2011～2015年深圳市龍崗區(qū)致瀉性大腸埃希菌的感染狀況及耐藥性分析①

白江濤,楊 慧,陳應(yīng)堅,劉 渠,金玉娟,甘莉萍,葉珍珍

(1. 深圳市龍華新區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 570100; 2. 深圳市龍崗區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 518172)

2011～2015年深圳市龍崗區(qū)致瀉性大腸埃希菌的感染狀況及耐藥性分析①

白江濤1,楊 慧2,陳應(yīng)堅2,劉 渠2,金玉娟2,甘莉萍2,葉珍珍2

(1. 深圳市龍華新區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 570100; 2. 深圳市龍崗區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 518172)

目的：了解深圳市龍崗區(qū)腹瀉人群中致瀉性大腸埃希菌的感染狀況及耐藥性，為該菌引起腹瀉的防控與臨床治療提供依據(jù)。方法:收集深圳市龍崗區(qū)2011～2015年腹瀉人群糞便標(biāo)本，進行致瀉性大腸埃希菌的分離培養(yǎng)、生化鑒定后，利用PCR進行鑒定與分型，然后用K-B瓊脂擴散法進行抗生素敏感性測試。結(jié)果:致瀉性大腸埃希菌的檢出率為9.4%(95/1008)；年齡分布上存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，14～25歲(11.5%)、25～35歲(11.6%)相對較高。檢出類型以ETEC為主，占60.0%(56/95)，其次為EPEC(22.1%，21/95)和EAEC(15.8%，15/95)。出現(xiàn)較高耐藥率的是萘啶酸(69.5%)，其次是氨芐西林(40.0%)和四環(huán)素(34.7%)；致瀉性大腸埃希菌多重耐藥率(MDR)為38.9%，ETEC、EPEC、EAEC多重耐藥率分別為25.0%、66.7%、43.8%。結(jié)論：深圳市龍崗區(qū)五種致瀉性大腸埃希菌中ETEC感染率最高，致瀉性大腸埃希菌多重耐藥較嚴(yán)重；提示規(guī)范合理使用抗生素。

致瀉性大腸埃希菌；腹瀉；耐藥

致瀉性大腸埃希菌(DiarrheagenicEscherichiacoli，DEC)是引起人類急性感染性腹瀉的常見病原菌之一，研究數(shù)據(jù)顯示，致瀉性大腸埃希菌是細菌感染性腹瀉的主要病因[1,2]。它是指能夠引起胃腸炎、腹瀉等腸道內(nèi)感染癥狀。根據(jù)攜帶致病基因的不同可分為6類：致病性大腸埃希菌(EnteropathogenicE.coli，EPEC)、產(chǎn)毒性大腸埃希菌(EnterotoxigenicE.coli，ETEC)、侵襲性大腸埃希菌(EnteroinvasiveE.coli，EIEC)、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌(Shigatoxin-producingE.coli，STEC)、黏附性大腸埃希菌(EnteroadherentE.coli，EAEC)及彌散黏附性大腸埃希菌(DiffuselyadherentE.coli，DAEC)[3]。全球范圍內(nèi)，DEC對氨芐西林、環(huán)丙沙星、復(fù)方磺胺甲噁唑、四環(huán)素、氯霉素、慶大霉素的耐藥率高達50%[4]。在我國，DEC對阿莫西林、復(fù)方新諾明、三代頭孢類抗生素、喹諾酮類及四環(huán)素耐藥率超過40%，對氨芐西林及哌拉西林等青霉素類耐藥率甚至高達80%～100%[5～7]。DEC的耐藥問題已成為全球越來越關(guān)注的公共衛(wèi)生問題，為了了解深圳龍崗區(qū)腹瀉人群中DEC的抗生素敏感情況，本研究對2011～2015年來自深圳市龍崗區(qū)2家感染性腹瀉哨點醫(yī)院的腹瀉人群糞便標(biāo)本進行了DEC的檢測，并對分DEC陽性菌株進行了耐藥性分析。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2011～2015年來自深圳市龍崗區(qū)2家感染性腹瀉哨點醫(yī)院腹瀉病人的糞便標(biāo)本1008人份，病例相關(guān)資料來自深圳市感染性腹瀉監(jiān)測網(wǎng)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923和銅綠假單胞菌ATCC27853菌株購自美國典型菌種保藏中心。

1.3 主要試劑和儀器

主要培養(yǎng)基和試劑：LB肉湯增菌液(杭州微生物公司)、ECC顯色培養(yǎng)基(鄭州博賽科瑪嘉微生物公司)、LB瓊脂干粉(北京陸橋有限公司)、MH瓊脂干粉(英國Oxoid公司)、TaKaRaTaqTM試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)、瓊脂糖(南京生興生物有限公司)、API20E生化鑒定條(法國bioMerieux公司)。

表1 22種抗生素的類型、名稱及規(guī)格

主要儀器和耗材：PCR擴增儀(美國AppliedBiosystems公司)、恒溫電熱培養(yǎng)箱(天津中環(huán)實驗器材有限公司)、凝膠電泳儀(美國伯樂公司)、濁度計(法國bioMerieux公司)、抗生素藥敏紙片(英國Oxoid公司)見表1。

2 方法

2.1 分離培養(yǎng)及生化鑒定

參照國標(biāo)GB/T4789.36-2008、WS271-2007進行分離培養(yǎng)，大致流程為標(biāo)本直接劃線ECC平板，同時使用腸道增菌液增菌過夜后接種至ECC平板，可疑菌落轉(zhuǎn)接至三糖鐵斜面做初步生化，初步生化可疑菌落使用API20E鑒定條進行生化鑒定。

2.2 毒力基因測定2.2.1DNA模板的制備(沸水浴法)

取LB瓊脂平板上分離純培養(yǎng)的大腸埃希菌菌落置于裝有100μL無菌蒸餾水的1.5mL離心管中，震蕩混勻后100℃水浴10min，12000r/min離心2min，吸取上清液即為DNA模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2PCR檢測

采用中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所提供的多重PCR檢測EPEC、ETEC、EAEC、EHEC、EIEC五種致瀉性大腸埃希菌的方法進行檢測[8]。反應(yīng)總體積為50μL，在1.5mL的離心管中依次加入10×buffer10μL，dNTP8μL，引物rrs-F/R(10μmol/L)各0.1μL，ipaH-F/R(10μmol/L)各0.2μL，lt-F/R(10μmol/L)各0.4μL，aggR-F/R(10μmol/L)各0.6μL，eaeA-F/R(10μmol/L)各0.5μL，stx1-F/R(10μmol/L)各0.5μL，stx2-F/R(10μmol/L)各0.5μL，stIb-F/R(10μmol/L)各2μL，stIa-F(10μmol/L)2μL，Taq酶0.8μL/5U，DNA模板2μL補充無菌水至50μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火45s，72℃延伸45s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

2.3 抗生素敏感性試驗

采用K-B瓊脂擴散法(WHO推薦)做DEC分離株的 22種常用抗生素的藥敏試驗，方法步驟參照2013版《抗菌藥物敏感性試驗紙片法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》[9]，結(jié)果判定參照2016版藥物敏感試驗指南(CLSIM100-S26)。

2.4 資料的整理與分析

采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計分析。用excel整理錄入相關(guān)數(shù)據(jù)，用頻數(shù)構(gòu)成比進行統(tǒng)計描述，運用卡方檢驗法比較頻率或頻率分布。

3 結(jié)果

3.1 流行特征

3.1.1 人群特征

感染性腹瀉人群中檢出95例DEC陽性感染者，檢出率為9.4%。女性DEC檢出率10.3%(49/477)，男性則為8.7%(46/531)。樣本人群年齡均值為(24.15±1.64)歲，最低年齡為1個月齡，最高年齡為85歲；14～25歲、25～35歲檢出率相對較高，分別為11.5%(26/226)、11.6%(31/268)，45歲以上年齡段檢出率最低，為2.7%(4/149)；卡方檢驗比較分析不同性別、年齡DEC的檢出情況，發(fā)現(xiàn)在年齡分布上檢出率存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，見表2。

表2 不同性別、年齡段、年份致瀉性大腸埃希的檢出情況

3.1.2 時間分布特征

2011～2015年DEC的檢出率如表2，比較不同年份DEC的檢出情況，發(fā)現(xiàn)5年中DEC檢出率不存在統(tǒng)計學(xué)差異(P﹥0.05)。

3.1.3 分型情況

腹瀉人群感染ETEC(lt和/或st陽性)為主，占60.0%(56/95)，其次為EPEC(eae陽性且stx1和stx2均為陰性)和EAEC(aggR陽性)，分別占22.1%(21/95)、15.8%(15/95)，EIEC(ipaH陽性)少見，占2.1%(2/95)，STEC未檢出。

3.2 藥敏試驗結(jié)果3.2.1 致瀉性大腸埃希菌抗生素耐藥狀況

DEC出現(xiàn)較高耐藥率的是萘啶酸(69.5%)，其次是氨芐西林(40.0%)和四環(huán)素(34.7%)；其余抗生素中除了甲氧芐氨嘧啶(28.4%)、復(fù)方新諾明(27.4%)，其他抗生素耐藥率均在20.0%以下。中介敏感率最高的是鏈霉素(67.4%)，其次是頭孢噻吩(46.3%)。敏感率100.0% 的有美羅培南、亞胺培南，敏感率高于95%的有頭孢西丁、阿米卡星、呋喃妥因。

DEC對三代頭孢素(CTX、CRO、CAZ)的耐藥率均在15.0%以下，四代頭孢素(FEP)的耐藥率更是低于5.0%，對環(huán)丙沙星(CIP)和左氧氟沙星(LEV)的耐藥率也均低于7.0%。見表3。

3.2.2 各型致瀉性大腸埃希菌抗生素耐藥狀況

ETEC耐藥情況：出現(xiàn)抗生素敏感率為100%的有舒巴坦、阿莫西林、阿米卡星和頭孢西??；耐藥率最高的是萘啶酸(75.0%)，其次是四環(huán)素和氨芐西林(30.4%，26.8%)，對其余的抗生素耐藥率均在18.0%以下。

EPEC耐藥情況：對呋喃妥因的敏感率為100.0%；耐藥率最高的是氨芐西林(71.4%)，其次是萘啶酸(61.9%)，對甲氧芐氨嘧啶、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、慶大霉素均50.0%，并且對三代頭孢類(CTX、CRO)的耐藥率均達28.6%。

EAEC耐藥情況：全部菌株對阿米卡星、頭孢他叮、頭孢吡肟敏感；耐藥率較高的是萘啶酸、氨芐西林(62.5%，52.2%)，其次是復(fù)方新諾明、甲氧芐氨嘧啶、鏈霉素(均為25.0 %)，除了四環(huán)素、呋喃妥因，對其余抗生素耐藥率均低于10.0%。見表4。

2株EIEC有1株出現(xiàn)耐藥，對氯霉素、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、甲氧芐啶及復(fù)方新諾明均產(chǎn)生耐藥性。

表3 致瀉性大腸埃希菌對各種抗生素的敏感性情況

表4 ETEC、EPEC、EAEC 對各種抗生素的敏感情況

3.2.3 致瀉性大腸埃希菌的多重耐藥情況

藥敏試驗結(jié)果顯示DEC多重耐藥率(MDR)為38.9%(37/95)，ETEC、EPEC、EAEC多重耐藥率分別為25.0%(14/56)、66.7%(14/21)、43.8%(7/16)，2株EIEC中有1株出現(xiàn)多重耐藥的情況，見表5。

DEC多重耐藥譜可分為19種，多見于四類抗生素的多重耐藥(32.4%，12/37)，最多可出現(xiàn)七類抗生素的多重耐藥(8.1%，3/37)。耐七類的有3株，耐藥譜一致(磺胺+四環(huán)素+青霉素+氨基糖苷+喹諾酮+頭孢+酰胺醇)；耐六類的有4株，耐藥譜以磺胺+四環(huán)素+青霉素+氨基糖苷+喹諾酮+頭孢多見(75.0%，3/4)；耐藥五類的有8株，耐藥譜以磺胺+四環(huán)素+青霉素+氨基糖苷+喹諾酮多見(75.0%，6/8)；耐四類抗生素的有12株，出現(xiàn)7種耐藥譜，以磺胺+青霉素+氨基糖苷+喹諾酮多見(33.3%，4/12)；耐三類的有10株，以磺胺+喹諾酮+青霉素多見(40.0%，4/10)。見表5。

表5 致瀉性大腸埃希菌的多重耐藥情況

4 討論

深圳市作為經(jīng)濟特區(qū)，毗鄰港澳，是經(jīng)濟貿(mào)易和生產(chǎn)制造的樞紐，人口密集，且流動性大，是腹瀉歷來的高發(fā)地區(qū)，DEC作為腹瀉的主要病因之一，掌握其感染水平，有利于感染性腹瀉的防控。結(jié)果顯示深圳市龍崗區(qū)急性腹瀉患者中DEC的檢出率為9.4%，與河南相似(10.4%)，低于福建地區(qū)(12.7%)，高于北京地區(qū)報道的檢出率[10～12]；與國外相比，普遍低于該類研究報告的檢出率[13～15]。可能是由于經(jīng)濟發(fā)展?fàn)顩r、環(huán)境條件、飲食結(jié)構(gòu)的差異，而導(dǎo)致不同地區(qū)不同人群中DEC的檢出率不一。DEC在年齡分布上存在差異，感染多集中在成年人中，這與國內(nèi)其他研究結(jié)果一致[16,17]?？赡苁且驗榍鄩涯晟鐣顒宇l繁，外出就餐幾率大，暴露機會大增加所致。資料顯示5年中DEC的檢出率不存在統(tǒng)計學(xué)差異，提示近五年來研究地區(qū)腹瀉人群中DEC感染水平比較穩(wěn)定。結(jié)果顯示腹瀉人群的檢出ETEC為主，其次是EPEC，這與深圳市監(jiān)測數(shù)據(jù)[16]顯示一致，提示研究地區(qū)不存在致瀉性大腸埃希菌的優(yōu)勢型別變遷現(xiàn)象。與國內(nèi)其他地區(qū)相比，上海地區(qū)腹瀉人群中檢出也是以ETEC多見，而沈陽、杭州地區(qū)以EAEC多見(70.3%，55.9%)，北京、福建地區(qū)以EPEC多見(42.8%、50.77%)[18,19]。

抗生素藥敏結(jié)果表明，研究地區(qū)的DEC出現(xiàn)較高耐藥率的是萘啶酸、氨芐西林、四環(huán)素。在同類研究中，上海地區(qū)[20]報道耐藥率較高的前三種抗生素為甲氧芐啶、萘啶酸和四環(huán)素；沈陽地區(qū)[21]報道是氨芐西林、復(fù)方新諾明和慶大霉素；武漢[22]地區(qū)報道的是氨芐西林、哌拉西林和環(huán)丙沙星耐藥率。提示不同地區(qū)DEC的耐藥情況大同小異，基本上都對氨芐西林耐藥。在本研究中，DEC對氨芐西林具有較高的的耐藥率，特別是EPEC和EAEC，原因可能是因為該藥物為非處方藥，方便購買且價格便宜，易出現(xiàn)非適應(yīng)癥群體不規(guī)范使用或濫用，而導(dǎo)致耐藥率較高。

對于臨床常用的喹諾酮類(CIP、LEV)，DEC并沒有出現(xiàn)較高的耐藥率(均<7.0%)，而張燕飛、王佳軍等[5,22]報道的DEC臨床分離株耐藥率均超過50.0%，可能是由于不同研究地區(qū)臨床使用抗生素的情況不同所致，但耐藥率相差較大，需作進一步確證研究。萘啶酸為第一代喹諾酮類抗生素，于1962 年被發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于臨床尿路感染的治療中，但很快就發(fā)現(xiàn)很多細菌已經(jīng)對其產(chǎn)生了耐藥性，現(xiàn)在臨床上較少使用該類藥物[23]。DEC對萘啶酸的耐藥率高達69.5%，與楊秋娥[24]報道的豬源DEC耐藥率都相似(65.0%)，低于趙瑞華[25]報道泌尿系大腸埃希菌分離株的耐藥率(74.9%)，說明不同來源的菌株對萘啶酸均出現(xiàn)較高的抗藥性。研究顯示，肉類食品、動物體內(nèi)分離的藥菌株存在流行病學(xué)相關(guān)性[25,26]，即耐藥菌可通過食物鏈進行感染傳播，所以研究地區(qū)DEC出現(xiàn)萘啶酸的高抗藥性，可能和動物源或食物源的耐藥菌有關(guān)。頭孢類抗生素是目前治療兒童腹瀉的首選，本研究中DEC對三代、四代頭孢菌株素的耐藥率較低，對該類抗生素仍具有較高的敏感性，故在臨床治療仍能產(chǎn)生較好的效果。

本研究結(jié)果顯示深圳市龍崗區(qū)DEC的多重耐藥率達38.9%，普遍低于國內(nèi)外其他報道的結(jié)果 ，雖然多重耐藥率相對不高，由于抗生素廣泛使用及抗藥基因水平轉(zhuǎn)移均使得細菌的耐藥趨勢發(fā)展迅速[27]，因此仍需加強監(jiān)測，警惕DEC多重耐藥的快速增高。DEC的多重耐藥譜多樣，主要以磺胺類+青霉素類+四環(huán)素類+喹諾酮類+氨基糖苷類+頭孢類、磺胺+四環(huán)素+青霉素+氨基糖苷+喹諾酮和磺胺+喹諾酮+青霉素的3種多重耐藥組合多見。

深圳市龍崗區(qū)各類大腸埃希菌抗生素的耐藥種類和程度有所不同。EPEC產(chǎn)生較高耐藥率的抗生素種類較多，耐藥率在50.0%以上的有6種，而ETEC和EAEC分別只有1種和2種。EPEC耐藥類型以多重耐藥多見，多重耐藥率超過60.0%，是多重耐藥率最高的分型，多數(shù)研究也報道EPEC多重耐藥率高達50.0%～70.0%[28,29]，提示研究地區(qū)各個型別的DEC耐藥情況有所不同，故臨床治療時需根據(jù)致病型別選擇用藥。

綜上所述，DEC是一起本地區(qū)急性感染性腹瀉的主要病原菌，對萘啶酸、氨芐西林、四環(huán)素的耐藥較嚴(yán)重，并且各分型的抗生素耐藥不同，EPEC耐抗生素的種類最多，多重耐藥情況較嚴(yán)重，需加強關(guān)注。細菌的耐藥性會隨著時間的變化而增加，尼日利亞的一項的研究顯示，從1986～1998年的12年間，致瀉性大腸埃希菌對四環(huán)素、氨芐青霉素、氯霉素的耐藥率從9%～35%上升到56%～100%[27]，所以需要長期監(jiān)測DEC的分布和耐藥特征，為本地區(qū)DEC流行的防控及臨床合理使用抗生素提供客觀依據(jù)。

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The infection status and drug-reistance analysis of diarrheagenic escherichiacoli in Longgang district of Shenzhen from 2011 to 2015

BAIJiang-tao1,YANGHui2,CHENYing-jian2,LIUQu2,JINYu-juan2,GANLi-ping2,YEZhen-zhen2

(1.Longhua Center of Disease Control and Prevention in Shenzhen, Shenzhen 570100；2.Longgang Center of Disease Control and Prevention in Shenzhen, Shenzhen 518172)

Objective:To survey the infection and drug resistance of diarrheagenic escherichiacoli (DEC) in the population of diarrhea in order to prevention and control of diarrhea caused by bacteria and provide the basis for clinical treatment. Methods: Stool samples of diarrhea patients in Longgang district during the period of 2011-2015 were collected. DEC was isolated, cultured and performed biochemical identification. PCR was used to identify and typing. Kirby Bauer disk diffusion method was applied to perform antibiotic susceptibility testing.Results:The detection rate of DEC was 9.4% (95/1008); There was significant difference (P<0.05)ontheagedistribution,thetoptwogroupswere14to25 (11.5%)and25to35year-oldgroups(11.6%).ETECwasthemaintypeaccountingfor60.0% (56/95),followedbyEPEC(22.1%, 21/95)andtheEAEC(15.8%, 15/95).Therateofresistancetonalidixicacid(69.5%)washighest,followedbyampicillin(40.0%)andtetracycline(34.7%);MultidrugresistancerateofDECwas38.9%.ThoseofETEC,EPEC,EAECwere25.0%, 66.7%, 43.8%,respectively. Conclusion:The ETEC infection rate in DEC was the highest in Longgang District. The multidrug resistance of DEC was serious. Therefore clinical doctors should be aware of rational use of antibiotics.

diarrheagenic escherichiacoli;diarrhea;drug-resistance

1.2014年廣東省醫(yī)學(xué)科研基金，編號：2014669;2.2015深圳市科技研發(fā)項目，編號：2015486。

白江濤(1968～)男，廣東深圳人，主管技師。

金玉娟(1976～)女，廣東深圳人，博士，主任技師。E-mail:yujuanjin@126.com。

R

B

1008-0104(2017)02-0056-05

2016-12-08)