青藤堿抗肝癌作用機(jī)制研究

王高峰 張 強(qiáng) 張利娟

(黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，鄭州450063)

青藤堿抗肝癌作用機(jī)制研究

王高峰 張 強(qiáng) 張利娟

(黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，鄭州450063)

目的：探討青藤堿對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞株的增生和轉(zhuǎn)移能力的多靶向作用機(jī)制。方法：運(yùn)用噻唑藍(lán)還原法(MTT)來(lái)檢測(cè)青藤堿對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞株的抗增殖作用，而同時(shí)運(yùn)用Transwell 法來(lái)檢測(cè)藥物對(duì)于細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的作用變化；間接熒光標(biāo)記法測(cè)定經(jīng)過(guò)不同濃度的青藤堿作用后，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的變化；利用酶抑制動(dòng)力學(xué)方法，研究青藤堿對(duì)逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制作用；再通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和蛋白質(zhì)印跡的實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)HepG2細(xì)胞中凋亡蛋白水平的變化。結(jié)果：青藤堿對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞株具有抗侵襲及轉(zhuǎn)移的治療作用。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示青藤堿對(duì)于HepG2人肝癌細(xì)胞抗增殖作用明顯，半抑制濃度IC50為(15.35±2.43)μmol/L；而Transwell法的結(jié)果顯示青藤堿對(duì)癌細(xì)胞有較好的抗轉(zhuǎn)移能力；青藤堿是一種有效的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，IC50為(21.32±2.43)μmol/L；熒光標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平隨青藤堿呈濃度依賴(lài)性升高；蛋白水平測(cè)定顯示青藤堿上調(diào)HepG2人肝癌細(xì)胞CASP3、CASP9、CAV1和下調(diào)SOX2的表達(dá)。 結(jié)論：青藤堿可能是通過(guò)上調(diào)CASP3、CASP9、CAV1和下調(diào)SOX2的表達(dá)，進(jìn)而抑制人肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，最終在分子水平證明青藤堿對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的抑制作用。

青藤堿；HepG2人肝癌細(xì)胞；活性氧水平；逆轉(zhuǎn)錄酶；CASP3；CASP9；CAV1；SOX2

青藤堿(Sinomenine)是從防已科植物青藤的根莖中提取出來(lái)的一種生物堿單體，結(jié)構(gòu)類(lèi)似嗎啡，其藥用形式多為鹽酸鹽。目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道青藤堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎、免疫抑制、心腦血管保護(hù)等藥理作用，臨床已有相關(guān)制劑用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心律失常等[1]。近年來(lái)，隨著對(duì)青藤堿研究的深入，發(fā)現(xiàn)了一些新的藥理作用及機(jī)制，尤其是抗腫瘤方面的作用愈來(lái)愈受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視[2,3]。

傳統(tǒng)意義上的化療對(duì)肝癌的治療，雖然取得了一定的療效，但存在較大的毒副作用，特別是其潛在引起了腫瘤細(xì)胞的耐藥性以及引發(fā)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移[4]。因此尋找一種新型的毒副作用小，且能夠防止肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥物，是一項(xiàng)重要的研究課題。本研究重點(diǎn)在于探討青藤堿對(duì)于人肝癌細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。選用HepG2人肝癌細(xì)胞株，檢測(cè)青藤堿對(duì)人肝癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制率以及抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的效果。再通過(guò)mRNA的分子水平來(lái)檢測(cè)青藤堿對(duì)于凋亡相關(guān)基因以及轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)基因的表達(dá)影響。本實(shí)驗(yàn)為肝癌的治療提供了一種潛在的新藥物即青藤堿，并且在細(xì)胞體外，以及分子水平檢測(cè)其治療效果，為后續(xù)的臨床工作提供了可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 青藤堿購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)Sigma公司，純度大于98%，該凍干粉末已經(jīng)通過(guò)HPLC與質(zhì)譜檢測(cè)(圖1)。

1.1.2 細(xì)胞 HepG2人肝癌細(xì)胞株購(gòu)自ATCC(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物種保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)，在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行培養(yǎng)。將細(xì)胞置于恒溫37℃、5%CO2以及恒定濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到鋪單層達(dá)80%，使用0.25%胰蛋白酶(美國(guó)，Gibco)消化傳代至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需。

1.1.3 試劑 MTT試劑盒(美國(guó)Biosharp公司)；Transwell(孔徑為8.0 μm)小室濾膜(美國(guó)Corning公司)；細(xì)胞外基質(zhì)膠(美國(guó)，BD Bioscience)；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺、十二烷基硫酸鈉(美國(guó)Sigma公司)；過(guò)硫酸銨(上海阿拉丁試劑公司)；TritonX-100(上海時(shí)代生物科技有限公司)；2-巰基乙醇(上海阿拉丁試劑公司)；Tris base(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；RNA Mini試劑盒(美國(guó) PureLink 公司)；一步法RT-qPCR System試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)；β-actin鼠抗人單克隆抗體、CASP3、CASP9、CAV1；SOX2鼠抗人多克隆抗體；HRP標(biāo)記羊抗兔的多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)Biorad公司)等。

1.1.4 儀器 pHS-3C型酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；NUAIR-NU-5510E細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Nuaire公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)PE公司)；微量加樣器(法國(guó)Gilson公司)；RealPlex2 Thermal Cycler器 (美國(guó)Eppendorf公司)； 高壓電泳儀、VⅡ型垂直板電泳槽高壓電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；GWA-UN2超純水儀(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)等。

圖1 青藤堿的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of sinomenine

1.2 方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖[5]將細(xì)胞增殖處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2人肝癌細(xì)胞，使用胰蛋白酶消化后，培養(yǎng)基清洗獲得細(xì)胞懸浮液，接種于96孔培養(yǎng)板中。設(shè)空白對(duì)照組和青藤堿組。每組設(shè)4個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)孔。進(jìn)行4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在合適條件下進(jìn)行24 h細(xì)胞培養(yǎng)，根據(jù)MTT試劑盒說(shuō)明書(shū)以及酶標(biāo)儀檢測(cè)獲得每孔OD值數(shù)據(jù)，計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.2 Transwell 實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力 準(zhǔn)備Transwell小室的濾膜內(nèi)表面涂細(xì)胞外基質(zhì)膠(50 μg/室)。小室干燥后重新加入含有0.1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基水化(在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)需進(jìn)行外基質(zhì)膠的涂層和水化)。在Transwell小室的下室中加入新鮮10%胎牛血清培養(yǎng)基，而在上室中加入0.1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h 的重懸浮細(xì)胞(濃度為4.0 × 105ml-1)，每孔中加入100 μl細(xì)胞懸浮液。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)16 h。取出小室后，使用PBS溶液沖洗濾膜，使用PBS棉棒吸除和擦除上室的細(xì)胞，再根據(jù)Transwell小室使用說(shuō)明進(jìn)行染色觀察并計(jì)算穿膜的細(xì)胞數(shù)，從而反映各組細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS[6]將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞以1×105/孔接種于96孔板中，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的青藤堿培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照，每個(gè)藥物4個(gè)平行孔。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用PBS重新懸浮細(xì)胞，首先加入5 μl的FITC-Annexin V避光染色5 min，然后再加入10 μl的PI，在室溫下避光孵育15 min。取樣后，加入到流式細(xì)胞儀，進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)。

1.2.4 HepG2細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè) 參照張晨等[7]方法，對(duì)HepG2細(xì)胞中的逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行提取，將青藤堿100 μl加入到96 孔培養(yǎng)板中，并加入20 μl含逆轉(zhuǎn)錄酶的PBS溶液、70 μl的 RT Buffer，在37℃水浴1 h后，用洗液清洗3次，除去未結(jié)合的游離底物，再向每孔中加入100 μl BSA(1%)溶液，在室溫下進(jìn)行30 min的封閉，之后洗板，并再向每孔中加入50 μl的SA-ALP稀釋液，在37℃水浴 1 h后洗板，最后向每孔中加入底物 PNPP(1 mg/ml)50 μl。在405 nm波長(zhǎng)下，利用酶標(biāo)儀測(cè)OD值，計(jì)算酶的抑制率，抑制率=(空白對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值)/空白對(duì)照孔OD值×100%。

1.2.5 Westren blot實(shí)驗(yàn) 首先將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加入到陽(yáng)性組、空白對(duì)照組和青藤堿組培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2飽和濕度的環(huán)境下孵化24 h后棄培養(yǎng)基，加入1×SDS樣品緩沖液，在冰上刮落細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到Ep管中，煮沸樣品5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液；應(yīng)用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，收集裂解液至離心管中，在振蕩器上混勻4～15 min，14 000 r/min離心15 min(4℃)，棄沉淀，用Bradford法或其他蛋白質(zhì)測(cè)定方法測(cè)定上清中蛋白濃度以調(diào)整上樣體積和上樣量，以12%SD-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，電泳完畢后將膠浸于轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10 min，三明治用海綿3層濾紙膠膜裝配，每層放好后，用試管趕去氣泡，將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100 V，1 h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜。之后用25 ml TBS洗膜5 min，置于25 ml封閉緩沖液1 h，加入合適稀釋度的一抗[大鼠抗人GAPDH(1∶1 000)，CASP3(1∶1 000)，CASP9(1∶1 000)，Caveolin-1(1∶1 000)和SOX2(1∶1 000)多克隆抗體]，室溫孵化2 h，緩慢搖動(dòng)，TBS洗3次，加入堿性磷酸酶，室溫孵育1 h，TBS洗3次，一抗孵育NC膜， 4℃過(guò)夜；緩慢搖動(dòng)，TBS洗3次,加入堿性磷酸酶，室溫孵育1 h，TBS洗3次;一抗結(jié)合后洗脫，再進(jìn)行二抗孵育[HRP標(biāo)記兔抗大鼠的多克隆抗體(1∶10 000)]，以管家基因Bactin編碼蛋白水平作為內(nèi)對(duì)照；定量測(cè)定參照定量ELISA試劑盒說(shuō)明，酶標(biāo)儀進(jìn)行定量檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿抑制HepG2細(xì)胞體外增殖 青藤堿(0～150 μmol/L)作用HepG2細(xì)胞后，隨著青藤堿濃度的增加，青藤堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率在不斷地增強(qiáng)，并且隨著時(shí)間的增加，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也在不斷地增強(qiáng)，分別計(jì)算24、48和72 h 青藤堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的半抑制濃度IC50為(118.76±7.65)、(75.65±5.43)和(52.54±2.76)μmol/L，詳見(jiàn)圖2。

2.2 青藤堿對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 圖3顯示，利用流式細(xì)胞免疫熒光術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，結(jié)果如表1所示，經(jīng)過(guò)不同濃度青藤堿作用HepG2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平隨著青藤堿呈濃度依賴(lài)性升高，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 青藤堿抑制HepG2細(xì)胞體外侵襲和轉(zhuǎn)移 經(jīng)過(guò)Transwell小室法發(fā)現(xiàn)隨著青藤堿濃度的增加，處理后的人肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(shì)。不同濃度青藤堿組與空白對(duì)照組(生理鹽水空白組)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.4 青藤堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制作用 圖4顯示了青藤堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制作用，隨著青藤堿濃度的增加，逆轉(zhuǎn)錄酶的活性呈不斷下降的趨勢(shì)，直到青藤堿的濃度達(dá)到150 μmol/L后，逆轉(zhuǎn)錄酶的相對(duì)活性趨于平緩；解析IC50為(42.16±4.21)μmol/L，顯示出青藤堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶有良好的抑制效果。

圖2 青藤堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of sinomenine on growth of hepatocellular carcinoma HepG2 cells

圖3 青藤堿誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞ROS的產(chǎn)生Fig.3 Sinomenine induced HepG2 cells ROS

GroupsDose(μmol/L)Averagefluorescenceintensity(%)Controlgroup-1.12±0.17Sinomeninegroup106.67±0.511)2514.65±1.482)5027.59±2.662)7542.65±4.142)15065.34±5.762)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05,2)P<0.01.

GroupsDose(μmol/L)Invasionexperiment(Numberoftransme-mbranecells,×103)Transferexperiment(Numberoftransme-mbranecells,×103)Controlgroup-25.17±2.3238.43±3.43Sinomeninegroup1017.54±1.761)29.17±1.891)2510.56±0.871)22.67±1.221)504.23±0.542)15.76±0.982)751.57±0.132)10.98±0.562)1500.73±0.062)7.54±0.482)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05,2)P<0.01.

GroupsDose(μmol/L)Content(%)CASP3CASP9CAV1SOX2Controlgroup-1.02±0.041.01±0.051.04±0.050.99±0.07Sinomeninegroup101.43±0.171)1.26±0.141)1.22±0.121)0.91±0.041)251.76±0.211)1.45±0.151)1.32±0.191)0.84±0.031)502.02±0.251)1.76±0.211)1.46±0.151)0.75±0.041)752.35±0.271)1.94±0.331)1.61±0.161)0.62±0.071)1502.88±0.312)2.51±0.352)1.77±0.231)0.52±0.032)

Note：Compared with the control group，1)P<0.05,2)P<0.01.

圖4 青藤堿對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of sinomenine on reverse transcriptase of hepatocellular carcinoma cells HepG2

2.5 青藤堿在蛋白水平對(duì)CASP3、CASP9、CAV1和SOX2的表達(dá)影響 使用Western blot檢測(cè)青藤堿組和空白對(duì)照組CASP3、CASP9、CAV1和SOX2基因的蛋白表達(dá)水平(各組數(shù)據(jù)與內(nèi)參GAPDH的比值)。結(jié)果顯示青藤堿組中CASP3、CASP9和CAV1的蛋白表達(dá)量明顯高于空白對(duì)照組的相應(yīng)蛋白表達(dá)量(P<0.05)，而對(duì)于SOX2蛋白的表達(dá)，青藤堿組的蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

3 討論

肝癌具有高復(fù)發(fā)率、高轉(zhuǎn)移率且極容易產(chǎn)生對(duì)藥物的耐藥性，其常規(guī)治療方法包括化學(xué)藥物治療與放射治療結(jié)合，而化療藥物副作用極大，對(duì)于患者的免疫系統(tǒng)造成很大的損傷，特別是對(duì)脊髓的造血功能抑制，且易使癌細(xì)胞形成耐藥性。所以迫切需要尋找一種更為長(zhǎng)期有效以及副作用較小的藥物，作為新藥開(kāi)發(fā)的方向。最近幾年在中外各國(guó)對(duì)于腫瘤學(xué)的基礎(chǔ)研究中，證實(shí)了青藤堿對(duì)多種腫瘤癌細(xì)胞具有顯著的體外與體內(nèi)治療作用，其中不僅包括了對(duì)腫瘤的細(xì)胞增長(zhǎng)抑制，誘導(dǎo)凋亡以及對(duì)腫瘤的血管生長(zhǎng)抑制和腫瘤的轉(zhuǎn)移，多方面的功效研究證明了青藤堿的廣譜抗腫瘤效果[2,3,8-10]。

本實(shí)驗(yàn)在機(jī)理研究的過(guò)程中，體現(xiàn)了青藤堿的多靶點(diǎn)作用優(yōu)勢(shì)，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用MTT法檢測(cè)了青藤堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，且存在濃度和時(shí)間依賴(lài)性；為其藥效的持續(xù)作用提供了基礎(chǔ)。ROS是由細(xì)胞內(nèi)氧代謝過(guò)程中產(chǎn)生的具有很高生物活性的氧分子[11]。這些氧分子主要由超羥自由基(·OH)、氧陰離子自由基(O2-·)、過(guò)氧化氫(H2O2)和單線態(tài)氧(O2)等氧自由基組成[12]。在機(jī)體內(nèi)，這些氧分子能夠與自身的消化達(dá)到一種動(dòng)態(tài)平衡，這種動(dòng)態(tài)平衡一旦被打破，ROS則促進(jìn)細(xì)胞的快速凋亡[13,14]；多項(xiàng)研究表明CASP3與CASP9在腫瘤的凋亡通路中起到開(kāi)關(guān)作用[15-17]，而CAV1及SOX2則在人肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程中占重要地位[18]。細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白CASP3、CASP9的上調(diào)，表明了青藤堿體外抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖是通過(guò)引發(fā)細(xì)胞凋亡而引起。蛋白CAV1的上調(diào)和SOX2的下調(diào)則表明了青藤堿能夠在體外抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的過(guò)程[19]。通過(guò)以上分子學(xué)水平的檢測(cè)，青藤堿可能是通過(guò)上調(diào)CASP3、CASP9、CAV1和下調(diào)SOX2的表達(dá)，進(jìn)而抑制人卵巢癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。從而調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，最終在分子水平證明青藤堿對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞的抑制作用。

眾所周知，逆轉(zhuǎn)錄酶催化的反應(yīng)也叫反轉(zhuǎn)錄(Reverse transcription)。在這個(gè)過(guò)程中，肝癌HepG2細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄酶可以催化逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程的發(fā)生，即催化脫氧核糖核苷酸以RNA為模板合成DNA，之后形成一代又一代的DNA，之后人肝癌HepG2細(xì)胞雙鏈DNA進(jìn)行環(huán)化，最終完成人肝癌HepG2細(xì)胞中DNA的復(fù)制[7]，所以基于逆轉(zhuǎn)錄酶的作用機(jī)制，我們以逆轉(zhuǎn)錄酶為作用靶點(diǎn)，進(jìn)行抗肝癌藥物研發(fā)具有重要意義。本文研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄酶活性有一定的抑制作用，這意味著青藤堿可能通過(guò)阻斷肝癌HepG2細(xì)胞中DNA的復(fù)制，達(dá)到抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的目的，為青藤堿的多靶點(diǎn)性抗肝癌活性提供了理論基礎(chǔ)，也為青藤堿應(yīng)用于臨床肝癌治療提供了基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其將作為一種新型抗肝癌的化療藥物被進(jìn)一步論證和研究。

[1] 路占忠, 李振彬, 馬 旭, 等. 采用正交t值法優(yōu)選治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的中藥有效成分復(fù)方配伍[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2016,28(11):33-36.

[2] Lv Y，Li C，Li S，etal.Sinomenine inhibits proliferation of SGC-7901 gastric adenocarcinoma cells via suppression of cyclooxygen-ase-2 expression[J].Oncol Lett,2011,2(4):741-745.

[3] Liao F,Yang Z,Lu X,etal.Sinomenine sensitizes gastric cancer cells to 5-fluorouracil in vitro and in vivo[J].Oncol Lett,2013,6(6):1604-1610.

[4] 劉永存,伍麗萍.STK Ⅱ在肝癌組織中的表達(dá)水平分析及臨床意義[J].空軍醫(yī)學(xué)雜志,2016,32(5):319-322.

[5] Fabrizio A,Alice F.Liposomes and MTT cell viability assay:An incompatible affair[J].Toxicol Vitro,2015,29(2):314-319.

[6] 劉 欣,索智敏.苦參抗乙肝病毒的作用機(jī)制研究[J].中國(guó)生化藥物雜志,2015,35(4):67-69.

[7] 張 晨.大黃酸聯(lián)合賀普丁對(duì)乙肝病毒逆轉(zhuǎn)錄酶影響[J] 中國(guó)公共衛(wèi)生,2015,31(6):781-783.

[8] Lu XL,Zeng J,Chen YL,etal.Sinomenine hydrochloride inhibits human hepatocellular carcinoma cell growth in vitro and in vivo:involvement of cell cycle arrest and apoptosis induction[J].Int J Oncol,2013,42(1):229-238.

[9] Jiang T,Zhou L,Zhang W,etal.Effects of sinomenine on proliferation and apoptosis in human lung cancer cell line NCI-H460 in vitro[J].Mol Med Rep,2010,3(1):51-56.

[10] Hong Y,Yang J,Shen X,etal.Sinomenine hydrochloride enhancement of the inhibitory effects of anti-transferrin receptor antibody-dependent on the COX-2 pathway in human hepatoma cells[J].Cancer Immunol Immunother,2013,62(3):447-454.

[11] 劉 儀,王 凱,王介非.氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制[J].中華臨床感染病雜志,2008,1(3):123-126.

[12] Shoeb M,Khan JA,Khan W,etal.ROS-dependent anticandidal activity of zinc oxide nanoparticles synthesized by using egg albumen as a biotemplate[J].ANSN,2013,4(3):35015-35026.

[13] Sepúlveda M,Gonano LA,Back TG,etal.Role of CaMKII and ROS in rapid pacing-induced apoptosis[J].J Mol Cell Card,2013,63(1):135-145.

[14] Pan X,Zhang X,Sun H,etal.Autophagy inhibition promotes 5-fluorouraci-induced apoptosis by stimulating ROS formation in human non-small cell lung cancer A549 cells[J].PLoS One,2013,8(2):55674-56679.

[15] Kuo CT，Hsu MJ，Chen BC，etal.Denbinobin induces apoptosis in human lung adenocarcinoma cells via Akt inactivation,Bad activation,and mitochondrial dysfunction[J].Toxicol Lett,2008,177(1):48-58

[16] Yang KC，Uen YH，Suk FM，etal.Molecular mechanisms of denbinobin-induced anti-tumorigenesis effect in colon cancer cells[J].World J Gastroenterol,2005,11(20):3040-3045.

[17] Song JI，Kang YJ，Yong HY，etal.Denbinobin，a phenanthrene from dendrobium nobile,inhibits invasion and induces apoptosis in SNU-484 human gastric cancer cells[J].Oncol Rep,2012,27(3):813-818.

[18] 胡 軍,邵淑娟,董 巖,等.Caveolin-1與人卵巢癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性及其機(jī)制的研究[J].解剖科學(xué)進(jìn)展，2010,16(4):311-316.

[19] Belotte J,Fletcher NM,Alexis M,etal.Sox2 gene amplification significantly impacts overall survival in serous epithelial ovarian cancer[J].Reprod Sci,2015,22(1):38-46.

[收稿2016-09-28 修回2016-12-13]

(編輯 倪 鵬)

Study on anti-tumor mechanism of sinomenine

WANGGao-Feng,ZHANGQiang,ZHANGLi-Juan.

ExperimentalCenterofMedicalCollege,HuangheUniversityofScienceandTechnology,Zhengzhou450063,China

Objective:To investigate the anti-proliferation and anti-metastasis effects and study the molecular mechanism of sinomenine in cell line(HepG2).Methods: HepG2 cells were cultured together with different treatment concentrations of sinomen-ine.The effect of sinomenine on inhibition of growth of HepG2 cells were determined by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay.The effect of sinomenine on inhibiting metastasis of HepG2 cells were determined by Transwell assay.The inhibitory effect of sinomenine on reverse transcriptase(RT) was studied using inhibitory kinetic method,on the basis,the reactive oxygen species(ROS) of HepG2 cells was monitored by indirect fluorescent labeling.The protein expressions of CASP3,CASP9,CAV1 and SOX2 were analyzed by Western blot experiment.Results: Sinomenine inhibited the proliferation and metastasis of HepG2 cells significantly.Sinomenine had a good inhibitory effect on the growth of HepG2 cells,half inhibitory concentration(IC50) was (15.35±2.43)μmol/L.Sinomenine was RT inhibitor，IC50 was (21.32±2.43)μmol/L.The Western blot showed that CASP3,CASP9 and CAV1 were up-regulated and SOX2 was down-regulated by the sinomenine treatment in HepG2 cells.Conclusion: The potential molecular mechanism of sinomenine suppresses proliferation and metastasis of HepG2 cells by up-regulation of CASP3,CASP9,CAV1 and down-regulation of SOX2.

Sinomenine;HepG2 cells;Reactive oxygen species;Reverse transcriptase；CASP3;CASP9;CAV1;SOX2

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.011

王高峰(1975年-)，女，碩士，實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥學(xué)藥劑學(xué)方面研究。

R453.9

A

1000-484X(2017)05-0688-05