過氧化物酶體增殖物激活受體—γ激動(dòng)劑對(duì)急性胰腺炎大鼠核轉(zhuǎn)錄因子—κB/Toll樣受體4通路的調(diào)節(jié)及腎損傷的保護(hù)

陸貝　于源泉　殷俊杰　蔡陽

[摘要] 目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體-γ激動(dòng)劑對(duì)急性胰腺炎大鼠核轉(zhuǎn)錄因子-κB/Toll樣受體4通路的調(diào)節(jié)以及腎損傷的保護(hù)作用。 方法 選擇72只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（SO組）、模型組（SAP組）和羅格列酮組（ROSI組），各組再隨機(jī)分為術(shù)后6 h、12 h、24 h組，每組8只。SAP組采用兩次腹腔注射L-精氨酸制備SAP模型，ROSI組30 min后股靜脈注射10%羅格列酮溶液6 mg/kg，SO組腹腔注射等體積生理鹽水。觀察大鼠腎臟病理改變，測(cè)定腎臟TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平，檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β、IL-6、BUN、Cr含量。 結(jié)果 ROSI組大鼠腎小管細(xì)胞病理損害較SAP組減輕；與SAP組比較，腎組織內(nèi)NF-κB、TLR4蛋白明顯下降（P<0.05）；ROSI組外周血IL-1β、IL-6、TNF-α和BUN、Cr含量與SAP組比較明顯下降（P<0.05）。 結(jié)論 PPAR-γ激動(dòng)劑羅格列酮能減輕急性胰腺炎大鼠腎小管上皮細(xì)胞的損傷，同時(shí)抑制NF-κB、TLR4蛋白表達(dá)，降低促炎細(xì)胞因子水平，推測(cè)PPAR-γ激動(dòng)劑對(duì)NF-κB/TLR4通路的調(diào)節(jié)可能是胰腺炎的保護(hù)機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 急性胰腺炎；過氧化物酶體增殖物激活受體；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；Toll樣受體

[中圖分類號(hào)] R576 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）34-0031-04

Regulation of nuclear factor-κB/Toll-like receptor 4 pathway and protection of renal injury in rats with acute pancreatitis by peroxisome proliferator activated receptor-γ agonist

LU Bei1 YU Yuanquan2 YIN Junjie1 CAI Yang1

1.Department of Hepatobiliary Surgery， Hangzhou First People's Hospital， Hangzhou 310006， China； 2.Department of Hepatobiliary Surgery， the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310009， China

[Abstract] Objective To investigate the regulation of nuclear factor-κB/toll-like receptor 4 pathway and protection of renal injury in rats with acute pancreatitis by peroxisome proliferator activated receptor-γ agonist. Methods 72 SD rats were randomly divided into sham operation group（SO group）， model group（SAP group） and rosiglitazone group（ROSI group）. The rats in each group were further randomly divided into postoperative 6 h， 12 h and 24 h group， with 8 rats in each group. In the SAP group， SAP model was prepared by intraperitoneal injection of L-arginine twice. In ROSI group， 6 mg/kg of 10% rosiglitazone solution was intravenously injected after 30 min. In the SO group， equal volume of normal saline was injected intraperitoneally. The pathological changes of rat's kidney was observed. The expression levels of TLR4 and NF-κB in kidneys were measured. The levels of TNF-α， IL-1β， IL-6， BUN and Cr in serum were measured. Results The pathological damage of renal tubular cells in ROSI group was less than that in SAP group. Compared with SAP group， the expressions of NF-κB and TLR4 in renal tissue were significantly decreased（P<0.05）； the levels of IL-1β， IL-6， TNF-α， BUN and Cr in ROSI group were significantly lower than those in SAP group（P<0.05）. Conclusion Rosiglitazone， a PPAR-γ agonist， attenuates the injury of renal tubular epithelial cells in rats with acute pancreatitis， inhibits the expression of NF-κB and TLR4 proteins and decreases the level of pro-inflammatory cytokines. It is speculated that the regulation of NF-κB/TLR4 pathway by PPAR-γ agonists may be one of the protective mechanisms of pancreatitis.

[Key words] Acute pancreatitis； Peroxisome proliferator-activated receptors； Nuclear transcription factor-κB； Toll-like receptors

急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）炎癥細(xì)胞因子的過量產(chǎn)生可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）和多器官功能不全（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）。核轉(zhuǎn)錄因子-κBp65（nuclear transcription factor-κBp65，NF-κBp65）是AP炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的上游靶點(diǎn)，在SIRS、MODS環(huán)節(jié)中起信使作用，而過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPAR-γ）激動(dòng)劑是細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，因此PPAR-γ激動(dòng)劑可能通過抑制NF-κB活化控制AP，減輕腎臟等胰外器官損害[1，2]。本實(shí)驗(yàn)觀察羅格列酮對(duì)AP大鼠腎臟損害、NF-κBp65、Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）的影響，探討PPAR-γ激動(dòng)劑與NF-κBp65/TLR4信號(hào)通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料

選擇雄性清潔級(jí)SD大鼠72只，質(zhì)量272～325 g，浙江省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購入。L-精氨酸、戊巴比妥鈉針購自Sigma公司（Sigma，USA），羅格列酮購自Cayman公司（Cayman，USA），Bax、Bcl-2、NF-κB、TLR4單克隆抗體購自Santa公司（Santa Cruz，USA），TUNEL試劑盒購自Takara公司（Takara，Japan）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 72只大鼠分為SAP模型組（SAP組，n=24）、羅格列酮組（ROSI組，n=24）、假手術(shù)組（SO組，n=24），各組再隨機(jī)分為術(shù)后6 h、12 h、24 h組，每組8只。大鼠腹腔內(nèi)注射2.5%戊巴比妥鈉0.2 mL/100 g麻醉，股靜脈插管用微泵持續(xù)輸液。SAP組：腹腔兩次注射法建立大鼠SAP模型：先后兩次（間隔1 h）向腹腔內(nèi)注射L-精氨酸2.0 g/kg、濃度20 g/L即完成SAP制模。SO組：僅向腹腔內(nèi)兩次注射等體積生理鹽水。ROSI組：造模SAP成功后30 min，經(jīng)股靜脈注射10%羅格列酮溶液6 mg/kg，術(shù)后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)剖殺。

1.2.2 腎臟組織病理 大鼠剖殺后取腎臟組織以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色后光鏡下觀察。

1.2.3 腎臟TLR4、NF-κBp65分子檢測(cè) 采用免疫組化法和免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)TLR4和NF-κBp65蛋白的表達(dá)，具體操作參照TLR4和NF-κBp65檢測(cè)試劑盒說明書。結(jié)果判定：光鏡下觀察，以胞質(zhì)出現(xiàn)黃染為陽性細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)視野利用圖像分析系統(tǒng)分析目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度比值，計(jì)算相對(duì)含量，以陽性單位（positive unit）PU值大小定量[3]。

1.2.4 血清生化指標(biāo) 心臟采血后，使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（interieukin-1β，IL-1β）、IL-6白細(xì)胞介素6（interieukin-6，IL-6）、尿素氮（blood urea nitrogen， BUN）、肌酐（creatinine，Cr）的含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，其中計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析及SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組腎臟組織病理改變比較

SO組腎組織大體及鏡下形態(tài)大都正常無變化，見圖1。SAP組術(shù)后6 h腎臟充血腫脹，色澤晦暗，24 h可見灰色或紫色斑塊；鏡下12 h腎小球淤血腫脹，腎小管水腫變性，可見腎小管上皮壞死，間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見圖2。ROSI組術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)腎臟大體和鏡下的改變均較SAP組不同程度減輕，見圖3。

2.2 三組腎臟TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平比較

與SO組比較，SAP組術(shù)后6 h腎小管上皮細(xì)胞TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）。與SAP組比較，ROSI組TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），見表1。

2.3 三組血清炎癥細(xì)胞因子含量比較

SAP組血清炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6指標(biāo)含量術(shù)后6 h開始上升，24 h達(dá)到高峰。ROSI組各指標(biāo)含量隨時(shí)間延長(zhǎng)不同程度升高，與SAP組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.4三組血清腎功能指標(biāo)比較

SAP組血清BUN、Cr含量術(shù)后逐漸升高，ROSI組與SAP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

3討論

SAP引起急性腎損害的機(jī)制很多，有學(xué)者認(rèn)為SAP時(shí)大量活化的胰酶釋放入血，并通過引起腎臟血流動(dòng)力學(xué)的異常、微循環(huán)障礙、炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子的作用引起腎小管細(xì)胞損傷壞死。同時(shí)SAP時(shí)低血容量性休克、血液灌注不良、缺氧、缺血再灌注損傷等引起的腎臟微循環(huán)障礙進(jìn)一步加重腎損傷[4，5]。胰外器官損害中腎功能不全發(fā)生率僅次于肺功能損害，約占14%～43%，如發(fā)展為急性腎功能衰竭，病死率高達(dá)80%，是SAP常見的致死原因之一[6]。2003年Hashimoto等[2]發(fā)現(xiàn)對(duì)AP實(shí)驗(yàn)大鼠使用PPAR-γ激動(dòng)劑15 d-PGJ2后，大鼠血液和胰腺組織中環(huán)氧合酶-2（COX-2）、ICAM-1、IL-6表達(dá)下調(diào)，NF-κB活性下降，胰腺組織病理學(xué)改變明顯減輕，第一次在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物層面證明PPAR-γ激動(dòng)劑可能是AP的治療靶點(diǎn)。PPAR-γ是細(xì)胞增殖和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程，抗炎作用廣泛而強(qiáng)大，包括抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌及ICAM-1、NF-κB的表達(dá)等。其中PPAR-γ對(duì)NF-κB的調(diào)節(jié)是通過抑制IκB的降解、促使NF-κB活性下調(diào)而實(shí)現(xiàn)[7-11]，但國內(nèi)外關(guān)于PPAR-γ與NF-κB相關(guān)性的研究并不多。

本實(shí)驗(yàn)中ROSI組造模后30 min股靜脈注射10%羅格列酮，與SAP組比較腎損傷病理有明顯改善，腎臟組織NF-κB、TLR4活性下降（P<0.05），外周血IL-1β、IL-6、TNF-α等含量下調(diào)（P<0.05），且BUN、Cr水平明顯下降（P<0.05），表明羅格列酮對(duì)NF-κB/TLR4信號(hào)通路有明顯的抑制作用，提示PPAR-γ激動(dòng)劑可能通過抑制NF-κB/TLR4信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化，下調(diào)促炎細(xì)胞因子表達(dá)。有學(xué)者在SAP造模前注射羅格列酮，發(fā)現(xiàn)羅格列酮通過抑制NF-κB的表達(dá)，減少TNF-α和ICAM-1的產(chǎn)生，減輕SAP致腎損傷的發(fā)生發(fā)展[6]，結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)一致。羅格列酮是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的噻唑烷二酮類藥物，它是高選擇性PPAR-γ激動(dòng)劑。研究表明羅格列酮在諸多器官、系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)中均發(fā)揮著一定的抗炎作用，其抗炎作用獨(dú)立于胰島素增敏及誘導(dǎo)細(xì)胞分化等作用之外[12-21]。

本研究結(jié)果進(jìn)一步揭示羅格列酮的抗炎作用參與其對(duì)SAP腎損傷的保護(hù)機(jī)制。PPAR-γ具有轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制作用，羅格列酮作為其激動(dòng)劑和配體，能作用于NF-κB/TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，抑制細(xì)胞因子的基因表達(dá)，發(fā)揮其抗炎作用，并減輕SAP所致的腎損傷，可能為SAP腎損傷提供新的治療前景。

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（收稿日期：2016-09-23）