金果欖總皂苷抗氧化活性研究

鄧曉梅

(銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院,貴州 銅仁,554300)

金果欖總皂苷抗氧化活性研究

鄧曉梅

(銅仁學(xué)院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院,貴州 銅仁,554300)

研究了金果欖總皂苷對羥基自由基、亞硝酸鹽清除能力,對亞硝胺的阻斷能力及對三價鐵離子的還原力,并依據(jù)該5種指標(biāo)討論了金果欖總皂苷的抗氧化活性及總皂苷濃度與其抗氧化活性的關(guān)系。研究結(jié)果表明,隨著總皂苷濃度的增大,總皂苷對羥自由基、亞硝酸鹽、超氧陰離子的清除能力以及阻斷亞硝胺能力和總黃酮還原力均增大;金果欖總皂苷的抗氧化活性隨其濃度的增大而遞增。

金果欖;總皂苷;抗氧化活性

金果欖又名金苦欖、九牛膽[1]。味苦,性寒,具有清熱解毒,利咽止痛之功效,主要分布在湖北、湖南、廣東、廣西、四川、貴州等地區(qū)[2]。金果欖在臨床上常用于治療慢性、急性咽喉炎、上呼吸道感染、急性扁桃體炎、氣管炎等疾病[3?4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,癌癥、衰老、炎癥、心血管疾病的產(chǎn)生與發(fā)展等都可由自由基及其代謝產(chǎn)物誘發(fā)[5],并且有機體的多種疾病都與自由基對機體的氧化損傷有關(guān)[6],其中有超氧陰離子自由基、羥基自由基等氧自由基及NO等氮氧自由基。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)中藥的功效與其抗氧化作用有密切關(guān)系[7]。而皂苷是一類具有生理活性的物質(zhì),有降血脂、抗病毒、抗菌、抗氧化、抑制腫瘤細(xì)胞生長、抗自由基、免疫調(diào)節(jié)等作用[8],具有重要開發(fā)利用價值。

目前國內(nèi)外有關(guān)金果欖總皂苷抗氧化活性的研究并不多見,金果欖總皂苷抗氧化活性的研究可為其藥用價值的研究者提供數(shù)據(jù)參考及為金果欖提取物的體外抗氧化活性的深入研究提供理論依據(jù)。本文依據(jù)金果欖總皂苷對羥基自由基、亞硝酸鹽清除能力,對亞硝胺的阻斷能力及對三價鐵離子的還原力,研究金果欖總皂苷的抗氧化活性及總皂苷濃度與其抗氧化活性的關(guān)系。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

材料:金果欖,購于中藥店,在實驗室采用常規(guī)法自制金果欖總皂苷。

試劑:硫酸亞鐵、乙醇、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、N-1-萘乙二胺、鹽酸、二甲胺、三氯化鐵、六氰合鐵酸鉀、水楊酸、過氧化氫、對氨基苯磺酸、碳酸二氫鈉、碳酸氫二鈉、碳酸鈉等。試劑均為國產(chǎn)市售分析純。

1.2 設(shè)備

101-3ASB型電熱恒溫鼓風(fēng)干箱(北京科偉永興儀器有限公司);AR124CN型電子分析天平(奧豪斯儀器上海有限公司);T6新世紀(jì)型紫外可見光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);HH-2型電熱恒溫水浴鍋(北京科偉永興儀器有限公司);80-2型離心沉淀機(江蘇中大儀器廠)。

2 方法

2.1 水楊酸法清除羥基自由基

取7支已標(biāo)號(A1～A5、A樣、A對)的干燥試管,分別在試管中依次加入1 mL 的6 mmoL/L的FeSO4,1 mL 的6 mmoL/L水楊酸-乙醇溶液,在A樣及A1～A5試管中分別加入樣液(在料液比為1∶10的條件下常規(guī)提取的金果欖總皂苷溶液)0.1、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL,0.1%的過氧化氫溶液1 mL,7支試管均以蒸餾水補至總體積5 mL[9]。其中對照管A對中不加樣液,樣底管A樣中不加過氧化氫溶液,搖勻后37 ℃水浴30 min,在510 nm處測定吸光度值。重復(fù)測定5次,取平均值。計算其清除率:清除率(%)=[1 ? (A樣品?A樣底)/A對照]×100%。式中:A樣品為加入樣品后的羥自由基體系的吸光度值;A樣底為羥自由基反應(yīng)體系中不加過氧化氫而加樣品的吸光度值;A對照為不加樣品時羥自由基體系的吸光度值。

2.2 亞硝酸鹽清除能力試驗

所用藥品都用pH值為5.7的磷酸鹽緩沖液配置,取6支已標(biāo)號(A0～A6)的干燥具塞試管,分別加入5 mg/L的亞硝酸鈉溶液1 mL,在A1～A5試管中分別加入樣液(在料液比為1∶12,乙醇濃度為90%,提取時間為4 h,40 ℃的條件下常規(guī)提取的金果欖總皂苷溶液)0.005、0.010、0.020、0.040、0.080 mL,且對照組A對不加樣液,37 ℃恒溫水浴30 min,再依次加入2%(w)的對氨基苯磺酸溶液1 mL,靜置5 min后,加入0.2%(w)的N-1-萘乙二胺鹽酸溶液1 mL,在波長為550 nm處測其吸光度[10]。重復(fù)測定5次,取平均值。計算其清除率:清除率(%)=(1 ?A/A0)×100%。式中:A為樣液的吸光度值;A0為不加入樣液的對照組的吸光度值。

2.3 阻斷亞硝胺能力試驗

取6支已標(biāo)號(A0～A5)的干燥錐形瓶,分別加入pH值為3.0的磷酸鹽緩沖液25 mL,1 mmol/L亞硝酸鈉溶液3 mL,1 mmol/L二甲胺3 mL,在A1～A5試管中分別加入樣液(在料液比為1∶12,乙醇濃度為90%,提取時間為4 h,40 ℃的條件下常規(guī)提取的金果欖總皂苷溶液)0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL,對照組A對不加樣液。將反應(yīng)體系定容至50 mL,37 ℃恒溫水浴1 h。取1.0 mL反應(yīng)液到7 cm2的培養(yǎng)皿中,加入0.5%(w)的碳酸鈉溶液0.5 mL,紫外燈照射15 min,再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的對氨基苯磺酸溶液1.5 mL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的α-萘胺1.5 mL,將反應(yīng)體系定容至5.0 mL,放置15 min,在540 nm處測定吸光度[11]。重復(fù)測定5次,取平均值。計算其阻斷率:阻斷率(%)=(A0?A)/A0×100%。式中:A為樣液的吸光度值;A0為不加入樣液的對照組的吸光度值。

2.4 總黃酮還原力的測定

取6支已標(biāo)號(A1～A6)的干燥試管,依次加入樣液(在料液比為1∶10,乙醇濃度為70%,提取時間為5 h,50 ℃的條件下常規(guī)提取的金果欖總皂苷溶液)0.004、0.008、0.016、0.032、0.064、0.128 mL,pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液2 mL,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的六氰合鐵溶液2 mL,50 ℃恒溫水浴20 min,冰浴冷卻。再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的三氯乙酸溶液2 mL,以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液3 mL于試管中,加5 mL蒸餾水,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的FeCl3溶液2 mL,混勻靜置10 min,在波長為700 nm處測其吸光度[12]。重復(fù)測定5次,取平均值。吸光度越大表示還原能力越強。

2.5 鄰苯三酚法測定超氧離子

取7支已標(biāo)號(A0～A6)的干燥試管,依次加入Tris-Hcl (pH值為8.0)緩沖溶液4 mL,26 ℃恒溫水浴20 min。在A1?A5試管中依次加入樣液(在料液比為1∶10,乙醇濃度為70%,提取時間為4 h,60 ℃的條件下常規(guī)提取的金果欖總皂苷溶液)0.005、0.010、0.020、0.040、0.080 mL,且對照組A對試管中加入樣液0.04 mL,樣底組A樣及A1～A5六支試管中分別加入5 mmol/L鄰苯三酚溶液(用20 mmol/L Hcl溶液配制)1 mL,用蒸餾水定容反應(yīng)體系至10 mL。準(zhǔn)確反應(yīng)5 min,在波長為420 nm處測其吸光度A[13]。重復(fù)測定5次,取平均值。計算其清除率:清除率(%)=[1 ? (A1?A2)/A0]×100%。其中:A0為加鄰苯三酚不加樣品時反應(yīng)體系的吸光度值;A1為加樣品和鄰苯三酚時反應(yīng)體系的吸光度值;A2為加樣品不加鄰苯三酚時反應(yīng)體系的吸光度值。

3 結(jié)果與分析

3.1 水楊酸法清除羥基自由基

不同濃度總皂苷提取液對羥基自由基的清除率如圖1所示。反應(yīng)體系中的過氧化氫與二價鐵離子混合后產(chǎn)生的羥基具有很高的反應(yīng)活性,但存活時間短。水楊酸加入到反應(yīng)體系中后,能有效地捕捉羥基并產(chǎn)生紫紅色產(chǎn)物,并且這種紫紅色產(chǎn)物在510 nm波長處有強吸收性,其反應(yīng)方程為 H2O2＋Fe2+→OH＋OH-＋Fe3+→ OH+＋H2O2?OH+水楊酸→鄰羥基水楊酸＋H2O。水浴后可看到試管中的反應(yīng)體系除了樣底組的溶液是無色狀態(tài)外,其余呈現(xiàn)出的紫紅色深度不同,根據(jù)原理可知是加入的金果欖總皂苷起到了清除羥自由基的作用?？傇碥兆鳛榱u自由基清除劑與水楊酸競爭,減少了紫紅色產(chǎn)物的生成量,使試管中反應(yīng)體系的顏色深淺不同。且隨著總皂苷加入的濃度增大,反應(yīng)體系的顏色就越淺。在固定反應(yīng)時間反應(yīng)后用分光光度計測定各試管反應(yīng)體系在510 nm波長處的吸光度值,并與空白對照比較,就能確定金果欖總皂苷對羥自由基有清除作用,由圖 1可知,隨著皂苷提取液濃度的增大,清除率越大。即加入的總皂苷提取液的濃度越大,對自由基的清除能力越強。

圖1 不同濃度提取液對羥基自由基的清除率

3.2 亞硝酸鹽清除能力試驗

不同濃度總皂苷提取液對亞硝酸鹽的清除率如圖2所示。從圖2可知,NaNO2的含量越少,提取液清除能力就越強,反之則越弱。在試管中加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的N-1-萘乙二胺鹽酸溶液后可以看到反應(yīng)體系變?yōu)榧t色。NaNO2含量隨著金果欖總皂苷加入量增大而減少?？芍尤氲目傇碥涨宄朔磻?yīng)體系中的亞硝酸鹽,隨著總皂苷提取液濃度的增大,其清除率越大。

圖2 不同濃度總皂苷提取液對亞硝酸鹽清除率

3.3 阻斷亞硝胺能力試驗

不同濃度總皂苷提取液對亞硝酸鹽阻斷率的影響,如圖3所示。由圖3可知,隨著加入的金果欖總皂苷濃度增大,對亞硝胺的阻斷能力越強,即反應(yīng)體系中亞硝胺的含量越多,說明金果欖總皂苷阻斷亞硝胺的能力越強。隨著總皂苷提取液濃度的增大,其阻斷率越大。

3.4 總黃酮還原力的測定

加入不同濃度總皂苷提取液后總黃酮還原力的測定結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,反應(yīng)體系的吸光度值逐漸增大,表示其還原能力越強,即將反應(yīng)體系中的三價鐵離子還原為二價鐵離子的能力越強,說明金果欖總皂苷的抗氧化性越強。

圖3 不同濃度提取液對亞硝酸鹽阻斷率的影響

圖4 加入不同濃度提取液后總黃酮的還原力

圖5 不同濃度提取液對超氧陰離子自由基的清除率

3.5 鄰苯三酚法測定超氧離子

不同濃度總皂苷提取液對超氧陰離子自由基的清除率見圖5。從圖5可知,隨著金果欖總皂苷濃度的增大,反應(yīng)體系的吸光度值也逐漸增大,即反應(yīng)體系中的超氧離子在SOD的催化下與氫離子結(jié)合生成氣態(tài)氧和過氧化氫,說明金果欖總皂苷對超氧離子有清除作用。隨著總皂苷濃度的增大,其清除率也相應(yīng)增大。

4 結(jié)論

本文通過水楊酸法清除羥基自由基、亞硝酸鹽清除能力試驗、阻斷亞硝胺能力試驗、總黃酮還原力的測定及鄰苯三酚法測定超氧離子等研究,得出結(jié)論金果欖總皂苷能清除羥自由基、亞硝酸鹽、超氧離子及阻斷亞硝胺和具有還原三價鐵離子的能力,5種不同指標(biāo)的檢驗結(jié)果均證明了金果欖總皂苷具有抗氧化性的能力,且在一定條件下隨著總皂苷濃度的增大,其抗氧化能力越強。

[1]葉方,楊光義,王剛.金果欖藥理作用及臨床應(yīng)用研究綜述[J].中國藥師,2011,14(1):132?134.

[2]中國科學(xué)院“中國植物志”編輯委員會.中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社,2004:19.

[3]侯愛風(fēng),于豪.中藥吹喉配合點刺治療小兒急性扁桃體炎105例[J].安徽中醫(yī)臨床雜志,2000,12(5):425?427.

[4]高麗華,姜海英.清咽湯治療急性咽炎[J].時珍國醫(yī)國藥,2000,11(7):650?655.

[5]雷曉燕,許愛霞,高湘,等.水紅花子水提物的抗氧化活性[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2005,25(7):820?822.

[6]Fang Y Z,Yang S,Wu G Y.Free Radicals,Antioxidants and Nutrition [J].Nutrition,2002,18(10):872.

[7]Cai Y Z,Luo Q,Sun M.Antioxidant Activity and P hour enolic compounds of 112 Traditional C hour inese Medicinal Plants Associated wit hours Anticancer [J].Life Sci,2004,74:2 157?2 184.

[8]李廣,李浩波,劉璐,等.皂甙的生理活性及其應(yīng)用研究進展[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2003,19(6):3?6.

[9]熊輝巖,張曉峰,譚大風(fēng),等.大黃屬三種植物不同部分提取物清除羥基自由基的體外實驗研究[J].食品科學(xué),2003,24(1):128?130.

[10]藍(lán)思桃,黃俊生.鳳凰茶體外清除亞硝酸鹽及阻斷亞硝胺合成的研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(7):37?38.

[11]余華,湯修琴,曹麗容.天然植物成分體外模擬胃液清除亞硝酸鈉及阻斷亞硝胺合成的研究[J].四川食品與發(fā)酵,2005(2):7?10.

[12]汪海波,劉大川,佘珠花,等.大豆異黃酮類物質(zhì)的提取、抗氧化性及穩(wěn)定性研究[J].食品科學(xué),2004,25(1):111?115.

[13]溫昭君,何燕平,吳韋柳,等.茉莉花莖黃酮的體外抗氧化活性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2012,23(8):1 866?1 867.

(責(zé)任編校:劉曉霞)

Study on antioxidant activities of total saponins from Radix tinosporae

Deng Xiaomei
(College of Argoforest Engineering and Planning,Tongren University,Tongren 554300,China)

The antioxidant activities of total saponins extracted from Radix tinosporae are studied,which can serve as a database for the study on the Radix tinosporae medicinal value and its extract antioxidant activity in vitro.The results show that with the increasing concentrations of total saponin,its ability to sequester hydroxyl radical,nitrite,and superoxide anion,and to block nitrosamine and reduction of total flavone increases.Besides,in the studied concentration range,the antioxidant activities of the total saponins extracted from Radix tinosporae increase progressively with the increasing concentration.

Radix tinosporae;total saponins;antioxidant activities

R 284

A

1672-6146(2017)02-0032-04

鄧曉梅,1507109907@qq.com。

2016?08?16

10.3969/j.issn.1672-6146.2017.02.009