GM1對(duì)腦出血大鼠LINGO-1表達(dá)的影響

梁順利 張榮博* 吳憂 章水晶 徐彬

GM1對(duì)腦出血大鼠LINGO-1表達(dá)的影響

梁順利 張榮博* 吳憂 章水晶 徐彬

目的觀察腦出血后LINGO-1表達(dá)的變化，探討GM1對(duì)腦出血后LINGO-1表達(dá)的影響。方法將72只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和GM1治療組，選取造模后1d、3d、7d和14d為觀察點(diǎn)。制備腦出血模型，Longa評(píng)分法評(píng)價(jià)神經(jīng)功能缺損程度，RT-PCR法檢測(cè)LINGO-1 mRNA的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)LINGO-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果模型組Longa 評(píng)分7d最高，14d出現(xiàn)下降；LONG-1 mRNA 3d表達(dá)最高，7~14d出現(xiàn)下降；LONG-1蛋白7d到達(dá)高峰，14d出現(xiàn)下降。GM1治療組在14d Longa評(píng)分較模型組下降（P<0.05）；在7d和14d LINGO-1mRNA表達(dá)較模型組下降（P<0.05）；在14d LINGO-1蛋白表達(dá)較模型組下降（P<0.05）。結(jié)論腦出血后LINGO-1表達(dá)明顯上調(diào)，呈先上升后下降的變化規(guī)律。GM1可以降低LINGO-1 mRNA和蛋白的表達(dá)及神經(jīng)功能評(píng)分，這可能是GM1促進(jìn)腦出血后神經(jīng)功能恢復(fù)的機(jī)制之一。

LINGO-1 腦出血 神經(jīng)節(jié)苷脂 神經(jīng)再生

【Absract】 ObjectiveTo explore the effect of monosialotetrahexosy1 ganglioside on expressions of LINGO-1 in rats with intracerebral hemorrhage（ICH）.Methods72 SD rats were randomly divided into sham operation group，model group and monosialotetrahexosy1 ganglioside group. Observation was made at 1，3，7，14d after ICH. Neurological functional recovery was evaluated by Longa's score；RT-PCR and Western blot were applied to detect the changes in the expressions of LINGO-1 mRNA and protein.ResultsLonga's score and LINGO-1 protein were decreased at 14d after ICH in monosialotetrahexosy1 ganglioside group compared with those in model group（P<0.05）. The LINGO-1 mRNA was decreased at 7d and 14d after ICH in monosialotetrahexosy1 ganglioside group compared with model group（P<0.05）.Conclusions The decreased expressions of LINGO-1 and neurological score induced by monosialotetrahexosy1 ganglioside may be one of the mechanisms of neural function recovery after ICH.【Key words】LINGO-1 Intracerebral hemorrhage Monosialotetrahexosy1 ganglioside Nerve regeneration

腦出血（Intracerebral hemorrhage，ICH）是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，最終導(dǎo)致持久的功能損害，其原因?yàn)橹袠猩窠?jīng)損傷后再生能力的缺乏。近年研究發(fā)現(xiàn)勿動(dòng)蛋白（Nogo）與神經(jīng)再生障礙有關(guān)，抑制Nogo或受體復(fù)合物可以促進(jìn)軸突的生長(zhǎng)［1］。賴氨酸重復(fù)序列和免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域（Leucine rich repeat and Ig domain containing1，Lingo-1）是Nogo受體復(fù)合物中的一種重要的跨膜蛋白，負(fù)向調(diào)節(jié)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，軸突再生，髓鞘形成和神經(jīng)元存活［2］。研究表明抑制LINGO-1的表達(dá)能延長(zhǎng)神經(jīng)軸突和改善神經(jīng)功能。單唾液酸四己糖經(jīng)節(jié)苷脂（Monosialotetra -hexosy1 ganglioside，GM1）是一種具有神經(jīng)損傷修復(fù)作用的糖鞘脂，在急性神經(jīng)損傷的研究中GM1能促進(jìn)神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)［3］，但GM1對(duì)ICH后LINGO-1的表達(dá)研究較少。本研究觀察GM1對(duì)ICH后LINGO-1表達(dá)的影響，旨在探討LINGO-1在ICH中的可能作用及GM1對(duì)ICH的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 清潔級(jí)雄性成年SD大鼠72只，體重180~220g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。隨機(jī)分為3組，即假手術(shù)組（n=24）、模型組（n=24）和GM1治療組（n=24）。每組分為術(shù)后1d、3d、7d和14d四個(gè)小組，每小組各6只。

1.2 大鼠腦出血模型制備 參照Yang等［4］報(bào)道的方法：術(shù)前4 h禁食不禁水，稱重后用10%水合氯醛按350mg/kg腹腔麻醉，俯仰立體定向儀上并同時(shí)固定，用微量注射器從大鼠近尾段的尾動(dòng)脈抽取50μl新鮮不凝血，在立體定向儀引導(dǎo)下按20μl/min的速度緩慢勻速注入左側(cè)尾狀核（前囟前0.2mm，左側(cè)中線旁開(kāi)3mm，深度5mm）。注血結(jié)束后留針15min等血液凝固后緩慢拔針，保溫至蘇醒后分籠喂養(yǎng)。假手術(shù)組在相同部位緩慢注入50μl生理鹽水，其余步驟同上。治療組造模成功后腹腔注射GMI，每只大鼠每天30mg/（kg·d），連用14d；模型組每只大鼠腹腔注射生理鹽水30mg/（kg·d）；假手術(shù)組術(shù)后不做任何處理。

1.3 LINGO-1 mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法檢測(cè)：腦組織取自出血灶周，所得RNA用紫外線分光光度計(jì)定量測(cè)量RNA濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：反應(yīng)體積10μl，37℃孵育15min，85℃，5s終止反應(yīng)，滅活反轉(zhuǎn)錄酶。引物序列如下：LINGO-1 引物序列為上游5-GCCACCTGGTCTATCT CCGTTTC-3'，下游5-GCAGGTAATTGAGCCCACGAAA G-3'（162 bp）。內(nèi)參ACTIN 上游5'-CG TTGACATCCGTAAAGACCTC-3'，下游5'-TAGGAGC CAGGGCAGTAATCT -3'（110 bp），均由武漢谷歌生物有限公司設(shè)計(jì)合成。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3min，進(jìn)入循環(huán)94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。RT-PCR 產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電泳條帶用美國(guó)Quantity-one凝膠圖像處理系統(tǒng)分析，計(jì)算目的條帶和內(nèi)參照吸光度比值。

1.4 LINGO-1蛋白檢測(cè) 采用Western blot法檢測(cè)：出血灶周腦組織在PBS中勻漿，離心，加入裂解液后置于冰上不斷攪拌，后于4℃離心8min，上清液用3倍緩沖液稀釋，100℃煮5min制樣，用于SDS-PAGE。將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用1% 酪蛋白封閉液封閉膜1h，在0.5%封閉液稀釋的一抗中4℃過(guò)夜。洗膜后在HRP標(biāo)記的二抗搖床孵育2h，漂洗后在化學(xué)發(fā)光溶液中顯色，用ChemiDoc XPS 系統(tǒng)掃描，用Image Lab 4.0圖像軟件測(cè)量LINGO-1蛋白和β-actin蛋白各顯色條帶的平均光密度比值。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分 參考 Longa等［5］評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：在造模成功后1d、3d、7d、14d分別對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)缺損癥狀。1分：提尾懸空時(shí)對(duì)側(cè)前肢呈屈曲，不能完全伸展。2分：行走時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈。3分：站立時(shí)向?qū)?cè)傾倒。4分：不能自行行走，意識(shí)下降。0分和4分大鼠不納入實(shí)驗(yàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析，組間比較方差齊者用LSD法，GM1治療組各時(shí)間點(diǎn)對(duì)LINGO-1蛋白表達(dá)與Longa評(píng)分進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，用r值表示相關(guān)系數(shù)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能Longa評(píng)分 假手術(shù)組Longa評(píng)分均低，各時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；模型組與假手術(shù)組比較，各時(shí)間點(diǎn)Longa評(píng)分均增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且7d時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量最高，14d出現(xiàn)下降；GM1治療組與模型組比較，在1d、3d、7d時(shí)間點(diǎn)，Longa評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在14d時(shí)間點(diǎn)，Longa評(píng)分下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示14d GM1治療組較模型組神經(jīng)功能恢復(fù)程度較好。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能Longa評(píng)分比較［分，（x±s）］

2.2 LINGO-1 mRNA 表達(dá)變化 假手術(shù)組LINGO-1 mRNA僅少量表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；模型組1d、3d、7d及14d LINGO-1 mRNA表達(dá)與假手術(shù)組比較均明顯升高（P<0.05），3d時(shí)間點(diǎn)表達(dá)最高，7~14d 表達(dá)呈下降趨勢(shì)；GM1治療組LINGO-1 mRNA表達(dá)，在1d和3d時(shí)間點(diǎn)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在7d和14d 時(shí)間點(diǎn)較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠LINGO-1 mRNA表達(dá)比較（x±s）

2.3 LINGO-1蛋白表達(dá)變化 假手術(shù)組LINGO-1蛋白表達(dá)量少，各時(shí)間點(diǎn)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；模型組1d、3d、7d及14d LINGO-1蛋白表達(dá)與假手術(shù)組比較均明顯升高（P<0.05），且在7d達(dá)高峰，14d出現(xiàn)下降；GM1治療組LINGO-1蛋白表達(dá)，在1d和3d時(shí)間點(diǎn)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），在7d和14d 時(shí)間點(diǎn)較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠LINGO-1 蛋白表達(dá)比較（x±s）

2.4 Pearson相關(guān)性分析 GM1治療組LINGO-1蛋白表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)與神經(jīng)功能Longa評(píng)分進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示0

3 討論

ICH是常見(jiàn)腦血管疾病，中樞系統(tǒng)損傷導(dǎo)致神經(jīng)軸突不能再生，最終神經(jīng)功能障礙遺留后遺癥。而神經(jīng)軸突的再生與髓鞘相關(guān)抑制因子有關(guān)。研究表明［6］：髓鞘相關(guān)抑制因子與勿動(dòng)蛋白受體（Nogo receptor，NgR）復(fù)合物相結(jié)合，激活RhoA激酶，使細(xì)胞骨架發(fā)生動(dòng)力學(xué)改變，進(jìn)而引起神經(jīng)軸突的生長(zhǎng)錐潰變，從而抑制軸突再生和延長(zhǎng)。進(jìn)一步研究表明［7］：LINGO-1是連接髓鞘抑制信號(hào)與NgR復(fù)合物的紐帶。LINGO-1為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central Nervous System，CNS）專有蛋白，高度表達(dá)于CNS神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞。LINGO -1的主要功能有以下幾個(gè)方面［8］：（1）抑制軸突再生。（2）抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞分化和髓鞘形成。（3）抑制神經(jīng)元存活。在缺血性卒中LINGO-1表達(dá)上調(diào)，而在出血性卒中，LINGO-1表達(dá)是否上調(diào)仍不清楚。本研究結(jié)果顯示ICH后LINGO-1 mRNA表達(dá)于1d開(kāi)始增加，3d 到達(dá)高峰，7d開(kāi)始下降，14d 進(jìn)一步下降。3d前的上升考慮為出血性腦損傷后神經(jīng)元的應(yīng)激反應(yīng)及炎性因子的刺激所致，7~14d下降考慮為血腫的吸收期，應(yīng)激和炎性因子刺激減少，LINGO-1 mRNA相應(yīng)降低。相對(duì)應(yīng)的LINGO-1 蛋白表達(dá)于1d開(kāi)始增加，7d到達(dá)高峰，14d逐漸下降?？傊诔鲅苓厖^(qū)，LINGO-1的表達(dá)隨血腫的出現(xiàn)上升，隨血腫的吸收出現(xiàn)下降，但仍高于假手術(shù)組。推測(cè)ICH早期尤其是3~7d LINGO-1高水平維持可能是ICH后神經(jīng)再生障礙的原因之一。

GM1是一種糖鞘脂，參與神經(jīng)元的生長(zhǎng)﹑分化和表型的表達(dá)以及細(xì)胞遷移和神經(jīng)生長(zhǎng)錐的定向延伸，具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)修復(fù)雙重作用［9］。在卒中的研究中使用GM1能有效改善預(yù)后，但研究仍集中在以前的作用機(jī)制上［10-11］：（1）保護(hù)細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶和Ca+-Mg+-ATP酶活性。（2）阻止Ca+內(nèi)流。（3）降低興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性。（4）抑制細(xì)胞凋亡等。對(duì)于GM1直接作用于細(xì)胞膜發(fā)揮神經(jīng)再生研究較少，譚學(xué)新等［12］利用外源性GM1治療兔面神經(jīng)損傷，結(jié)果顯示有髓神經(jīng)纖維數(shù)量﹑髓鞘厚度﹑軸突直徑﹑神經(jīng)傳導(dǎo)速度均明顯高于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)從神經(jīng)軸突再生角度，研究GM1對(duì)軸突再生抑制通路的LINGO-1表達(dá)的影響。研究結(jié)果顯示：與模型組比較，GM1治療組神經(jīng)功能Longa評(píng)分在14d出現(xiàn)明顯下降（P<0.05），LINGO-1 mRNA的表達(dá)在7d和14d出現(xiàn)明顯下降（P<0.05），LINGO-1蛋白的表達(dá)亦在7d和14d出現(xiàn)明顯下降（P<0.05），且LINGO-1蛋白水平與Longa評(píng)分行相關(guān)性分析示兩者強(qiáng)相關(guān)。提示GM1治療作用可能是通過(guò)抑制LINGO-1mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制RhoA激活，減少RhoA激酶的活化，促進(jìn)腦出血周圍神經(jīng)軸突的再生和延長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)功能的改善，為GM1在ICH中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

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浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目（201464439）

310005 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院

*通信作者