HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒免疫獲得血清內(nèi)中和抗體評(píng)價(jià)①

王曉巖 張 海 雷迎峰 林 芳 崔 穎 李 斌 張惠中 韋三華

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)科，西安710038)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒免疫獲得血清內(nèi)中和抗體評(píng)價(jià)①

王曉巖 張 海②雷迎峰③林 芳 崔 穎 李 斌 張惠中 韋三華④

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)科，西安710038)

目的：純化的HCV多中和抗原表位及HCV包膜蛋白E2嵌合的HBV S抗原病毒樣顆粒免疫新西蘭兔，測(cè)定免疫血清內(nèi)的中和抗體。分析中和抗體對(duì)HCVpp感染Huh7.5的中和作用。方法：純化的HCV多中和抗原表位及包膜蛋白E2嵌合的HBV S抗原病毒樣顆粒(VLPs-MEpS、VLPs-E2S)10 μg皮下接種新西蘭兔，間隔2周共免疫3次，采集不同時(shí)間免疫兔血清，ELISA方法測(cè)定血清內(nèi)的抗體，PBS組作為對(duì)照；制備1b型HCVpp，觀察血清抗體對(duì)HCVpp感染Huh7.5的中和作用，對(duì)免疫血清保護(hù)性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。結(jié)果：免疫后血清中產(chǎn)生一定水平的中和抗體，血清中和抗體測(cè)定VLPs-MEpS明顯高于VLPs-E2S(P<0.05)。VLPs-MEpS與VLPs-E2S組均顯著高于對(duì)照PBS組(P<0.01)。對(duì)HCVpp抑制作用，VLPs-MEpS高于VLPs-E2S組(P<0.05)，最高中和率可達(dá)61.49%，二者均高于對(duì)照組(P<0.01)。結(jié)論：嵌合病毒樣顆粒免疫新西蘭兔后產(chǎn)生一定水平中和抗體，該中和抗體具有保護(hù)作用，為研發(fā)中和抗體表位疫苗奠定基礎(chǔ)。

丙型肝炎病毒(HCV)；表位；病毒樣顆粒；中和抗體；免疫

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)急性感染后僅20%～30%的感染者能夠自發(fā)清除病毒，55%～85%感染者發(fā)展為慢性化持續(xù)感染[1,2]，慢性感染者中約20%最終發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞腫瘤或肝功能衰竭。全球估計(jì)有超過(guò)1.85億人感染HCV，每年新增感染者300～400萬(wàn)人，因HCV感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)達(dá)到35萬(wàn)[3,4]。一直以來(lái)丙型肝炎的疫苗研制受到包膜蛋白高度變異、缺乏細(xì)胞和小動(dòng)物模型等多種原因的限制而進(jìn)展緩慢。近年來(lái)以NS3/NS4A 蛋白酶抑制劑(Simeprevir等) 和 NS5B聚合酶抑制劑(Sofosbuvir等)為代表的治療性藥物的發(fā)展，為HCV感染治療帶來(lái)了突破性的進(jìn)展，研究顯示治療組的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)可達(dá)90%以上，因此WHO在2014年丙肝指南中指出丙肝是可以治愈的[5-7]。但是丙肝藥物價(jià)格昂貴，副作用研究尚未深入，短期內(nèi)難以廣泛應(yīng)用。因此HCV疫苗的研究仍是最經(jīng)濟(jì)的預(yù)防和緩解其全球化流行和感染的有效方式，疫苗研究的需求依然迫切。近年來(lái)，基于HCV假病毒顆粒(HCVpp)與HCV體外培養(yǎng)系統(tǒng)(HCVcc)的應(yīng)用和建立，隨著人們對(duì)中和抗體在機(jī)體適應(yīng)性免疫中的作用，特別是交叉保護(hù)作用的認(rèn)識(shí)逐步深入，使誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的預(yù)防性疫苗研究成為新的希望[8,9]。

我們前期將串聯(lián)HCV多中和抗原表位嵌合于HBV S的氨基端胞外區(qū)，制備嵌合HCV多中和抗原表位的HBV S抗原病毒樣顆粒(VLPs-MEpS)；同時(shí)將HCV包膜蛋白E2嵌合于HBV S抗原氨基端，制備嵌合HCV包膜蛋白E2的HBV S抗原病毒樣顆粒(VLPs-E2S)；此外制備了嵌合完整HBV基因序列的病毒樣顆粒(VLPs-HBS)。成功制備出三種嵌合病毒樣顆粒，所得到的VLPs濃度最高可達(dá)3.0×104ng/ml，為后續(xù)的免疫動(dòng)物提供了條件。本文中我們將純化濃縮的嵌合VLPs分別免疫新西蘭兔，觀察免疫后誘導(dǎo)的中和抗體產(chǎn)生情況，并制備1b型HCVpp，HCVpp和免疫血清混合后感染Huh7.5細(xì)胞，通過(guò)免疫血清抑制HCVpp感染的作用評(píng)價(jià)中和抗體的活性，從而為HCV中和抗體疫苗的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 VLPs-MEpS、VLPs-E2S及VLPs-HBS由本室制備保存。四種中和抗原表位多肽由北京Sunny公司合成。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)購(gòu)于Gibco。Lipofectamine 2000?轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于Invitr-ogen。重組乙型肝炎疫苗(釀酒酵母)安在時(shí)?購(gòu)于GlaxoSmithKline Biologicals。佐劑AddaVaxTM購(gòu)自美國(guó)Invivogen公司。Amicon? Ultracell-15 100K離心過(guò)濾器購(gòu)于Millipore。Anti-Hepatitis C Virus E1、E2 antibody購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。HRP標(biāo)記的羊抗兔購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。HCV包膜質(zhì)粒pVRC-E1E2(1b)、包裝質(zhì)粒pHR′CMVΔ8.2、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-CG由第四軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室雷迎峰博士惠贈(zèng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 18只新西蘭兔，雄性，年齡3個(gè)月左右，來(lái)自于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物免疫 18只新西蘭兔分為6組，每組3只，分別命名為VLPs-MEpS、VLPs-E2S、VLPs-HBS、Vaccine(乙肝疫苗組)、Adjuvant(佐劑組)、PBS組。分別取10 μg純化的VLPs或10 μg Vaccine與同體積的MF59佐劑混合成油包水狀后免疫新西蘭兔， PBS補(bǔ)齊確保各個(gè)組免疫前體積相同。間隔2周免疫，共免疫3次。兔子背部局部皮下4～5個(gè)點(diǎn)注射，3次免疫前先采血。第0天開(kāi)始耳緣靜脈采血，每隔2周采血1次，即0、14、28、42、56和70 d分別采血1次。離心5 min留取血清，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫血清抗體測(cè)定 合成肽和BSA按照1個(gè)BSA 分子結(jié)合10個(gè)肽分子左右的比例混勻；加入新鮮配制的0.3%戊二醛溶液進(jìn)行交聯(lián)，室溫作用2 h；用1 mol/L甘油封閉30 min；0.2 mol/L 硼酸緩沖液(pH8.5)透析，0.45 μm濾器過(guò)濾，BCA法定量。96孔板包被抗原交聯(lián)肽(四種交聯(lián)肽混合物)，包被濃度為16 μg/ml，每孔100 μl，4℃過(guò)夜；同時(shí)包被HBS表面抗原陽(yáng)性血清(1∶500稀釋)，PBST洗3遍；2%BSA封閉,37℃ 1 h，PBST洗3遍；加入兔免疫血清(1∶200稀釋)，37℃ 1 h，PBST洗3遍；加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶4 000稀釋)，37℃ 1 h，PBST洗3遍；加入TMB顯色液100 μl，37℃顯色5～10 min；加入終止液50 μl；30 min內(nèi)450 nm測(cè)定OD值。

1.2.3 1b型HCVpp的制備 HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)傳代至75 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)80%～90%時(shí)，HCV包膜質(zhì)粒pVRC-E1E2(1b)、包裝質(zhì)粒pHR′CMVΔ8.2、轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pCS-CG，按照比例為3 μg:6 μg:9 μg的量(每75 cm2培養(yǎng)瓶)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，4～6 h后更換含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)液。48～72 h間熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)情況，并在48、72 h分別收獲一次培養(yǎng)上清，4℃暫存。

1.2.4 1b型HCVpp的濃縮、鑒定 收獲的培養(yǎng)上清，7 000 r/min，4℃離心10 min，棄去沉淀；0.45 μm濾器過(guò)濾除菌；Amicon Ultracell-15 100K離心過(guò)濾器濃縮上清，分裝后-80℃保存；取20 μl濃縮后HCVpp，加入10 μl的5×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸5 min，12 000 r/min離心5 min；取50 μg的產(chǎn)物進(jìn)行蛋白電泳(SDS-PAGE)，電壓80 V，20 min，電壓120 V，1.5 h左右；轉(zhuǎn)移至NC膜， 26 mA，3 h左右；5%脫脂奶粉封閉2 h；E1多克隆抗體(Anti-E1 pAb)1∶1 000 稀釋，E2多克隆抗體(Anti-E2 pAb)1∶2 000稀釋；4℃孵育過(guò)夜；TBST洗3次，10 min/次；HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗 1∶5 000稀釋，室溫振蕩孵育1 h；TBST洗3次，10 min/次；ECL發(fā)光。

1.2.5 HCVpp的轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU) 的確定 1×105/孔的Huh7.5細(xì)胞接種到12孔板中。細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，吸附病毒：將濃縮后的HCVpp培養(yǎng)上清用DMEM完全培養(yǎng)液按1∶1、1∶5、1∶10的比例稀釋。每個(gè)孔加入1 ml的稀釋液(每個(gè)稀釋度兩孔)，37℃吸附12 h左右；更換為DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。消化細(xì)胞，800 r/min離心5 min，PBS清洗2遍(800 r/min，5 min)，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)；取EGFP陽(yáng)性率達(dá)到50%～80%的HCVpp稀釋度。根據(jù)病毒合適稀釋度下EGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)來(lái)計(jì)算制備的HCVpp的轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。計(jì)算方法為：TU/ml=(初始靶細(xì)胞數(shù)/HCVpp ml體積)×(EGFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分率/100)。計(jì)算出EGFP陽(yáng)性率達(dá)到50%～80%時(shí)所需HCVpp轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。

1.2.6 免疫血清對(duì)HCVpp感染Huh7.5細(xì)胞的抑制性分析 將2×104/孔的Huh7.5細(xì)胞接種于24孔板，37℃，5%CO2條件下過(guò)夜培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)70%～80%為最宜；將免疫血清(預(yù)先56℃、30 min滅活)1∶10(100 μl)稀釋，與含有合適轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的HCVpp(1b型)等體積混合均勻，室溫1 h；DMEM清洗24孔板，將HCVpp與血清混合物加到24 孔板中，每孔200 μl。37℃吸附12 h后，更換DMEM完全培養(yǎng)液；48 h后流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)表達(dá)EGFP的陽(yáng)性細(xì)胞的比率。PBS組為非抑制對(duì)照。每組均做3個(gè)復(fù)孔。中和率(抑制率)計(jì)算：中和率=(%EGFP對(duì)照組-%EGFP實(shí)驗(yàn)組)/%EGFP對(duì)照組。

2 結(jié)果

2.1 免疫血清中抗體的ELISA測(cè)定 分別包被抗原交聯(lián)肽和HBV表面抗原陽(yáng)性血清，檢測(cè)兔免疫血清中抗體產(chǎn)生情況。以收取血清的不同時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，ELISA檢測(cè)結(jié)果OD值為縱坐標(biāo)作圖，分析不同組別中抗體的水平。ELISA檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)VLPs-MEpS組和VLPs-E2S組抗體水平(OD值)隨著免疫時(shí)間延長(zhǎng)逐漸上升，42 d達(dá)到高峰。42 d時(shí)VLPs-MEpS組為1.15±0.02，VLPs-E2S組為0.97±0.07，對(duì)照PBS組為0.08±0.02。VLPs-MEpS組的血清抗體水平高于VLPs-E2S組(P<0.05)；二者均明顯高于對(duì)照PBS組(P<0.01)(圖1A)。表明嵌合病毒樣顆粒免疫兔后產(chǎn)生了一定水平的抗體。以HBV表面抗原陽(yáng)性血清作為包被抗原，檢測(cè)HBV S抗原載體的免疫原性，可見(jiàn)VLPs-MEpS、VLPs-E2S、VLPs-HBS、Vaccine均有較高的免疫反應(yīng)，42 d時(shí)VLPs-MEpS組OD值為1.43±0.13，VLPs-E2S組為1.26±0.11，VLPs-HBS為1.30±0.16，Vaccine組為1.6±0.1，對(duì)照PBS組為0.13±0.02。各組抗體水平明顯高于對(duì)照PBS組(P<0.01，圖1B)。結(jié)果表明HCV多中和抗原表位嵌合病毒樣顆粒具有良好的免疫原性。

2.2 HCVpp的制備及鑒定

2.2.1 1b型 HCVpp的包裝 三種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞48、72 h后，熒光顯微鏡下觀察，均可見(jiàn)約80%的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，表明HCVpp包裝成功(圖2)。

2.2.2 HCVpp表面包膜蛋白E1、E2的鑒定 20 μl 濃縮后HCVpp 進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果可見(jiàn)，用抗E1多抗作為一抗時(shí)，在約35 kD處檢測(cè)到蛋白，即為糖基化的包膜蛋白E1(圖3)；用抗E2多抗作為一抗時(shí)，在約58 kD處檢測(cè)到蛋白，即為糖基化的包膜蛋白E2(圖4)； 結(jié)果表明包膜蛋白E1E2成功嵌入到HCVpp表面。

2.3 免疫血清對(duì)HCVpp感染Huh7.5細(xì)胞的抑制性分析 免疫血清1∶10稀釋后與等體積HCVpp混合，加入Huh7.5細(xì)胞，48 h后觀察血清對(duì)HCVpp感染Huh7.5的中和作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，42 d時(shí)VLPs-MEpS組中和率(%)為61.49±1.50，VLPs-E2S組為47.30±2.07，PBS組為-1.57±0.42。VLPs-MEpS組血清對(duì)1b型HCVpp感染Huh7.5的中和作用高于VLPs-E2S組(P<0.05)。VLPs-MEpS組和VLPs-E2S組顯著高于對(duì)照PBS組(P<0.01)，并且最高中和率可達(dá)61.49%(圖5A)；免疫后(42 d)與免疫前(0 d)比較VLPs-MEpS組和VLPs-E2S組中和率有顯著差異(P<0.01，圖5B)。

圖1 免疫血清中抗體的測(cè)定Fig.1 Analysis level of antibody in rabbit serumNote: A.Coating with polypeptide;B.Coating with HBsAg.

圖2 三種包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后EGFP的表達(dá)(×40)Fig.2 EGFP expression after co-transfection of three plasmids(×40)

圖3 Western blot檢測(cè)1b型HCVpp表面包膜蛋白E1Fig.3 Western blot analysis of E1 on surface of 1b HCVppNote: 1.HCVpp of genotype 1b；2.Negative control.

圖4 Western blot檢測(cè)1b型HCVpp表面包膜蛋白E2Fig.4 Western blot analysis of E2 on surface of 1b HCVppNote: 1.Negative control；2.HCVpp of genotype 1b.

圖5 兔免疫血清對(duì)HCVpp感染Huh7.5細(xì)胞的抑制性分析Fig.5 Inhibition analysis of rabbit serum to HCVpp infection to Huh7.5 cellsNote: 42 d vs 0 d，**.P<0.01.

3 討論

HCV感染后，病毒中許多蛋白抗原(如核心蛋白、包膜蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白)都可誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生。但在這些抗體中，只有針對(duì)包膜糖蛋白E1/E2的中和抗體具有保護(hù)作用。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，HCV包膜糖蛋白E1/E2存在保守的中和性抗原表位，針對(duì)這些表位的單克隆抗體具有廣譜的交叉中和活性[10-12]。以上研究結(jié)果為中和表位疫苗的研究提供了依據(jù)。尋求理想的載體，呈遞和表達(dá)中和抗原表位，成為HCV中和表位疫苗研究的方法之一。

病毒樣顆粒(Virus like particles,VLPs)是不含病毒顆粒，形態(tài)結(jié)構(gòu)與天然病毒相似的能自我裝配的病毒空殼。絕大多數(shù)的VLPs直徑在20～100 nm之間，這使得其能夠自由進(jìn)入淋巴管到達(dá)被膜下淋巴結(jié)選擇性的被抗原提呈細(xì)胞所攝取[13]。許多病毒結(jié)構(gòu)蛋白都具有自主組裝成VLPs的能力。由于VLPs不含病毒遺傳物質(zhì)，所以不具備感染性，而具有很強(qiáng)的免疫原性和生物學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于疫苗研究領(lǐng)域[14,15]。VLPs在結(jié)構(gòu)上允許外源基因或基因片段的插入而形成嵌合體VLPs并將外源性抗原展示在其表面，保留了天然病毒顆粒的空間構(gòu)象和誘導(dǎo)中和抗體的抗原表位，比亞單位疫苗和重組的蛋白疫苗具有更強(qiáng)的免疫原性，能夠激發(fā)機(jī)體體液免疫、細(xì)胞免疫及黏膜免疫。其機(jī)制可能為VLPs的大小適合被樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)攝取，經(jīng)加工處理后的抗原可通過(guò)MHCⅡ類分子提呈，促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和遷移。而外源性的VLPs能通過(guò)交叉提呈的方式通過(guò)MHCⅠ類分子提呈，從而活化CD8+T細(xì)胞，介導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)[16]。

HBV小包膜蛋白抗原(HBsAg-S)基因大小為681 bp，在無(wú)核心蛋白和基因組參與下有自我裝配能力。其101～159位氨基酸區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)，形成的雙環(huán)結(jié)構(gòu)可表達(dá)外源性表位蛋白，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中形成與野生型病毒相似的VLPs，可分泌至細(xì)胞外。國(guó)內(nèi)外研究者以HBV S 為載體，對(duì)嵌合表達(dá)的病原體如A型流感病毒、HIV等保守的表位進(jìn)行了研究[17,18]，以及已完成臨床3期試驗(yàn)的RTS,S/AS01瘧疾疫苗(其中RTS代表環(huán)子孢子蛋白，S代表HBV S)[19]。

各國(guó)學(xué)者在HCV VLPs方面做出許多嘗試。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生院Liang等[20]用重組桿狀病毒包裝HCV結(jié)構(gòu)蛋白core、E1、E2形成VLPs用于免疫狒狒，誘導(dǎo)出較強(qiáng)的細(xì)胞和體液免疫。法國(guó)科學(xué)家Huret等[21]用逆轉(zhuǎn)錄病毒MLV Gag和重組質(zhì)粒為核心，1a型HCVE1、E2為包膜，包裝重組HCV病毒樣顆粒，在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。澳大利亞學(xué)者以HBV S基因?yàn)檩d體，嵌合HCV E2高變區(qū)HVR1至親水區(qū)，形成VLPs，在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出抗HCV活性的抗血清，可抑制HCVpp感染Huh7細(xì)胞[22]。Beaumont等[23]將HCV E1和E2分別嵌合在HBV S的氨基端，并用HCV E1和E2的TMD替換HBV S基因的第一個(gè)TMD，在BHK-21和CHO細(xì)胞系中成功包裝出嵌合的VLPs，但該研究不足之處是用HCV TMD替換HBV S基因TMD后，只有野生型VLPs存在下才能分泌出嵌合的VLPs。

我們?cè)谇捌谘芯恐校瑢BV S基因克隆至表達(dá)載體pCI-neo中，并將選擇的4個(gè)已明確的HCV中和抗原表位分別嵌合于HBV S抗原親水區(qū)，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在培養(yǎng)上清中得到了嵌合HCV中和抗原表位的HBV S抗原病毒樣顆粒(VLPs)，純化濃縮后免疫小鼠，結(jié)果小鼠血清檢測(cè)到低水平的中和抗體，具有一定保護(hù)作用[24]。在此基礎(chǔ)上，我們將表位串聯(lián)，插入HBV S基因胞外區(qū)，制備嵌合多中和抗原表位的病毒樣顆粒，并得到較高水平的嵌合病毒樣顆粒。用純化濃縮的VLPs免疫新西蘭兔，收集免疫后的血清。以合成多肽為包被抗原，ELISA法檢測(cè)兔免疫血清中抗體的水平，發(fā)現(xiàn)VLPs-MEpS組和VLPs-E2S組相比對(duì)照組明顯檢測(cè)到血清中的抗體，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。免疫后第42天，抗體量達(dá)到高峰。VLPs-MEpS組高于VLPs-E2S組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，結(jié)果顯示了串聯(lián)多中和抗原表位制備的VLPs具有較好的免疫性。同時(shí)我們制備了用于評(píng)價(jià)中和抗體水平及保護(hù)作用的HCVpp，以一定轉(zhuǎn)導(dǎo)單位的1b型HCVpp與免疫血清混合后感染Huh7.5細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清內(nèi)的抗體對(duì)HCVpp感染Huh7.5有一定的抑制作用，抑制作用在42 d達(dá)到高峰，VLPs-MEpS組的抑制效果(中和率)高于VLPs-E2S免疫組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。VLPs-MEpS組和VLPs-E2S組在免疫后(42 d)免疫血清抑制HCVpp感染Huh7.5作用明顯高于免疫前(0 d)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明免疫血清中產(chǎn)生中和抗體，并且中和抗體具有一定的保護(hù)作用。下一步我們將用不同型別的HCVpp及HCVcc評(píng)價(jià)免疫血清中的中和抗體的保護(hù)作用。進(jìn)一步證實(shí)嵌合多中和抗原表位病毒樣顆粒疫苗的可行性。

[1] Santantonio T,Wiegand J,Gerlach JT.Acute hepatitis C:current status and remaining challenges[J].J Hepatol，2008,49(4):625-633.

[2] Webster DP,Klenerman P,Dusheiko GM.Hepatitis C[J].Lancet，2015,385(9973):1124-1135.

[3] Messina JP,Humphreys I,Flaxman A,etal.Global distribution and prevalence of hepatitis C virus genotypes[J].Hepatology，2015,61(1):77-87.

[4] El-Guindi MA.Hepatitis C viral infection in children:updated review[J].Pediatr Gastroenterol Hepatol Nutr，2016,19(2):83-95.

[5] Soriano V,Labarga P,Barreiro P,etal.Drug interactions with new hepatitis C oral drugs[J].Expert Opin Drug Metab Toxicol，2015,11(3):333-341.

[6] Lee R,Kottilil S,Wilson E.Sofosbuvir/velpatasvir:a pangenotypic drug to simplify HCV therapy[J].Hepatol Int，2016,11(2):161-170.

[7] Afdhal N,Zeuzem S,Kwo P,etal.Ledipasvir and sofosbuvir for untreated HCV genotype 1 infection[J].N Engl J Med，2014,370(20):1889-1898.

[8] Wakita T.Hepatitis C virus vaccine[J].Nihon Rinsho，2008,66(10):1961-1964.

[9] Catanese MT,Dorner M.Advances in experimental systems to study hepatitis C virus in vitro and in vivo[J].Virology，2015,479-480:221-233.

[10] Bose M,Mullick R,Das S,etal.Combination of neutralizing monoclonal antibodies against Hepatitis C virus E2 protein effectively blocks virus infection[J].Virus Res，2016,224:46-57.

[11] Johansson DX,Voisset C,Tarr AW,etal.Human combinatorial libraries yield rare antibodies that broadly neutralize hepatitis C virus[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2007,104(41):16269-16274.

[12] Sandomenico A,Leonardi A,Berisio R,etal.Generation and characterization of monoclonal antibodies against a cyclic variant of hepatitis C virus E2 epitope 412-422[J].J Virol，2016,90(7):3745-3759.

[13] Frietze KM,Peabody DS,Chackerian B.Engineering virus-like particles as vaccine platforms[J].Curr Opin Virol，2016,18:44-49.

[14] Kushnir N,Streatfield SJ,Yusibov V.Virus-like particles as a highly efficient vaccine platform:diversity of targets and production systems and advances in clinical development[J].Vaccine，2012,31(1):58-83.

[15] Liu J,Dai S,Wang M,etal.Virus like particle-based vaccines against emerging infectious disease viruses[J].Virol Sin，2016,31(4):279-287.

[16] Warfield KL,Bosio CM,Welcher BC,etal.Ebola virus-like particles protect from lethal Ebola virus infection[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2003,100(26):15889-15894.

[17] Cheong WS,Reiseger J,Turner SJ,etal.Chimeric virus-like particles for the delivery of an inserted conserved influenza A-specific CTL epitope[J].Antiviral Res，2009,81(2):113-122.

[18] 李學(xué)仁，陳 紅，王 文，等.三個(gè)HIV-1廣譜中和表位與HBV S抗原融合表達(dá)可誘導(dǎo)小鼠特異性抗體應(yīng)答[J].病毒學(xué)報(bào)，2008,24(4):260-267.

[19] Neafsey DE,Juraska M,Bedford T,etal.Genetic diversity and protective efficacy of the RTS,S/AS01 malaria vaccine[J].N Engl J Med，2015,373(21):2025-2037.

[20] Jeong SH,Qiao M,Nascimbeni M,etal.Immunization with hepatitis C virus-like particles induces humoral and cellular immune responses in nonhuman primates[J].J Virol，2004,78(13):6995-7003.

[21] Huret C,Desjardins D,Miyalou M,etal.Recombinant retrovirus-derived virus-like particle-based vaccines induce hepatitis C virus-specific cellular and neutralizing immune responses in mice[J].Vaccine，2013,31(11):1540-1547.

[22] Netter HJ,Woo WP,Tindle R,etal.Immunogenicity of recombinant HBsAg/HCV particles in mice pre-immunised with hepatitis B virus-specific vaccine[J].Vaccine，2003,21(21-22):2692-2697.

[23] Beaumont E,Patient R,Hourioux C,etal.Chimeric hepatitis B virus/hepatitis C virus envelope proteins elicit broadly neutralizing antibodies and constitute a potential bivalent prophylactic vaccine[J].Hepatology，2013,57(4):1303-1313.

[24] 王曉巖，張 海，舒 放，等.HCV中和抗原表位與HBV S抗原嵌合病毒樣顆粒誘導(dǎo)的中和抗體應(yīng)答及保護(hù)評(píng)價(jià)[J].免疫學(xué)雜志，2015,31(11):945-950.

[收稿2016-11-25 修回2017-01-19]

(編輯 倪 鵬)

Evaluation of neutralizing antibodies in serum immunized with virus-like particle chimerized HCV series of neutralizing epitopes

WANGXiao-Yan,ZHANGHai,LEIYing-Feng,LINFang,CUIYing,LIBin,ZHANGHui-Zhong,WEISan-Hua.

DepartmentofClinicalLaboratoryMedicine,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710038，China

Objective:New Zealand rabbits were immunized with VLPs-MEpS,VLPs-E2S,and the levels of neutralizing antibodies in serum were determined.Methods: New Zealand rabbits were immunized with 10 μg VLPs-MEpS and VLPs-E2S,serum was collected at diffferent time with a two-weeks interval.The neutralizing antibodies were determined by ELISA.HCV(type 1b) had been prepared and mixed with serum from immunized rabbit before infected Huh7.5 cell.The protection of neutralizing antibodies in serum was assessed.Results: Neutralizing antibodies had been induced in rabbit after immunized with VLPs-MEpS and VLPs-E2S.VLPs-MEpS group had higher titer of antibodies than that of VLPs-E2S group(P<0.05),both group had higher titer of antibodies than that of control groups significantly(P<0.01).VLPs-MEpS group had higher neutralization than that of VLPs-E2S group(P<0.05),the highest neutralization rate was 61.49%.Both groups were higher than control group notably(P<0.01).Conclusion: Protective neutralizing antibodies have been induced in New Zealand rabbit after immunized with VLPs-MEpS and VLPs-E2S.It′s the basement for development of neutralizing antibodies vaccine.

Hepatitis C virus(HCV);Epitope;Virus-like particle;Neutralizing antibody;Immunization

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.015

①本文為國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31370924， 31570933 )。

王曉巖(1989年-)，男，碩士，主要從事丙型肝炎病毒方面的研究，E-mail: wxywinter@163.com。

R373.21

A

1000-484X(2017)05-0707-06

②第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安710032。

③第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部微生物學(xué)教研室，西安710032。

④通訊作者，E-mail: sanhuawei3@163.com。