熒光光譜法研究人參皂苷Rb1與Aβ1-42的相互作用

鞠東,凌翠霞,宋勝梅,,董川

(1.煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司,山東 煙臺 264006;2.商丘師范學院 化學化工學院,河南 商丘 476000;3.山西大學 環(huán)境科學研究所,山西 太原 030006)

熒光光譜法研究人參皂苷Rb1與Aβ1-42的相互作用

鞠東1,凌翠霞2,宋勝梅1,3*,董川3*

(1.煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)有限公司,山東 煙臺 264006;2.商丘師范學院 化學化工學院,河南 商丘 476000;3.山西大學 環(huán)境科學研究所,山西 太原 030006)

β淀粉樣蛋白(β-amyloid peptide,Aβ)是構成老年斑的主要成分,Aβ在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的發(fā)生、發(fā)展中起主要作用。文章采用紫外和熒光光譜法研究人參皂苷Rb1與Aβ1-42的相互作用,為AD藥物篩選提供理論依據(jù)。研究表明,人參皂苷Rb1可以增強Aβ1-42的熒光,二者發(fā)生相互作用,形成了絡合物。人參皂苷Rb1與Aβ絡合物的雙倒數(shù)曲線呈良好的線性關系,說明人參皂苷Rb1與Aβ形成1∶1的絡合物,絡合常數(shù)約為214.5 L·mol-1·s-1。

人參皂苷Rb1;β-淀粉樣蛋白;熒光光譜法

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種以漸進性記憶力衰退為特征的中樞神經(jīng)退行性疾病,其主要特征是細胞外老年斑和細胞內(nèi)神經(jīng)元纖維纏結,及選擇性神經(jīng)元和突觸丟失。隨著老齡化時代的到來,AD將成為21世紀威脅人類生存質(zhì)量的最嚴重疾病之一[1]。AD病因?qū)W說有十多種,近年來β-淀粉樣蛋白(β amyloid peptide, Aβ) 級聯(lián)假說得到普遍認同,即Aβ是構成老年斑的主要成分,Aβ在AD的發(fā)生、發(fā)展中起主要作用[2-4]。Glenner等[5]于1984年完成了Aβ蛋白的測序工作,該蛋白由39-43個氨基酸殘基組成,分子量約4 kDa,其氨基酸序列如圖1所示。一些研究表明Aβ對神經(jīng)元具有雙重作用:神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)毒性。當Aβ濃度較低時,對未成熟分化的神經(jīng)元表現(xiàn)為營養(yǎng)作用,隨著Aβ濃度升高,對成熟分化的神經(jīng)元則表現(xiàn)為神經(jīng)毒性,具體體現(xiàn)為樹突和軸突退縮,進而導致神經(jīng)元減少或缺失[6]。Aβ是一種生理性多肽物質(zhì),可在人腦中不斷生成、降解和清除,若腦內(nèi) Aβ產(chǎn)生和清除不平衡,則會導致疾病發(fā)生,嚴重時導致神經(jīng)元退行性病變而引起癡呆。所以研究與Aβ相互作用的小分子對AD藥物的篩選具有重要的參考意義。

現(xiàn)代醫(yī)學普遍認為人參對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)有廣泛的作用,從而可提高人體力、智力的活動能力,增強機體對有害刺激的非特異性抵抗力。人參皂苷Rb1,也稱人參皂甙Rb1,是人參主要成分之一,具有抗衰老作用，其結構如圖2所示[7-8]。研究表明,AD與缺乏神經(jīng)生長因子的營養(yǎng)支持有關,而Rb1可以上調(diào)神經(jīng)因子的表達,對神經(jīng)元具有保護及營養(yǎng)作用,促進神經(jīng)元突觸再生,增強膽堿能神經(jīng)元抗損傷能力[9-12]。Yamaguchi等[13]發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1通過促進乙酰膽堿(ACh)的釋放、增加神經(jīng)末梢重新攝取Ach達到治療AD的目的。已有報道濃度為10 mol/ml Rb1能使中糖原合成酶-3表達下降,達到抑制凝聚態(tài)Aβ-P25-35所誘導的皮層神經(jīng)元tau蛋白過度磷酸化,從而對擬AD病變大鼠的海馬神經(jīng)元起保護作用[14],Rb1還可以通過對p25/cdk5的調(diào)節(jié),影響tau蛋白的過度磷酸化[15]。張均田[16]發(fā)現(xiàn)Rb1可明顯抑制vitC-NADPH和Fe2+半胱氨酸誘發(fā)的肝、腦線粒體脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,使脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)物丙二醛的含量減少并表現(xiàn)出一定的量效關系。另外Rb1的抑制強度和VitE大致相仿,提示Rb1有可能對治療AD有益。本研究以紫外和熒光光譜方法研究Rb1對已聚集的Aβ1-42的影響。

Fig.1 Primary structure of Aβ1-42圖1 Aβ1-42的一級結構

Fig.2 Structural formula of ginsenoside Rb1圖2 人參皂苷Rb1的結構式

1 實驗部分

1.1 試劑和藥品

Aβ1-42蛋白(上海強耀生物科技有限公司,中國.上海),以0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液配制成5×10-4mol/L儲備液,-20℃下儲存;人參皂苷Rb1(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,中國,上海)以二次蒸餾水配制成1.0×10-3mol/L儲備液,使用時適當稀釋;以0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液控制pH值。其它所用試劑購自國藥集團藥業(yè)股份有限公司(中國·北京),分析純,使用前沒有進一步提純;實驗用水為超純水(18.2 MΩ)。如無特別說明,所有實驗均在室溫完成。

1.2 儀器設備

以Cary60 UV-Vis紫外-可見分光光度計(Agilent Technologies,USA)測量吸收光譜;以Cary Eclipse熒光分光光度計(Agilent Technologies,USA)測熒光光譜(150 W氙燈，1 cm石英比色器，控溫水浴);pHS-3C型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)測定pH值;METTLER TOLEDO電子分析天平(Max=220,d=0.1 mg)稱量樣品。

1.3 實驗方法

吸收光譜:在Cary60紫外-可見分光光度計上對Aβ1-42與不同濃度的人參皂苷Rb1反應得到的產(chǎn)物進行掃描,得到它們的吸收光譜圖,同濃度的人參皂苷Rb1的磷酸鹽緩沖溶液作參比。在盛有6.0×10-6mol/L Aβ1-42、1 mL 磷酸鹽緩沖溶液 (pH 7.4)的比色皿(10×1 mm)中加入不同微升體積的人參皂苷Rb1工作液,充分攪拌,室溫放置5 min后測定。

以1.25×10-5mol/L Aβ1-42溶液與不同體積人參皂苷Rb1儲備液混合,配制系列工作溶液,搖勻,室溫放置10 min后測定熒光光譜。儀器條件設定如下:激發(fā)和發(fā)射狹縫均設為10 nm,掃描速度選擇慢速,響應時間選擇自動,激發(fā)電壓選擇中,設定激發(fā)波長為275 nm,測量范圍為280～500 nm;測Aβ1-42同步熒光時取Δλ=30 nm。

2 結果與討論

2.1 溫度對反應的影響

溫度對二者的相互作用影響如圖3和圖4所示。由圖可知,Aβ與人參皂苷Rb1相互作用時的熒光強度隨著溫度的增加而降低。通常小分子對蛋白質(zhì)熒光的猝滅分為靜態(tài)和動態(tài)兩種方式。靜態(tài)作用中,隨著溫度的升高,相互作用常數(shù)減小,但是動態(tài)猝滅中正好相反[17],說明二者之間可能發(fā)生了靜態(tài)相互作用。且溫度過高不利于該反應的進行,所以后續(xù)實驗在室溫進行。

Fig.3 Fluorescence excitation and emission spectra of 1×10-5 mol/L Aβ1-42 and 1×10-5 mol/L ginsenoside Rb1 at different temperatures圖3 1×10-5 mol/L Aβ1-42與1×10-5 mol/L人參皂苷Rb1在不同溫度下的熒光光譜。溫度依次為31℃、33℃、35℃、37℃、41℃、44℃、47℃，Ex=275 nm，Em=306 nm。內(nèi)插圖為溫度與發(fā)射強度的關系。

Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of 1×10-5 mol/L Aβ1-42 and 1×10-5 mol/L ginsenoside Rb1 at different temperatures圖4 1×10-5 mol/L Aβ1-42與1×10-5 mol/L人參皂苷Rb1在不同溫度的同步熒光光譜圖溫度依次為31℃、33℃、35℃、37℃、41℃、44℃、47℃。內(nèi)插圖為溫度與同步熒光強度的關系。

2.2 紫外-可見吸收光譜法研究人參皂苷Rb1與Aβ1-42的相互作用

不同濃度的人參皂苷Rb1與Aβ1-42的相互作用的吸收光譜見圖5。如圖1所示,Aβ1-42中,10位有一個酪氨酸,4、19和20位各有一個苯丙氨酸,酪氨酸和苯丙氨酸氨殘基的紫外吸收分別在275 nm和257 nm附近,肽鍵的特征吸收峰在225 nm附近(即Aβ1-42的骨架吸收),隨微環(huán)境的改變而有所變化;酪氨酸和苯丙氨酸均有熒光,但是由于酪氨酸的吸收波長比苯丙氨酸的吸收波長長,通常苯丙氨酸的吸收比較弱,會被酪氨酸的吸收掩蓋，且苯丙氨酸發(fā)射的熒光會被酪氨酸吸收,僅僅表現(xiàn)為酪氨酸發(fā)射的熒光,即303 nm附近的熒光發(fā)射峰。從圖5中可以看出,隨著Rb1濃度的增加,Aβ在204 nm(Aβ1-42的骨架吸收)和275 nm(酪氨酸的吸收)處的吸收強度增強。表明Aβ與人參皂苷Rb1發(fā)生了相互作用。

Fig.5 UV-Vis absorption spectra of Aβ1-42in the presence of ginsenoside Rb1圖5 6×10-6 mol/L的 Aβ1-42與不同濃度Rb1作用的紫外-可見吸收光譜人參皂苷Rb1的濃度1-9依次為:(1,2,3,4,5,6,7,8,9)×10-5 mol/L

Fig.6 Fluorescence excitation and emission spectra ofAβ1-42 in the presence of ginsenoside Rb1圖6 1.25×10-5 mol/L的 Aβ1-42與不同濃度人參皂苷Rb1作用的熒光激發(fā)和發(fā)射光譜人參皂苷Rb1的濃度依次為：(0，2.5，5，7.5，10，12.5，15，17.5，20，22.5，25，27.5，30，32.5)×10-3 mol/L

2.3 熒光光譜法研究人參皂苷Rb1與Aβ1-42的相互作用

Fig.7 Synchronous fluorescence spectra of Aβ1-42in the presence of ginsenoside Rb1圖7 1.25×10-5 mol/L的 Aβ1-42與不同濃度人參皂苷Rb1作用的同步熒光光譜，△λ=30 nm人參皂苷Rb1的濃度依次為：(0，2.5，5，7.5，10，12.5，15，17.5，20，22.5，25，27.5，30，32.5)×10-3 mol/L

Rb1與Aβ1-42相互作用的熒光光譜如圖6和圖7。由圖6可知,Aβ1-42在275 nm的激發(fā)和306 nm的發(fā)射強度均隨著人參皂苷Rb1濃度的增加而增強。表明Aβ1-42與人參皂苷Rb1共存時,熒光因敏化作用而增強。圖7的同步熒光光譜中,隨著人參皂苷Rb1的加入,Aβ1-42在275 nm的同步熒光峰增強, 525 nm處的同步熒光峰強度降低,在505 nm處出現(xiàn)等發(fā)射點。表明Aβ1-42中原有的、在525 nm處有熒光的結構含量隨著人參皂苷Rb1的增加而減少,二者反應后的新產(chǎn)物在525 nm處無熒光峰,證明蛋白的構象發(fā)生了變化。

2.4 絡合比和絡合常數(shù)

研究蛋白與藥物相互作用的結合常數(shù)和結合位點等參數(shù),可為探討藥物對蛋白構型變化的影響、藥物在人體內(nèi)的傳輸機制、藥理作用等提供有價值的信息[18]。根據(jù)Aβ1-42與人參皂苷Rb1的相互作用,可觀察到熒光的敏化增強。這一規(guī)律可用Benesi-Hildebrand方程[19-20]擬合。

假定Aβ1-42與人參皂苷Rb1生成1∶1的絡合物,其反應平衡式為:

上式中,CAβ是Aβ的分析濃度,CRb1是人參皂苷Rb1的分析濃度。CRb1約是CAβ的100倍,所以也遠遠大于產(chǎn)物Aβ-Rb1的濃度,即CRb1?[Aβ-Rb1],所以

(1)

所形成絡合物的量子產(chǎn)率表示為:

(2)

(2)中,FAβ-Rb1為絡合物的熒光強度,k為儀器常數(shù)。

由方程(1)可得:

(3)

由方程(2)可得:

FAβ-Rb1=QAβ-Rb1k[Aβ-Rb1]

(4)

方程(3)除以方程(4),得到:

即:

(5)

(5)式中FAβ-Rb1=F-F0,F為形成絡合物后的熒光強度,F0為只有Aβ時的熒光強度。

所以(5)式可變?yōu)?

(6)

Fig.8 Double reciprocal curve of the complex formed by ginsenoside Rb1 and Aβ圖8 人參皂苷Rb1與Aβ形成的絡合物的雙倒數(shù)曲線

3 結論

以UV-Vis和熒光光譜方法研究了Rb1與Aβ1-42之間的相互作用。證明二者之間是靜態(tài)相互作用,形成1∶1的絡合物,絡合物的形成常數(shù)約214.5 L·mol-1·s-1.本研究有助于了解人參皂苷Rb1與Aβ1-42的相互作用機理,對AD藥物篩選起借鑒作用。

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Interaction of Ginsenoside Rb1 and Aβ1-42by Fluorescence Spectroscopy

JU Dong1,LING Cuixia2,SONG Shengmei1，3*,DONG Chuan3*

(1.YantaiNewEraHealthIndustryGroupCo.,Ltd.,Yantai264006,China;2.Schoolofchemistryandchemicalengineering,ShangqiuNormalUniversity,Shangqiu476000,China;3.Instituteofenvironmentalscience,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China)

β-amyloid peptide (Aβ) is the main component of senile plaque, and Aβ plays a leading role in the occurrence and development of Alzheimer’s disease (AD).The interaction between ginsenoside Rb1 and Aβ1-42was studied by UV and fluorescence spectroscopy, which could provide theoretical basis for the drug screening of AD treatment.The results showed that ginsenoside Rb1 could enhance the fluorescence of Aβ1-42,and the complex was formed between ginsenoside Rb1 and Aβ. The double reciprocal plots of them showed a good linear relationship, indicating that the 1∶1 complex between ginsenoside Rb1 and Aβ was formed, and the complexation constants was about 214.5 L·mol-1·s-1.

ginsenoside Rb1;amyloid beta protein;fluorescence spectrometry

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.01.022

2016-08-16；

2016-11-30

國家自然科學基金(No.21205076);中國博士后科學基金(No.2013M541203)

鞠東,(1985-),男,山西浮山人,碩士,工程師,主要從事保健食品開發(fā),E-mail:judong@vip.qq.com

*通信作者：宋勝梅(SONG Shengmei),E-mail:smsong@sxu.edu.cn;董川(DONG Chuan)，E-mail:dc@sxu.edu.cn

O657

A

0253-2395(2017)01-0137-06