針刺對一次離心運動后大鼠炎癥反麻的影響

白勝超　趙曉琴　孫君志　周越

摘要：探究針刺干預(yù)對一次離心運動后大鼠炎癥反應(yīng)的影響。方法：114只雄性（SD）大鼠，隨機分為4組：安靜對照組（C）、單純針刺組（A）、單純運動組（E）、運動針刺組（EA），E組和EA組均在坡度-16°的跑臺上進行一次離心運動，A組和EA組進行比目魚肌部位斜刺，之后按0h、2 h、24 h、48 h、72 h、120 h等時相進行取材。HE染色觀察比目魚肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；Western Blot法分別檢測比目魚肌、股直肌中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的蛋白表達；Elisa法檢測血漿中TNF-α的含量。結(jié)果：1）HE染色發(fā)現(xiàn)c組和A組均無顯著變化，E組出現(xiàn)不同程度的炎性細胞浸潤，運動后進行針刺使炎性細胞浸潤的峰值提前。2）比目魚肌中TNF-α，A組與c組相比均無顯著性差異（P>0.05）；E組與C組、EA組具有顯著性差異（P<0.05），在E組72 h達到峰值，在EA組48 h時相達到峰值。3）股直肌和血漿中TNF-～結(jié)果基本一致，A組與C組相比均無顯著性差異（P>0.05）；E組與C組具有顯著性差異（P<0.05），E組與EA組無顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論：單純進行針刺干預(yù)不會引起骨骼肌和血漿中明顯的炎癥反應(yīng)，離心運動可以導致骨骼肌出現(xiàn)一定程度的炎癥反應(yīng)，離心運動后進行針刺干預(yù)使針刺部位骨骼肌炎癥反應(yīng)的程度增加，并在峰值之后促使其消退；針刺產(chǎn)生的作用是局部效果，對非針刺部位骨骼肌和血漿的炎癥反應(yīng)不會產(chǎn)生顯著影響。

關(guān)鍵詞：離心運動；骨骼?。谎獫{；炎癥；針刺

中圖分類號：G 804.2 文章編號：1009-783X（2017）01-0085-06 文獻標志碼：A

針刺在中國傳統(tǒng)醫(yī)學中具有重要地位，許多研究領(lǐng)域中已有較為廣泛應(yīng)用，不同學科也對其機理進行了大量探討。研究證實，運動能引起骨骼肌細胞內(nèi)鈣離子（Ca²⁺）產(chǎn)生變化，進而誘發(fā)后續(xù)的一系列生理反應(yīng)，而運動后對骨骼肌進行針刺干預(yù)可以使胞漿內(nèi)Ca²⁺更快地恢復至正常水平，因此，針刺在運動領(lǐng)域也有較多應(yīng)用。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)針刺具有促進骨骼肌機能恢復及治療肌肉損傷等作用，之后從骨骼肌與運動方面進行了一系列的機理探索，其中有些研究發(fā)現(xiàn)針刺能夠促進離心運動后大鼠骨骼肌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的表達。TNF-α具有較多的生物學功能，可以促進內(nèi)皮細胞表達粘附分子，有促使白細胞游出，具有強烈的趨化和激活嗜中性粒細胞的作用，可以作為炎癥反應(yīng)的重要指標，這提示我們針刺干預(yù)對離心運動后大鼠炎癥反應(yīng)有一定影響。

20世紀70年代Tullson提出機體運動后會產(chǎn)生與急性免疫有關(guān)的反應(yīng)，之后較多研究者認為大鼠進行一次性長時間離心運動，產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)在早期階段局部組織的主要浸潤細胞為嗜中性粒細胞，后期炎癥反應(yīng)的主要細胞為巨噬細胞和淋巴細胞。運動導致的這些炎癥反應(yīng)和骨骼肌延遲性肌肉酸痛、骨骼肌微細損傷修復、骨骼肌凋亡自噬等均有重要關(guān)系，因此，探究針刺干預(yù)對運動后機體炎癥反應(yīng)的影響具有重要意義。

目前針刺對運動后骨骼肌的作用機制已有較多研究，但對于炎癥反應(yīng)的影響方面還尚未有很清楚的認識。本實驗通過對離心運動后大鼠進行針刺干預(yù)，觀察大鼠比目魚肌細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，分析比目魚肌、股直肌、血漿中TNF-α的變化，結(jié)合本實驗室以往的研究結(jié)果，探究針刺干預(yù)對一次離心運動后機體炎癥反應(yīng)的作用效果和部位，以期能夠從炎癥角度對針刺在運動方面的作用機理進行一定理論補充。

1材料與方法

1.1動物與分組

本實驗選用8周齡雄性（SD）大鼠共114只，SPF級別，體重為（199±6.8）g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證編號：SCXK（京）2009-0007。大鼠在中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所動物房內(nèi)進行飼養(yǎng)和相應(yīng)訓練。分籠飼養(yǎng)，每籠6只，按照國家標準嚙齒類動物飼料進行喂養(yǎng)，自由進食、飲水，室內(nèi)溫度為（22±2）℃，相對濕度30%～60%，光照12 h+黑暗12 h模擬晝夜交替。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d以后，進行相應(yīng)后續(xù)實驗。

實驗大鼠進行隨機分組，分為安靜對照組（Control，C）、單純針刺組（Acupuncture，A）、單純運動組（Exercise，E）、運動針刺組（Exercise+Acupuncture，EA）4個組。其中，后3組按取材時間又分為O h、2 h、24 h、48 h、72 h、120 h等時相組，每組各6只。

1.2處理方法與取材

運動方案：本實驗運動方案參照Armstrong的經(jīng)典離心運動模型，所有參與運動的大鼠在正式實驗之前進行為期3 d適應(yīng)性跑臺訓練：第1天跑臺坡度0°，跑速16 m/min，時間5min第2天跑臺坡度0°，跑速16 m/min，時間10 min第3天進行休息。第4天開始正式實驗，坡度-16°，跑速16 m/min，每次訓練時間90 min。E組和EA組進行運動，C組和A組不予運動。

針刺方案：在一次大負荷運動后即刻對EA組大鼠進行針刺干預(yù)，同期對A組予以相同的針刺處理。用固定器將大鼠固定好，用酒精棉球?qū)﹄p后肢進行消毒，用直徑0.25 mm的針灸針沿小腿三頭肌的縱向，從離跟腱約5 mm處的遠端中心部位進行斜刺，進針角度約30°，進針長度約18 mm，穿過小腿三頭肌的肌腹，針刺大鼠比目魚肌位置，留針2 min。

大鼠腹主動脈采血至抗凝管中，靜置10～20 min后，3 000r/min，離心20 min，取上清液，用于ELISA備測。將分離出來的比目魚肌和股直肌分別裝入凍存管中，立即投入液氮速凍，之后移至-80℃冰箱保存，用于Western Blot待測。EA組在離心運動后即刻進行針刺干預(yù)，同期對A組進行針刺處理。

1.3主要儀器與試劑endprint

-20℃恒冷切片機（LEICAUC6i萊卡），德國；奧林巴斯（OlympusIX71）倒置顯微鏡圖像采集系統(tǒng)；電泳儀（LKB 2301Macrodrive Power Supply LKBBROMMA），瑞典；垂直電泳槽（Cavoy MiniP-4），北京凱元儀器廠；電轉(zhuǎn)膜槽，BIO-RAD公司，美國；凝膠成像（Chemi Doc TMXRS），BIO-RAD，美國；酶標儀（xMarkTMMicroplate Spectrophotometer），BIO-RAD公司；漢醫(yī)牌針灸針，直徑25mm，津食藥監(jiān)械（準）字2009第2270002號。

BCA蛋白定量試劑盒，貨號-23225，Pierce公司；發(fā)光液，貨號-34080MN Super Signal West Pico化學發(fā)光底物ThermoSCIENTIFIC；膜再生液，貨號-P1650，普利萊基因技術(shù)有限公司；PVDF轉(zhuǎn)膜，Millipore公司；預(yù)染蛋白Marker，貨號-P7708，NEW ENGLAND BioLabs TNF-α抗體，貨號-ab65157，abcam公司；兔抗GAPDH多克隆IgG抗體，杭州至賢生物科技有限公司；HRP標記山羊抗兔IgG，貨號-ZB-2301，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒，北京鑫方程生物技術(shù)有限公司。

1.4測試指標與方法

1.4.1比目魚肌HE染色

恒冷切片機上調(diào)節(jié)溫度為-20℃，將樣品沿橫向截面切成厚度為8μm的薄片，貼在多聚賴氨酸處理過的載玻片上，將樣片放置4%的多聚甲醛中固定30 min，之后放置雙蒸水中1min，甩掉水分，用蘇木素染色5 min，再用自來水沖洗去切片上的殘留染色液直至切片變成藍色，用配置的含1%鹽酸的70%乙醇溶液，浸泡分色3 s左右，之后自來水沖洗5 min，再用蒸餾水浸洗大約1 min，放入伊紅水溶液，浸染2 min。將組織切片用蒸餾水洗去附在載玻片上的殘余染液，30%、70%、95%、無水乙醇、無水乙醇脫色，每次2 min，透明切片入二甲苯2次進行透明，每次2 min，樹膠封片。具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。每一比目魚肌切片的中心視野處進行圖像采集。

1.4.2 Western Blot方法檢測比目魚肌、股直肌中TNF-α蛋白表達

使用電子天平稱取大鼠比目魚肌和股直肌組織的質(zhì)量，按照1 mg肌組織加入10μL配置的裂解液比例進行混合，在冰上剪碎，勻漿，低溫高速離心機1萬4 000 r/min、溫度4℃、離心10 min。取離心后的上清液，4℃暫時儲存。BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白濃度測定，方法按照試劑盒說明書進行，調(diào)整所有樣品的蛋白濃度，使上樣量保持一致，按比例4：1加入5×樣品緩沖液，煮沸5 min，備用。配置SDS-PAGE凝膠進行電泳，電壓90 V，時間30 min，跑入分離膠以后，電壓140 V，電泳60～90 min，根據(jù)跑膠具體情況適當調(diào)整時間。轉(zhuǎn)膜為恒流300 mA，時間90 min。之后將膜放置于5%BSA封閉液中，室溫輕搖封閉3 h。封閉液稀釋一抗（TNF-α1：2000，GAPDH1：1 000）將膜放置于一抗溶液中，室溫6 h搖床孵育或4℃冰箱過夜。室溫TBST進行洗膜6次×5 min。二抗孵育用封閉液按比例1：5 000稀釋HRP標記山羊抗兔IgG，室溫孵育2 h。室溫TBST搖床洗膜6次，5 min。取相同體積量的超敏發(fā)光液A液和B液進行混合，并滴加到膜上，使充分與發(fā)光液接觸。去除氣泡，吸去多余的發(fā)光工作液，將膜置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)，顯像。利用Gel-pro軟件進行相應(yīng)的條帶灰度值分析。

1.4.3 ELISA方法檢測血漿中TNF-α水平

取血漿恢復室溫進行測定。主要測試步驟為：稀釋標準品、加樣并設(shè)空白孔和待測樣品孔，37℃溫育30 min，甩干液體，洗滌液重復洗滌5次，待測樣品孔加入酶標試劑液，37℃再溫育30 min，洗滌，顯色，加入終止液，酶標儀測OD值并進行濃度計算。具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.5統(tǒng)計學處理

所得數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行相應(yīng)的統(tǒng)計分析，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差（X±S）的形式進行表示，實驗數(shù)據(jù)采用多因素方差分析和單因素方差分析，多因素方差分析采用固定效應(yīng)模型，對固定因素分組方式（安靜對照、離心運動、單純針刺、運動針刺）和取材時間（0、2、24、48、72、120 h）進行主效應(yīng)及兩者的交互作用分析。如果主效應(yīng)顯著（P<0.05）則采用LSD方法進行事后多重比較分析（LSD Post Hoc Tests），對某一因素中單一水平內(nèi)各觀測值之間的相互比較采用單因素方差分析，方差齊性時用LSD方法，方差不齊性時用Tamhanes方法，顯著性水平取P<0.05，非常顯著性水平取P<0.01。

2結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

從圖1的染色結(jié)果可見，安靜組比目魚肌組織橫切片的細胞大多呈多角形，骨骼肌細胞核呈圓形或橢圓形分布于肌膜邊緣，未見到腫脹固縮等情況，肌膜清晰完整，肌細胞之間未見到明顯的血管改變和炎性反應(yīng)。

從圖2的HE染色結(jié)果可見，0、2、24、48、72、120 h肌纖維結(jié)構(gòu)趨于正常，骨骼肌纖維的形態(tài)結(jié)構(gòu)和安靜組基本相問，細胞間未見到明顯的浸潤。

從圖3的HE染色結(jié)果可見，離心運動后0 h、2 h大鼠比目魚肌局部偶見炎癥細胞浸潤，24 h大鼠比目魚肌肌纖維局部有少量的炎性細胞浸潤到骨骼肌細胞間，48 h、72 h浸潤明顯增多，120 h浸潤的炎癥細胞相比72 h時相可見到有所減少。

從圖4的HE染色結(jié)果可見，運動針刺組0 h和2 h，并未發(fā)現(xiàn)明顯的浸潤，偶見炎癥細胞的浸潤，和單純運動組的相似，在24 h組發(fā)現(xiàn)浸潤的炎癥細胞較多，受此實驗條件限制，不能確定此模型下浸潤細胞的類型，48 h能夠看到浸潤程度明顯要比單純運動組48 h嚴重，72 h開始出現(xiàn)下降的趨勢，120 h浸潤程度相比同時相的單純運動組明顯減輕，并且細胞結(jié)構(gòu)趨于完整。endprint

2.2大鼠比目魚肌中TNF-α的變化

對分組方式因素進行主體效應(yīng)檢驗，結(jié)果顯示具有極顯著差異（P<0.01），進一步進行事后多重檢驗，結(jié)果顯示C組和A組無顯著性差異（P>0.05），C組和E組、EA組均有極顯著性差異（P<0.01），A組和EA組有極顯著性差異（P<0.01），E組和EA組具有顯著性性差異（P<0.05）。

對取材時間因素進行主體效應(yīng)檢驗，結(jié)果顯示具有顯著影響，進一步的事后多重檢驗，結(jié)果顯示，24 h與0、48、120 h，48、72 h與0、2、120 h之間具有顯著性差異（P<0.05），其余時相相互比較均未有顯著性差異（P>0.05）。對兩因素的交互作用進行檢驗，結(jié)果顯示具有顯著性影響（P<0.01）。各個分組內(nèi)不同時相的均值及單因素方差分析結(jié)果見表1，均值變化趨勢如圖5所示。

2.3大鼠股直肌中TNF-α的變化

對分組方式因素進行主體效應(yīng)檢驗，結(jié)果顯示具有極顯著差異（P<0.01），進一步進行事后多重檢驗，結(jié)果顯示C組和A組無顯著性差異（P>0.05），C組和E組、EA組均有極顯著性差異（P<0.01），A組和EA組有極顯著性差異（P<0.01），E組和EA組無顯著性差異（P>0.05）。

對取材時間因素進行主體效應(yīng)檢驗，結(jié)果顯示具有顯著影響，進一步的事后多重檢驗，結(jié)果顯示，48、120 h與0、2、24 h等時相及72 h與所有時相之間都具有顯著性差異（P<0.05），其余時相相互比較均未有顯著性差異（P>0.05）。對兩因素的交互作用進行檢驗，結(jié)果顯示具有顯著性影響（P<0.01）。

各個分組內(nèi)不同時相的均值及單因素方差分析結(jié)果見表2，均值變化趨勢如圖6所示。

2.4大鼠血漿中TNF-α的變化

對分組方式因素進行主體效應(yīng)檢驗，結(jié)果顯示具有極顯著差異（P<0.01），進一步進行事后多重檢驗，結(jié)果顯示C組和A組無顯著性差異（P>0.05），C組和E組、EA組均有極顯著性差異（P<0.01），A組和EA組有極顯著性差異（P<0.01），E組和EA組無顯著性性差異（P>0.05）。

對取材時間因素進行主體效應(yīng)檢驗，結(jié)果顯示具有顯著影響，進一步的事后多重檢驗，結(jié)果顯示，0h與24、48、72、120 h，2 h與120 h之間具有顯著性差異，其余時相相互比較均未有顯著性差異（P>0.05）。對兩因素的交互作用進行檢驗，數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示不具有顯著性影響（P>0.05）。各個分組內(nèi)不同時相的均值及單因素方差分析結(jié)果見表3，均值變化趨勢如圖7所示。

3分析討論

從事不習慣或長時間大強度運動后會導致骨骼肌結(jié)構(gòu)產(chǎn)生損傷性變化，并伴隨著炎癥反應(yīng)，最開始為中性粒細胞進入受損部位，之后巨噬細胞浸潤增多并成為主要的炎癥細胞，炎癥細胞發(fā)揮雙重作用，一是中性粒細胞和巨噬細胞吞噬壞死細胞和碎片，二是分泌一些生長因子可以激活肌衛(wèi)星細胞進行修復再生。

HE染色發(fā)現(xiàn)，在單純針刺組并未發(fā)現(xiàn)明顯浸潤的炎癥細胞，說明單獨進行針刺并不能引起明顯的炎癥反應(yīng)，可能是由于并未產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，或是炎癥反應(yīng)程度較低，范圍較小，在光鏡下很難找到針刺所導致炎癥的反應(yīng)區(qū)域。屈芳的研究發(fā)現(xiàn)比目魚肌在運動后6 h，肌纖維間出現(xiàn)大量的炎性細胞，在12 h一直到運動后72 h，炎性細胞浸潤逐漸增多，在72 h時達到浸潤高峰。在本實驗單純運動組中O h和2 h組幾乎未見到浸潤，是由于炎癥細胞浸潤到骨骼肌中需要一定的時間，72 h浸潤達到峰值，120 h與安靜組相比存在較顯著的浸潤，這與許多研究結(jié)果類似，說明骨骼肌在離心運動后的120 h內(nèi)一直存在著炎癥反應(yīng)。

離心運動后針刺使炎癥反應(yīng)的高峰時相出現(xiàn)在48 h，而在120 h能夠看到浸潤的炎癥細胞明顯要比單純運動組少，說明進行針刺能夠使針刺部位骨骼肌炎癥反應(yīng)的峰值時相提前，并能提早結(jié)束。在離心運動后對骨骼肌炎癥反應(yīng)進行干預(yù)的類似實驗中，艾磊的研究發(fā)現(xiàn)布洛芬可以加快損傷較重的跖肌的炎癥反應(yīng)速度，并促使肌衛(wèi)星細胞的增殖。在本模型中針刺比目魚肌也有類似的結(jié)果，但其機理是否相同還有待于進一步研究。

TNF-α作為炎癥標志物，在一定程度上能夠反映炎癥變化情況，結(jié)合HE染色可以更準確地分析炎癥反應(yīng)的程度。Kim-berly等研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌進行超載負荷后的12 h、24 h、48h、72 h等時相，TNF-α蛋白表達均顯著高于對照組。本實驗研究結(jié)果比目魚肌、股直肌、血漿中TNF-α均受時相的影響較大，其中比目魚肌中48 h、72 h時相是本實驗中蛋白表達變化的主要時刻點，結(jié)合HE染色可知48 h為運動針刺組的峰值，72 h為單純運動組的峰值，而0h和2 h是血漿質(zhì)量濃度變化的主要時刻點。

單獨進行比目魚肌針刺，并未明顯引起血漿和骨骼肌TNF-α的變化，這與HE的染色結(jié)果相符，可能原因是并未引起比目魚肌TNF-α的產(chǎn)生或是產(chǎn)生量較少，入血后質(zhì)量濃度較低導致血漿TNF-α質(zhì)量濃度變化較小，也使得股直肌中幾乎無變化。

運動對TNF-α的影響，目前相關(guān)研究較多，Vassilakopou-los等發(fā)現(xiàn)，沒有訓練經(jīng)歷的健康男性進行70%最大攝氧量的運動可以引起血漿中TNF-α升高。Andrei等研究發(fā)現(xiàn)，健康青年男性進行3 h的60～65%功率自行車和跑臺運動，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在運動中1 h和3 h時相血漿中TNF-α顯著高于運動前安靜水平，在運動結(jié)束后3 h和24 h時相仍然高于運動前水平。這些研究均表明，運動能夠促使TNF-α高表達。在本實驗的研究結(jié)果中也表明進行離心運動能引起比目魚肌、股直肌和血漿中TNF-α的極顯著變化，這與目前的研究結(jié)論一致。對于運動后TNF-α的峰值變化情況，屈芳采用坡度為-16°的跑臺上，實驗大鼠以16 m/min的速度進行跑臺運動，持續(xù)90min，發(fā)現(xiàn)比目魚肌中在72 h時TNF-α的表達達到高峰。在本實驗的單純運動組內(nèi)比目魚肌和股直肌中均是在72 h達到峰值，這與屈芳的研究相同。結(jié)合HE染色可知是由于骨骼肌的炎癥反應(yīng)加強，并且浸潤的巨噬細胞增多，TNF-α分泌較多的緣故。

運動針刺對TNF-α的影響，徐濤對大鼠進行離心運動3周，并進行比目魚肌針刺干預(yù)，發(fā)現(xiàn)針刺作為干預(yù)手段能夠提高TNF-α的表達。在本實驗中發(fā)現(xiàn)針刺對運動后比目魚肌TNF-α蛋白有顯著影響，但并未引起股直肌和血漿中TNF-α明顯的變化。說明針刺對于離心運動后的影響是局部的，局限于針刺部位，而對于非針刺部位骨骼肌和血漿則不能產(chǎn)生明顯的作用效果。本研究發(fā)現(xiàn)運動針刺比目魚肌后TNF-α在48 h上升到峰值，與同時相的運動組相比具有顯著性差異，結(jié)合HE染色可知炎癥細胞浸潤的峰值時相比單純運動組提前出現(xiàn)，之后在120 h恢復到較低水平。

運動后進行針刺可能的意義在于，促使針刺部位骨骼肌炎癥程度增加并維持在較高水平，有利于加快局部清除受損肌纖維的速度，但對骨骼肌的最終恢復效果是否產(chǎn)生影響還有待于進一步研究。

4結(jié)論

本實驗中單純進行針刺干預(yù)不會引起骨骼肌和血漿中明顯的炎癥反應(yīng)，離心運動可以導致骨骼肌出現(xiàn)一定程度的炎癥反應(yīng)，離心運動后進行針刺干預(yù)使針刺部位骨骼肌炎癥反應(yīng)的程度增加，并在峰值之后促使其消退；針刺產(chǎn)生的作用是局部效果，對非針刺部位骨骼肌和血漿不會產(chǎn)生顯著影響。endprint