fā)生等方面發(fā)揮重要作用。TET2、DNMT3A等基因主要參與DNA甲基化的調(diào)節(jié)。

近年來(lái)，TET2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用成為研究熱點(diǎn)。TET2基因?qū)儆赥ET基因家族，定位于染色體4q24。TET2蛋白具有α-KG和Fe2+依賴的雙加氧酶活性，可將5-甲基胞嘧啶(5-mC)轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC)，5-hmC被認(rèn)為是DNA主動(dòng)去甲基化的重要中間產(chǎn)物，TET2通過(guò)將5mC轉(zhuǎn)化為5-hmC來(lái)參與DNA去甲基化，進(jìn)而下調(diào)DNA甲基化水平，因此TET2是DNA去甲基化過(guò)程中的關(guān)鍵酶[6-7]。

TET2為抑癌基因，失活突變TET2突變導(dǎo)致許多血液系統(tǒng)疾病患者體內(nèi)的TET2蛋白功能降低或丟失[1]。Ko等[8]發(fā)現(xiàn)，TET2突變主要通過(guò)影響TET2蛋白活性而引起髓系惡性腫瘤。有研究發(fā)現(xiàn)淋巴瘤也存在TET2突變，且TET2在AITL中的突變率最常見，其次為PTCL-NOS[9-11]，但TET2蛋白在淋巴瘤中的表達(dá)情況卻少有研究。本組實(shí)驗(yàn)中，AITL中TET2蛋白胞質(zhì)表達(dá)明顯高于PTCL-NOS與ALCL，說(shuō)明在PTCL中TET2基因突變后可能并未影響TET2蛋白的表達(dá)而是影響了蛋白的活性?；蛘叽嬖谄渌蛲蛔?，如IDH1/2[12]，導(dǎo)致TET2功能缺失或異常。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在各亞型之間TET2蛋白胞核表達(dá)的高表達(dá)率均無(wú)差異，所以關(guān)于TET2基因突變是否改變TET2蛋白表達(dá)部位以及TET2蛋白不同表達(dá)部位與PTCL的關(guān)系尚待進(jìn)一步研究明確。胞質(zhì)表達(dá)的TET2蛋白在AITL中陽(yáng)性率均高于PTCL-NOS和ALCL，提示TET2蛋白有作為AITL診斷標(biāo)志物的可能性。Delhommeau等[1]還發(fā)現(xiàn)TET2基因突變存在于CD34+的造血干細(xì)胞或造血祖細(xì)胞，說(shuō)明在疾病發(fā)生早期即存在TET2突變。Quivoron等[3]研究發(fā)現(xiàn)在淋巴瘤發(fā)生的早期和晚期階段均存在TET2突變，說(shuō)明TET2突變可能與淋巴瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。Muto等[13]研究發(fā)現(xiàn)TET2基因的敲除導(dǎo)致小鼠有Tfh特征的T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生，說(shuō)明TET2突變對(duì)人類有Tfh特征的T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生可能有重要作用，進(jìn)一步說(shuō)明TET2可有助于AITL的明確診斷。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)，TET2在乳腺癌等某些上皮來(lái)源性腫瘤中的表達(dá)都較正常組織降低，進(jìn)而認(rèn)為TET2基因在上述腫瘤中表達(dá)降低，但Yang等并未直接檢測(cè)TET2蛋白的表達(dá)，所以對(duì)于TET2基因突變對(duì)TET2蛋白的影響還有待進(jìn)一步研究。

DNMT3A屬于DNMT家族，位于染色體2p23。DNMT3A編碼一個(gè)甲基化轉(zhuǎn)移酶，將CpG島的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為甲基化胞嘧啶，進(jìn)而參與DNA從頭甲基化過(guò)程。目前對(duì)DNMT3A突變后對(duì)其基因表達(dá)、蛋白表達(dá)及功能及DNA甲基化水平的改變沒有一致結(jié)果。Ley等[2]研究表明在發(fā)生DNMT3A突變和未突變的細(xì)胞中DNMT3A基因、蛋白表達(dá)水平和5-mC水平?jīng)]有明顯不同，而且DNMT3A突變并不直接影響其酶活性。但也有學(xué)者為DNMT3A突變使DNMT3A酶活性降低[15]。有研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A在AITL中最常見，突變率為33%～38.%[9, 11]。在本組實(shí)驗(yàn)中，AITL中DNMT3A胞質(zhì)及胞核表達(dá)均較高，說(shuō)明DNMT3A突變后可能不會(huì)影響其蛋白的表達(dá)，可能會(huì)影響DNMT3A蛋白的功能，或者存在其他基因突變抑制DNMT3A蛋白的作用。本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論胞質(zhì)還是胞核，AITL患者DNMT3A高表達(dá)率均明顯高于PTCL-NOS和ALCL，說(shuō)明DNMT3A也具有作為AITL的診斷標(biāo)志物的可能性。

Couronne等[4]研究發(fā)現(xiàn)，DNMT3A在PTCL中存在突變，突變率為11%，且DNMT3A突變的患者中有73%同時(shí)伴有TET2突變，他們認(rèn)為TET2和DNMT3A突變可能使胞嘧啶的甲基化和去甲基化過(guò)程失調(diào)。Odejide等[9]發(fā)現(xiàn)，DNMT3A在AITL中的突變率為33%，且同時(shí)都有TET2突變，這說(shuō)明TET2與DNMT3A在參與DNA甲基化調(diào)控過(guò)程中可能具有協(xié)同作用，且DNMT3A催化的啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化與TET2催化的主動(dòng)去甲基化可能為一動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)表達(dá)的TET2與DNMT3A在PTCL中表達(dá)呈正相關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在AITL中TET2胞質(zhì)表達(dá)與胞質(zhì)及胞核表達(dá)的DNMT3A均呈正相關(guān)，說(shuō)明TET2與DNMT3A在參與DNA甲基化調(diào)控過(guò)程中可能具有協(xié)同作用，也提示TET2與DNMT3A蛋白可聯(lián)合作為診斷AITL分子標(biāo)志物的可能性。但胞核表達(dá)的TET2與DNMT3A表達(dá)無(wú)相關(guān)關(guān)系，所以關(guān)于TET2蛋白表達(dá)部位不同與PTCL發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系以及與PTCL甲基化調(diào)節(jié)的關(guān)系尚待進(jìn)一步研究明確。

總之，本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TET2胞質(zhì)表達(dá)和DNMT3A表達(dá)在AITL中的高表達(dá)率均高于PTCL-NOS和ALCL，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，為AITL的明確診斷提供新策略。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)TET2在臨床Ⅲ+Ⅳ期PTCL的胞質(zhì)高表達(dá)率高于Ⅰ+Ⅱ期，有B癥狀的PTCL患者TET2胞核高表達(dá)率高于無(wú)B癥狀者，為PTCL患者的治療提供了新線索。在本組實(shí)驗(yàn)中，TET2胞核表達(dá)在PTCL各亞型中差異不明顯，關(guān)于TET2在PTCL中表達(dá)部位的差異仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)說(shuō)明。TET2與DNMT3A突變后導(dǎo)致甲基化紊亂的機(jī)制，TET2、DNMT3A基因表達(dá)及其蛋白作用的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

[1] Delhommeau F, Dupont S, Della V V,etal. Mutation in TET2 in myeloid cancers [J]. N Engl J Med, 2009,360(22):2289-2301.

[2] Ley T J, Ding L, Walter M J,etal. DNMT3A mutations in acute myeloid leukemia [J]. N Engl J Med, 2010,363(25):2424-2433.

[3] Quivoron C, Couronne L, Della V V,etal. TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis[J]. Cancer Cell, 2011,20(1):25-38.

[4] Couronne L, Bastard C, Bernard O A. TET2 and DNMT3A mutations in human T-cell lymphoma[J]. N Engl J Med, 2012,366(1):95-96.

[5] Song L, Li Y J, Xing X M,etal. Expression and significance of leptin receptor, p-STAT3 and p-AKT in diffuse large B-cell lymphoma[J]. Acta Histochem, 2014,116(1):126-130.

[6] Tahiliani M, Koh K P, Shen Y,etal. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1[J]. Science, 2009,324(5929):930-935.

[7] Nakajima H, Kunimoto H. TET2 as an epigenetic master regulator for normal and malignant hematopoiesis[J]. Cancer Sci, 2014,105(9):1093-1099.

[8] Ko M, Huang Y, Jankowska A M,etal. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2[J]. Nature, 2010,468(7325):839-843.

[9] Odejide O, Weigert O, Lane A A,etal. A targeted mutational landscape of angioimmunoblastic T-cell lymphoma[J]. Blood, 2014,123(9):1293-1296.

[10] Lemonnier F, Couronne L, Parrens M,etal. Recurrent TET2 mutations in peripheral T-cell lymphomas correlate with TFH-like features and adverse clinical parameters[J]. Blood, 2012,120(7):1466-1469.

[11] Wang C, McKeithan T W, Gong Q,etal. IDH2R172 mutations define a unique subgroup of patients with angioimmunoblastic T-cell lymphoma[J]. Blood, 2015,126(15):1741-1752.

[12] Figueroa M E, Wahab O A, Lu C,etal. Leukemic IDH1 and IDH2 mutations result in a hypermethylation phenotype, disrupt TET2 function, and impair hematopoietic differentiation [J]. Cancer Cell, 2010,18(6):553-567.

[13] Muto H, Sakata-Yanagimoto M, Nagae G,etal. Reduced TET2 function leads to T-cell lymphoma with follicular helper T-cell-like features in mice[J]. Blood Cancer J, 2014,4:264.

[14] Yang H, Liu Y, Bai F,etal. Tumor development is associated with decrease of TET gene expression and 5-methylcytosine hydroxylation[J]. Oncogene, 2013,32(5):663-669.

[15] Chan S M, Majeti R. Role of DNMT3A, TET2, and IDH1/2 mutations in pre-leukemic stem cells in acute myeloid leukemia[J]. Int J Hematol, 2013,98(6):648-657.

Expression of TET2 and DNMT3A in peripheral T cell lymphoma and their significance

SUN Meng-qi1, WANG Li-li2, RAN Wen-wen2, LI Hong2, XING Xiao-ming2
(1DepartmentofPathology,BasicMedicalCollegeofQingdaoUniversity,Qingdao266071,China;2DepartmentofPathology,theAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266003,China)

Purpose To investigate the expression of TET2 and DNMT3A in patients with peripheral T cell lymphoma (PTCL) and the relationship to immunophenotypes of PTCL. Methods Using a panel of immunohistochemical markers (CD3, CD4, CD10, BCL-6, CXCL-13, CD30, ALK), all cases of PTCLs were further divided into four groups, including angioimmunoblastic T cell lymphoma (AITL), peripheral T cell lymphoma, not otherwise specified (PTCL-NOS), anaplastic lymphoma kinase negative anaplastic large cell lymphoma (ALK-ALCL) and anaplastic lymphoma kinase positive anaplastic large cell lymphoma (ALK+ALCL). The expression of TET2 and DNMT3A in 89 cases of PTCL was detected by immunohistochemical analysis. Results 89 cases were divide into four subtypes, AITL (36/89), PTCL-NOS (26/89), ALK-ALCL (18/89), and ALK+ALCL (9/89). Immunohistochemistry staining revealed higher cytoplasmic expression of TET2 and DNMT3A in AITL than that of in PTCL-NOS and ALCL (P<0.05). And the nuclear expression of DNMT3A in patients with AITL was higher than that of PTCL-NOS and ALCL (P<0.05). The cytoplasmic expression of TET2 was positively related with both cytoplasmic and nuclear expression of DNMT3A in patients with AITL (P<0.05). Conclusion TET2 combined with DNMT3A could be used as markers in AITL diagnosis, which could provide new strategy for AITL diagnosis.

lymphoma; peripheral T cell lymphoma; TET2; DNMT3A; immunohistochemistry

1青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，青島 2660712青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，青島 266003

孫孟琦，女，碩士研究生。E-mail: sunmq1103@163.com 邢曉明，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。Tel: (0532)82911533，E-mail: edithxing@hotmail.com

時(shí)間：2017-4-17 18:19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170417.1819.008.html

R 733.4

A

1001-7399(2017)04-0388-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.04.008

接受日期：2017-02-16