白介素—10對(duì)去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松的作用

嚴(yán)正杰++戴有金++侯道榮

[摘要] 目的 探討白介素-10（IL-10）對(duì)去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松的影響。 方法 采用隨機(jī)數(shù)表法將60只ICR小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組（OVX組）和治療組（IL-10組），每組20只。OVX組小鼠切除雙側(cè)卵巢復(fù)制骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型；IL-10組小鼠切除雙側(cè)卵巢后尾靜脈注射IL-10（80 mg/kg），2次/周，連續(xù)給藥12周；對(duì)照組只切除卵巢周?chē)c卵巢大小相當(dāng)?shù)囊粔K脂肪組織。12周后檢測(cè)各組小鼠骨相關(guān)參數(shù)以及血清骨源性堿性磷酸酶（BALP）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量。 結(jié)果 OVX組小鼠造模后，骨密度（BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）明顯下降，骨小梁分離度（Tb.Sp）顯著上升，與對(duì)照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。OVX組小鼠呈現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松表現(xiàn)。而與OVX組比較，IL-10治療組小鼠BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th明顯上升，Tb.Sp明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。Micro-CT分析圖像顯示，OVX組小鼠骨小梁顯著減少，而IL-10治療組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁減少程度有明顯改善。與對(duì)照組比較，OVX組小鼠血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯增高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；而同時(shí)給予IL-10治療后，小鼠血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯下降，與OVX組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 IL-10能夠增加去卵巢骨質(zhì)疏松癥小鼠BMD，降低BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平，減輕骨質(zhì)疏松癥狀。IL-10在去卵巢小鼠骨質(zhì)疏松的治療上有明顯作用。

[關(guān)鍵詞] 白介素-10；骨質(zhì)疏松；骨密度；白介素-1β；白介素-6；腫瘤壞死因子-α

[中圖分類(lèi)號(hào)] R681 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（a）-0039-05

[Abstract] Objective To explore the effect of interleukin-10 （IL-10） on osteoporosis in ovariectomized mice. Methods 60 ICR mice were divided into three groups： control group， model group （OVX group） and treatment group （IL-10 group） by using random data table， each group had 20 mice. Bilateral ovaries in mice of OVX group were removed to establish ovariectomized mice model. Bilateral ovaries in mice of IL-10 group were removed， followed by IL-10 injection （80 mg/kg） for 12 weeks in a row （2 times per week）. Only a piece of fat tissue size same as ovary around the ovary was removed in the control group. After 12 weeks， bone related parameters， bone alkaline phosphatase （BALP）， IL-1β， IL-6 and tumor necrosis factor （TNF）-α of the bone tissue were measured. Results Compared with control group， bone mineral density （BMD）， bone volume fraction （BV/TV）， trabecular thickness （Tb.Th） and trabecular number （Tb.N） significantly decreased， and trabecular separation （Tb.Sp） increased in OVX group， with statistically significant differences （P < 0.01）. The OVX group animals had obvious performance of osteoporosis. After IL-10 treatment， compared with OVX group， BMD， BV/TV， Tb.Th and Tb.N significantly increased， and Tb.Sp decreased， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Micro-CT images showed that trabecular number in OVX group decreased obviously， and increased significantly in IL-10 group. Compared with control group， serum BALP， IL-1β， IL-6 and TNF-α significantly increased in OVX group （P < 0.01）； after IL-10 treatment， serum BALP， IL-1β， IL-6 and TNF-α decreased obviously in IL-10 group， compared with OVX group （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion IL-10 can alleviate the symptoms of osteoporosis， increase the BMD and decrease levels of BALP， IL-1β， IL-6 and TNF-α in serum. IL-10 has an apparent role of anti-osteoporosis in ovariectomized mice.

[Key words] IL-10； Osteoporosis； BMD； IL-1β； IL-6； TNF-α

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨組織微觀結(jié)構(gòu)退化和骨量減少為特點(diǎn)，導(dǎo)致骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨病[1]，其被視為繼心血管病之后的第二大致死性健康問(wèn)題[2]。隨著我國(guó)人口老齡化的日趨嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐年升高。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率女性高于男性，其發(fā)生與雌激素有關(guān)[3]。尤其對(duì)于絕經(jīng)期婦女，絕經(jīng)后雌激素的分泌不足會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，60歲時(shí)約有15%的婦女會(huì)發(fā)生骨質(zhì)疏松，80歲時(shí)則增加到38%[4]。IL-10（interleukin-10）是一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子，具有較強(qiáng)的抗炎作用[5-6]。有研究表明，IL-10對(duì)破骨細(xì)胞的重聚和活化有抑制作用[7]，并且對(duì)骨吸收有保護(hù)作用[8]。本文擬對(duì)IL-10對(duì)小鼠骨質(zhì)疏松癥的治療作用做初步研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性ICR小鼠60只，體重為（22±2）g，購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK （蘇）2016-0002。動(dòng)物自由飲食并置于恒定環(huán)境[溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%，12 h晝/夜循環(huán)光照]下飼養(yǎng)。

1.2 主要藥品與儀器

小鼠IL-10（210-10），美國(guó)PEPRO？鄄TECH公司；Micro-CT（Skyscan 1176），德國(guó)BRUKE公司；骨源性堿性磷酸酶試劑盒（BALP，H234）、IL-1β檢測(cè)試劑盒（H002）、IL-6檢測(cè)試劑盒（H007）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測(cè)試劑盒（H052），南京建成生物工程研究所。

1.3 動(dòng)物分組及處理

60只ICR小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組、骨質(zhì)疏松模型組（OVX組）和治療組（IL-10組），每組20只。OVX組和IL-10組小鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)。以1%戊巴比妥鈉50 mg/kg劑量腹腔注射麻醉后，小鼠采用俯臥位。無(wú)菌條件下腹部背側(cè)（脊柱兩側(cè)）各做0.5～1 cm的縱行切口，使用無(wú)菌鑷子拉出雙側(cè)卵巢并摘除，止血后放回腹腔并分兩層縫合切口，術(shù)后給予青霉素預(yù)防感染。對(duì)照組只切除卵巢周?chē)c卵巢大小相當(dāng)?shù)囊粔K脂肪組織[9]。造模后，IL-10組小鼠尾靜脈注射IL-10（80 mg/kg），2次/周，連續(xù)給藥12周。三組小鼠飼養(yǎng)條件一致，自由攝食進(jìn)水，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為12周。12周后各組小鼠取樣用于檢測(cè)。

1.4 股骨取材

動(dòng)物處死后，立即無(wú)菌操作取右側(cè)股骨，迅速放入4%多聚甲醛中4℃固定24 h后置入PBS中保存。

1.5 Micro-CT檢測(cè)

取各組小鼠右側(cè)股骨用于CT掃描。掃描條件：分辨率為18 μm，濾片為0.5 mm Al，旋轉(zhuǎn)步徑為0.6°。使用BRUKE公司CTan軟件分析骨相關(guān)參數(shù)。

1.6 血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平測(cè)定

使用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)各組小鼠血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨相關(guān)參數(shù)測(cè)定

小鼠骨質(zhì)疏松造模后，因?yàn)楦腥舅劳?只。各組動(dòng)物飼養(yǎng)12周后，選取16只用于數(shù)據(jù)分析。小鼠股骨遠(yuǎn)端骨相關(guān)參數(shù)分析結(jié)果顯示，OVX組小鼠造模后，骨密度（BMD）、骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）明顯下降，骨小梁分離度（Tb.Sp）顯著上升，與對(duì)照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。而與OVX組比較，IL-10組小鼠BMD、BV/TV、Tb.N和Tb.Th明顯升高，Tb.Sp明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)表1。各組小鼠股骨遠(yuǎn)端冠狀面和矢狀面圖像也顯示OVX組小鼠骨小梁顯著減少，而IL-10組小鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁減少程度有明顯改善。見(jiàn)圖1。

2.2 血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平測(cè)定

血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平測(cè)定結(jié)果表明，OVX組小鼠血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯增高，與對(duì)照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）；而同時(shí)給予IL-10治療12周后，小鼠血清BALP、IL-1β、IL-6和TNF-α水平明顯下降，與OVX組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)表2。

3 討論

Saville首次建立的去卵巢型骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型主要代表原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中的Ⅰ型[10]，該模型成功模擬了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥骨代謝特點(diǎn)[11]，因而得到了廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，隨著對(duì)骨質(zhì)疏松癥病因病理研究的深入，細(xì)胞因子在其中發(fā)揮的作用越來(lái)越受到重視。骨質(zhì)疏松的致病機(jī)制尚未明確，但近年來(lái)隨著發(fā)病機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子與骨質(zhì)疏松的聯(lián)系越來(lái)越緊密[12-13]。

血清BALP是最常用的評(píng)價(jià)骨形成和骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)，可反映成骨細(xì)胞活性。越來(lái)越多的研究表明，血清BALP檢測(cè)可作為骨形成的特異性生化指標(biāo)[14]。BALP是成骨細(xì)胞分泌的一種胞外酶，為多糖蛋白，它在細(xì)胞內(nèi)合成，在多糖-肌醇磷酸特異水解酶作用下，BALP被釋放到血循環(huán)中發(fā)揮作用。BALP的主要功能是在成骨過(guò)程中水解磷酸酯，為羥基磷灰石的沉積提供必須的磷酸，同時(shí)水解焦磷酸鹽，解除其對(duì)骨鹽形成的抑制作用，有利于骨形成[15]。本研究顯示，OVX組小鼠BALP顯著升高，提示反映骨形成的生化指標(biāo)BALP在骨質(zhì)疏松發(fā)病活動(dòng)期有顯著增高。而IL-10治療后抑制了骨質(zhì)疏松的程度，也抑制了BALP的活性。

IL-1是一類(lèi)影響各種細(xì)胞因子的低分子蛋白，主要由中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞分泌，分為IL-1α和IL-1β兩種，兩者均具有促進(jìn)骨吸收的作用[16]，其中，IL-1β是較強(qiáng)的刺激骨吸收的因子之一[17]。IL-1β還可作為“上游因子”刺激“下游因子”如M-CSF、TNF-α和IL-6等表達(dá)，間接激活破骨細(xì)胞，并抑制其凋亡，加速骨吸收進(jìn)程[18]。IL-1β還可以促進(jìn)破骨細(xì)胞黏附于鈣化的骨小梁的表面，從而加速骨吸收[19]。本研究表明，OVX組小鼠IL-1β較對(duì)照組顯著升高，提示破骨活動(dòng)增強(qiáng)。而IL-10治療后使IL-1β水平明顯下降，說(shuō)明IL-10對(duì)IL-1β的破骨作用有抑制作用。已有研究證實(shí)，IL-10可通過(guò)抑制炎癥因子IL-1β的產(chǎn)生進(jìn)而減弱破骨細(xì)胞的作用，從而抑制骨吸收和骨量流失[17]。

IL-6是一種具有多功能的生物活性因子，在骨微環(huán)境中，多種活性細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-6，如活性T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和破骨細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，血清IL-6隨年齡增長(zhǎng)而增加，血清IL-6和BMD存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，并且IL-6和骨丟失存在著密切的關(guān)系[20]。Poli等[21]報(bào)道IL-6基因敲除小鼠卵巢切除后BMD和骨轉(zhuǎn)換率都不發(fā)生改變，證明IL-6在骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。臨床研究表明，正常人血中IL-6含量低，隨年齡的增加IL-6含量升高，女性絕經(jīng)后血中IL-6明顯升高，IL-6 mRNA在骨質(zhì)疏松患者骨組織中的表達(dá)明顯高于正常女性[22]。絕經(jīng)后雌激素缺乏所出現(xiàn)的骨質(zhì)疏松，部分是由于雌激素對(duì)IL-6的抑制減弱，導(dǎo)致骨吸收增加引起的。IL-6的主要破骨作用是誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞活化，可以直接加強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性，抑制其凋亡[23]。另一方面，IL-6還可通過(guò)NF-κB加強(qiáng)細(xì)胞的破骨能力[24]。本研究中OVX組IL-6較對(duì)照組顯著升高（P < 0.01），表明去卵巢后雌激素水平驟降，對(duì)IL-6的抑制作用減弱，導(dǎo)致血清IL-6增高；IL-10組IL-6較OVX組顯著降低（P < 0.01），說(shuō)明IL-10對(duì)IL-6水平有抑制作用，從而減少了骨吸收。

TNF-α是由單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生的細(xì)胞因子，具有廣泛的生物活性，可以加速骨吸收，促進(jìn)骨相關(guān)細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可以增強(qiáng)破骨細(xì)胞的增殖和分化，影響骨吸收[25-33]。本研究中，OVX組TNF-α較對(duì)照組顯著升高（P < 0.01）；IL-10組TNF-α較OVX組則顯著降低（P < 0.05）。原因很可能是由于IL-1β、IL-6誘導(dǎo)破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，骨破壞所釋放的產(chǎn)物激活巨噬細(xì)胞，從而產(chǎn)生更多的TNF-α；當(dāng)IL-1β、IL-6被抑制后，TNF-α水平相應(yīng)減少。

綜上所述，IL-10對(duì)IL-1β、IL-6以及TNF-α有明顯的抑制作用，使破骨細(xì)胞的破骨作用下降，從而使骨重吸收減少，抑制了骨質(zhì)疏松的嚴(yán)重程度，這對(duì)臨床上治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2016-12-15 本文編輯：程 銘）