長島型掌跖角化?。篠ERPINB7基因突變位點(diǎn)研究

戴珊，南栩，趙紅珊，宋清華，張春雷

（1.北京大學(xué)第三醫(yī)院，北京100191；2.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系，北京100083）

·論著·

長島型掌跖角化?。篠ERPINB7基因突變位點(diǎn)研究

戴珊1，南栩2，趙紅珊2，宋清華1，張春雷1

（1.北京大學(xué)第三醫(yī)院，北京100191；2.北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)系，北京100083）

目的報(bào)道2例長島型掌跖角化病，確定其致病基因突變。方法收集患者及其中1例母親外周血和臨床資料，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增SERPINB7基因8個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序以查找基因突變位點(diǎn)。結(jié)果2例患者均存在SERPINB7基因c.796C>T雜合突變伴c.455G>T雜合突變，前者可導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)第266位氨基酸出現(xiàn)終止改變（p.R266*），后者可導(dǎo)致第6外顯子第1個(gè)核苷酸發(fā)生改變，使得該外顯子的剪接受體位點(diǎn)消失。例1患者母親為c.455G>T雜合突變而不伴另一突變。正常對(duì)照未見這2種突變。結(jié)論SERPINB7基因的c.796C>T和c.455G>T突變是引起2例患者長島型掌跖角化病的原因。

長島型掌跖角化?。换?；SERPINB7；突變

掌跖角化?。≒almoplantar keratoderma,PPK）是一組以掌跖皮膚過度角化和增厚為主要特征的遺傳性疾病。根據(jù)形態(tài)學(xué)和遺傳特性可以分為4類：彌漫性，局灶性，條紋狀和點(diǎn)狀[1]。長島型掌跖角化病（Nagashima-type palmoplantar keratosis,NPPK, OMIM 615598）屬于彌漫性非殘毀性掌跖角化病，是一種常染色體隱性遺傳病，表現(xiàn)為皮膚紅斑基礎(chǔ)上輕度角化。Kubo等[2]于2013年將NPPK的致病基因確定在編碼絲氨酸蛋白酶抑制因子B亞型7的SERPINB7基因上。目前已報(bào)道的NPPK患者主要來自日本，中國及韓國等其他東亞國家僅有數(shù)十例病人被報(bào)道。筆者在臨床上收集到2例中國NPPK患者，并檢測其SERPINB7基因突變情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料例1患者為散發(fā)病例，男，17歲，出生后數(shù)月掌跖部位即出現(xiàn)紅斑、脫屑，并逐漸加重?cái)U(kuò)展，累及手、足背部，腕部及足踝。至青春期后手足出現(xiàn)輕度異味，遇水后發(fā)白，伴手足多汗。例2患者男，有家族史，26歲，約2歲時(shí)出現(xiàn)掌跖部皮膚潮紅、角化，后出現(xiàn)皮膚增厚、脫屑，逐漸加重并進(jìn)展至手、足背部，高中時(shí)手足出現(xiàn)異味，無明顯手、足多汗。體格檢查：例1患者雙手掌、足底、手足背邊緣、指趾背側(cè)面、手腕內(nèi)側(cè)有彌漫性紅斑伴角化及脫屑，皮膚輕度增厚，角質(zhì)層略呈淡黃色，見圖1a。同時(shí)伴有足踝及跟腱處受累，見圖1b。手足部分區(qū)域因多汗出現(xiàn)浸漬發(fā)白。例2患者雙手掌、指趾背側(cè)面、手腕內(nèi)側(cè)及足底彌漫性紅斑，皮膚角化增厚較例1患者更明顯，見圖1c。手足部數(shù)個(gè)指甲及趾甲增厚、粗糙，遠(yuǎn)端變脆、分離。例1患者手足皮膚，指甲及趾甲真菌鏡檢均呈陰性，例2患者趾甲真菌鏡檢陽性。2例患者均未見毛發(fā)或牙齒異常。既往未規(guī)律用藥治療。體健，否認(rèn)其他器官系統(tǒng)病史。否認(rèn)父母近親婚育史。例2患者述其母親，大姨及外婆有類似病史，見圖2。

圖1 患者皮損表現(xiàn)

圖2 例2患者家系圖，坭為先證者

取2例患者手掌皮膚行組織病理學(xué)檢查，均表現(xiàn)為表皮高度角化，棘層及顆粒層肥厚，真皮淺層輕度淋巴細(xì)胞浸潤，見圖3。

圖3 皮損組織病理圖（HE染色×100）

1.2 外周血DNA提取本研究經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬簽署知情同意書。由于例2患者家屬在外地拒絕參加本實(shí)驗(yàn)，故取例1患者及其母親和例2患者外周血各5 mL，EDTA二鈉抗凝，用試劑盒提取基因組DNA。

1.3 突變基因的引物合成，PCR擴(kuò)增及測序分析

1.3.2 PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為50μL，模版DNA 1 μL，dNTPs 4 μL，上下游引物各2 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，PCR Buffer（Mg2+Plus）5 μL。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 PCR產(chǎn)物測序分析所有PCR產(chǎn)物純化后送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序，測序方法為Sanger雙脫氧鏈終止法（Sanger法）。測序結(jié)果采用Chromas軟件與SERPINB7基因組序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

以患者的基因組DNA為模板，所有引物的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳均可見目標(biāo)條帶，產(chǎn)物切膠純化后測序，結(jié)果清晰無雜峰干擾。將所測得的序列與Ensembl數(shù)據(jù)庫（http://www.ensembl.org/index. html）公布的正常序列進(jìn)行對(duì)比，得到如下結(jié)果：2例患者SERPINB7第8外顯子中第796位核苷酸（從cDNA編碼起始位點(diǎn)ATG算起）發(fā)生C→T雜合突變（c.796C>T）（dbSNP:rs142859678），導(dǎo)致其編碼蛋白質(zhì)在第266位氨基酸出現(xiàn)終止改變(p. R266*)。第6外顯子中第455位核苷酸發(fā)生G→T雜合突變(c.455G>T)（dbSNP:rs202182550）。例1患者母親為c.455G>T雜合突變攜帶者，而無c.796C> T突變。所有突變均由反向測序得到驗(yàn)證。同時(shí)在6例無親緣關(guān)系的正常人中進(jìn)行此基因直接測序，未發(fā)現(xiàn)上述突變，見圖4。

3 討論

NPPK于1977年首先被日本學(xué)者描述,當(dāng)時(shí)被認(rèn)為是Mal de Meleda掌跖角化病一種較輕的臨床亞型。隨著研究的深入和報(bào)道病例的增多，目前認(rèn)為是新的獨(dú)立的疾病類型。通常表現(xiàn)為出生時(shí)至3歲以內(nèi)出現(xiàn)掌跖部位彌漫性界清紅斑，伴有輕度至中度角化，常累及手足背部，面積通常不超過手足背的一半。腕內(nèi)側(cè)、踝和跟腱也是好發(fā)部位，肘膝部也可受累。遇水后角化皮膚可出現(xiàn)發(fā)白改變[2-4]。皮疹穩(wěn)定,不隨年齡增長出現(xiàn)明顯進(jìn)展或加重?；颊叱０橛惺终坪妥愕锥嗪?易伴發(fā)皮膚淺表真菌感染。組織病理無特異性，表現(xiàn)為表皮角化過度伴角化不全，棘層肥厚，真皮無明顯炎癥反應(yīng)?；颊咭话闱闆r良好，無毛發(fā)、甲、牙齒等其他外胚層受累表現(xiàn)，也無其他器官系統(tǒng)受累表現(xiàn)。

a：患者SERPINB7基因c.796C>T雜合突變；b：2例患者和例1患者母親SERPINB7基因c.455G>T雜合突變；c：例1患者母親未發(fā)現(xiàn)c.796C>T突變；d：正常對(duì)照未發(fā)現(xiàn)c.796C>T和c.455G>T突變。圖4SERPINB7基因突變測序圖(箭頭指示突變位點(diǎn))

NPPK需要與Mal de Meleda掌跖角化病、Bothnia型掌跖角化病、進(jìn)行性對(duì)稱性紅斑角化癥等鑒別。Mal de Meleda掌跖角化病相對(duì)好發(fā)于克羅地亞的梅勒達(dá)島，人群中的發(fā)病率是1/100 000。該病是彌漫性掌跖角化病中較嚴(yán)重同時(shí)伴侵襲性的類型，同樣為常染色體隱性遺傳，但其掌跖角化為進(jìn)展性，隨年齡增長逐漸加重，且角化通常更為嚴(yán)重，可累及整個(gè)手足背，多伴有甲受累及口周、肛周的紅斑角化，可出現(xiàn)自發(fā)性斷指（趾）和屈曲攣縮[5]；Bothnia型掌跖角化病為常染色體顯性遺傳，好發(fā)于瑞典波的尼亞灣的西部和西北部。盡管臨床表現(xiàn)與NPPK較為類似，但是Bothnia掌跖角化可累及至手足背一半的面積，通常多汗更為嚴(yán)重，不累及除手足外的其他部位?？砂橛休p度甲改變，而且遇水后角質(zhì)發(fā)白及腫脹更迅速且更明顯[6-7]。進(jìn)行性對(duì)稱性紅斑角化癥是一種常染色體顯性遺傳病,皮損常先對(duì)稱性發(fā)生于掌跖部位，后漸擴(kuò)展至身體其他部位如手足背、脛前及四肢連接處伸側(cè)面，隨著年齡等增長皮損逐漸加重。中國漢族人群少見，目前尚未確定其致病基因。其他需要鑒別的疾病還包括表皮松解性和非表皮松解性彌漫性掌跖角化病。這2種病為常染色體顯性遺傳，臨床表現(xiàn)相同，為掌跖部位彌漫角化，皮損在手腕處邊界清晰，無累及伸側(cè)皮膚的傾向。角化程度嚴(yán)重，表現(xiàn)為黃色疣狀斑塊，?？梢蚱つw彈性消失而發(fā)生皸裂和疼痛，造成手足活動(dòng)困難，可同時(shí)合并指尖部收縮，指節(jié)墊及厚甲。病理表現(xiàn)前者為表皮松解性角化過度，后者為非特異性改變。

Kubo等[2]對(duì)3例無關(guān)日本NPPK患者進(jìn)行全外顯子組測序分析，確定NPPK的致病基因?yàn)镾ERPINB7基因。通過Sanger測序，進(jìn)一步分析另外10例無關(guān)NPPK患者的SERPINB7基因外顯子序列，最終發(fā)現(xiàn)這13例患者中6例患者存在SERPINB7的c.796C>T純合突變，另外7例患者為c.796C>T雜合突變伴其他功能缺失性雜合突變。該作者通過千人基因組數(shù)據(jù)庫（1 000 Genomes Project）中SERPINB7基因突變位點(diǎn)的分布情況分析，發(fā)現(xiàn)c.796C>T（rs142859678）雜合突變?cè)谌毡竞椭袊恼Ｈ巳褐袛y帶頻率分別為2/89和6/197，然而該突變位點(diǎn)未見于千人基因組數(shù)據(jù)庫中歐洲及其他非洲裔的正常人群。因此推斷，NPPK可能主要流行于亞洲，特別是日本和中國。目前已經(jīng)報(bào)道了40余例病例，其中大部分來自日本。國內(nèi)報(bào)道了16例基因確診病例[8-9]，3例疑似病例[9]，On等[10]報(bào)道了3例韓國病例。所有已知病例中除1例外其他均為c. 796C>T純合突變或合并其他功能缺失性雜合突變。已經(jīng)證實(shí)該突變存在祖先效應(yīng)（Founder effect）。目前，共發(fā)現(xiàn)了9種其他類型的突變，包括無義，移碼，剪接點(diǎn)和錯(cuò)義突變等[2,4,8,11-12]。

本研究中2例NPPK患者均為SERPINB7基因c.796C>T雜合突變合并c.455G>T雜合突變所致。通過千人基因組數(shù)據(jù)庫中SERPINB7基因突變位點(diǎn)的分布情況分析，發(fā)現(xiàn)c.455G>T（rs202182550）雜合突變?cè)谥袊鴿h族人群中攜帶頻率為1/197，略低于c.796C>T，提示這一突變可能具有潛在的祖先效應(yīng)[13]。然而，目前報(bào)道的合并c.455G>T雜合突變的病例稀少，僅有3例。因此，筆者發(fā)現(xiàn)的這2例患者為上述推測提供了進(jìn)一步的證據(jù)。

將本市中醫(yī)肝膽醫(yī)院2014年5月~2017年6月收治的心血管疾病患者87例分為觀察組和對(duì)照組,其中觀察組44例,男女比例為25:19,年齡46~75歲,平均年齡(58.4±3.3)歲,病程3個(gè)月~18年,平均病程(9.7±1.5)年;對(duì)照組43例男女比例為23:20,年齡48~72歲,平均年齡(57.2±3.1)歲,病程5個(gè)月~17年,平均病程(8.7±1.9)年,對(duì)比兩組患者年齡、性別等一般資料(P>0.05)。

SERPINB7基因位于18q21.3，編碼絲氨酸蛋白酶抑制因子B亞型7，具有抑制絲氨酸蛋白酶的作用。SERPINB7功能的缺失可能導(dǎo)致NPPK皮損處蛋白酶活性過強(qiáng)[2]。SERPINB7分布于全身表皮，主要表達(dá)于顆粒層及角質(zhì)層上部[14]，但是NPPK主要發(fā)生于手掌，足底，肘膝等部位，提示NPPK的發(fā)病可能與慢性機(jī)械壓力有關(guān)。因此，SERPINB7可能抑制機(jī)械壓力誘導(dǎo)的蛋白酶，保護(hù)角質(zhì)形成細(xì)胞免于蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[10]。SERPINB7的活性位點(diǎn)環(huán)（Reactive site loop,RSL）位于第331~352位氨基酸，保持該功能區(qū)的完整性是維持其活性的基本條件。所有目前已知的突變均會(huì)導(dǎo)致該活性位點(diǎn)環(huán)的截?cái)?造成NPPK患者表皮內(nèi)顆粒層和角質(zhì)層SERPINB7蛋白酶活性抑制作用喪失，表皮內(nèi)SERPINB7減少，不能有效抑制絲氨酸蛋白酶活性，導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白降解，角質(zhì)層屏障功能破壞。水分滲透加速，經(jīng)表皮水分丟失（TEWL）值較正常皮膚升高，從而引發(fā)諸如皮膚腫脹發(fā)白等一系列臨床表現(xiàn)[2]。既往研究的免疫組化結(jié)果提示NPPK皮損處SERPINB7表達(dá)顯著降低，而影響表皮分化的蛋白如兜甲蛋白，絲聚蛋白的表達(dá)則不受影響，提示NPPK患處皮膚并無明顯的角質(zhì)形成細(xì)胞分化障礙[2]。其針對(duì)的目標(biāo)蛋白酶和具體致病機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

NPPK目前仍缺乏國際公認(rèn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)，需要結(jié)合患者病史，臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查綜合診斷，并通過基因檢測最終明確診斷。盡管被認(rèn)為可能是日本和我國最常見的掌跖角化病類型，但是作為較新被確認(rèn)的一種疾病，目前國內(nèi)對(duì)其認(rèn)識(shí)仍然不足，診斷的病例屈指可數(shù)。筆者報(bào)道的這2例患者病史及臨床表現(xiàn)典型，并最終通過基因檢測確診。且這2例患者的突變類型均不同于以往最常被報(bào)道的類型。進(jìn)一步提示除了最常見的c.796C>T外，c.455G>T這一突變位點(diǎn)也可能具有祖先效應(yīng)，為SERPINB7的功能研究提供了新的思路。

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Nagashima-type Palmoplantar Keratoderma:Mutation Analysis of the SERPINB7 Gene

Dai Shan1,Nan Xu2,Zhao Hongshan2,Song Qinghua1,Zhang Chunlei1
1.Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China;2.Department of Medical Genetics,Peking University Health Science Center,Beijing 100083,China

ObjectiveIn order to report two cases of Nagashima-type palmoplantar keratoderma（NPPK）,and to identify mutations in the SERPINB7 gene.MethodsClinical data were collected from two patients with NPPK and one patient's mother.Peripheral blood samples were obtained from the two patients and one patient's mother.Genomic DNA was extracted from these blood samples.PCR was performed to amplify 8 exons and their flanking sequences of the SERPINB7 gene followed by DNA sequencing.ResultsHeterozygous mutation c.796C>T and c.455G>T were found in both of the two patients.The former one led to the formation of a premature termination codon at amino acid position 266（p.R266*）and the later one caused the change in the first nucleotide of exon 6,leading to an elimination of acceptor-splicing site of this exon.The healthy mother of patient one was a heterozygous carrier of the mutation c.455G>T.However,the two mutations were not found in normal controls.ConclusionThe mutation c.796C>T and c.455G>T in the SERPINB7 gene are responsible for NPPK in the two patients.

Nagashima-type palmoplantar keratosis;Gene;SERPINB7;Mutation

R758.5+3

A

1672－0709（2017）02-0108－05

2016-12-03）

宋清華，E-mail:songqinghua169@163.com